Name: fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog
Uploaded: 2014-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog at JoVE.com

This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

1. PAD4 변환, 발현, 및 정제 <ol><li> PAD4 변환의 경우, 화학적으로 유능한 E. PAD4의 GST 융합을 포함하는 플라스미드를 pGEX 변환 다음 절차를 사용하여 단백질 발현 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. 화학적 유능한 (염화 칼슘)를 준비 E. 표준 프로토콜에 따라 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. <ol><li> 미리 제조 한 화학적 유능한 BL21 (DE3) 세포를 얼음에 50㎕의 해동 및 5 ㎖의 배양 관에 PAD4 유전자를 포함하는 플라스미드를 pGEX 1 μL와 혼합한다. 부드럽게 매 2 분 흔들어 섞으면 서 10 분 동안 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 열은 40 초 동안 42 ° C의 물을 용기에 혼합물을 배치하여 셀을 충격. 즉시 세포가 복구 할 수 있도록 2 분 동안 다시 얼음에 세포 플라스미드 혼합물을 배치합니다. 혼합물에 멸균 된 LB 액체 배지 1 ㎖를 추가하고 1 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 1 250 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 세포 충격 열을 품어시간. 피펫 (75) 암피실린 내성 한천 접시에 형질 전환 세포의 μL, 15 시간 동안 37 ° C에서 품어. 4 ℃에서 보관 판. </li></ol></li><li> PAD4 식입니다. <ol><li> 1x를 앰피 실린을 함유하는 LB 5 ml의 암피실린 한천 플레이트와 장소에서 BL21 (DE3) 세포의 콜로니 하나를 선택. 인큐베이터에 넣어 37 ℃에서 O / N를 흔들. </li><li> 1x를 암피실린 수화물을 함유하는 멸균 LB (MW 403.45 g / mol)를 1 L로 LB (스타터)의 5 ml의 전송. 37 ° C 진탕 배양기에 넣어 성장. 성장의 OD (600)를 모니터링합니다. 성장 (600) 0.3의 OD에 도달하면, 인큐베이터을 흔들어 16 ° C로 성장 이동합니다. </li><li> OD 0.6 600 0.3 밀리미터 isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238.30 g / mol)을 가진 세포를 유도 도달하면. 세포가 16 ℃에서 15 시간 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 0 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. -80 ° C에서 상등액 및 저장 펠렛을 붓고. </li></ol></li><li> PAD4 정화 <ol><li> 다시 일시의 50 mM의 NaCl (MW 58.44 g / 몰)의 버퍼에 세포를 BL21 (DE3)에서 발현 PAD4 함유 펠렛을 300 mM의의 NaH 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol)을 10 mM의 이미 다졸 (MW 68.077 g / 몰), 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / 몰)의 pH = 8.0. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 초음파 처리 후, 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리. 붓고 및 상층 액을 저장합니다. 일괄 RT에서 30 분 동안 글루타치온 (GSH), 아가 로스 비드와 상청. </li><li> 중력을 통해 GST 비즈 / 열에서 상층 액을 배출합니다. 실온에서 1X PBS (인산염 완충 식염수, pH는 8.0)의 4 × 25 ml로 구슬을 씻으십시오. </li><li> 용출 PAD4 2 × 10 ml의 용출 버퍼와, 50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / mol)을 10 mM의 글루타치온 (GSH, MW 307.32 g / 몰), pH가 8.0. </li><li> 10 만 MW 컷-O를 사용하여 PAD4을 집중FF 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에. -80 ° C에서 나누어지는 1.0 ml의 마이크로 원심 튜브에 200 μL의 볼륨으로 단백질 및 저장. </li></ol></li></ol> 버퍼 2. 준비 원액 <ol><li> 염화나트륨 (NaCl을, MW 58.44 g / 몰) 칭량하고 2 M 용액을 제조 하였다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / 몰) 밖으로 달아 = 8.0 2 M 용액의 pH를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 염화칼슘 이수화 물 (CaCl2를 2H 2 O, MW 147.01 g / 몰) 칭량하고 500 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP, MW 250.19 g / 몰) 칭량하고 200 mM의 용액을 조제. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 디티 오 트레이 톨 (DTT, MW 154.25 g / 몰) 밖으로 무게와 1 M 용액을 제조. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 준비트리톤 X-100의 0.5 % 용액. </li><li> 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, MW 292.24 g / 몰) 칭량하고 100 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다. </li><li> 염산염 (ZRcoum, MW 621.69 g / mol)의 methylcoumarin Z- Arg- Arg- 7- amido- 4-을 달아 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 mM의 용액을 조제. </li></ol> 37 ° C에서 3 PAD4 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 염화칼슘 2, 6.25 mM의 DTT (PH = 8.0)의 버퍼를 준비합니다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 혼합하고 -20 ℃에 저장° C. 이 솔루션 D.됩니다 </li><li> 96 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물의 수 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)를 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 160 μL에 솔루션 B의 160 μL. 37 ° C에서 15 분 동안 품어. </li><li> 피펫 (40) 모든 우물에 솔루션의 μL와 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어, 피펫 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션 D. 용액 10 μL의 다른 절반. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> RT 4. PAD4 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 50 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 50 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 나 버퍼를 준비CL, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100, 8 μM의 PAD4 (pH가 = 8.0). 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 D.됩니다 </li><li> 384 웰 플레이트를 취득 및 제어 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)에 대한 우물을 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 25 μL에 솔루션 B의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다. </li><li> 모든 우물에 솔루션 C의 피펫 25 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어의 다른 절반에 pipett실온에서 10 분 동안 솔루션 D. 품어의 전자 10 μL. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 37 ° C 및 실온에서 5 PAD4 시간 코스 분석 실험 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> (얼마나 많은 시점에 따라 달라집니다 우물 #)이 96 웰 플레이트 및 피펫 우물 # 금액에 솔루션 B의 160 μl를 얻습니다. </li><li> 37 ° C에서 한 96 웰 플레이트를 품어. RT에서 다른 96 웰 플레이트를 품어. </li><li> 삐악 삐악 울다ette 즉시 (40) 모두 96 웰 플레이트의 모든 우물에 솔루션의 μL과는 t = 0 분 우물에 솔루션 C의 10 μl를 피펫. 모든 우물이 침묵 할 때까지 특정 시점에서 솔루션 C의 10 μl를 계속 추가합니다. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 실온에서 6 PAD4 저해 분석 <ol><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 83 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 83 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 된 C1-아미 딘 (MW 424.8 g / 몰) 칭량하고 100 μM 스톡 용액을 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100의 완충액, 8 μM의 PAD4 (하여 pH = 8.0)을 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 목솔루션 D. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 E. 될 것입니다 </li><li> 384 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물 (NO PAD4), 시험 우물 (+ PAD4) 및 억제 우물 (PAD4 + CL-아미 딘)을 지정합니다. </li><li> 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 D의 25 μL에 솔루션 C의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다. </li><li> 억제의 우물에 솔루션 B의 피펫 10 μL 및 RTE에서 20 분 동안 품어. </li><li> 모든 우물에 솔루션의 피펫 15 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 피펫 모든 우물에 솔루션 E의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol> 7. 원유 세포 용 해물 분석RT에서 <ol><li> 50 mM 트리스, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / mol)을, pH를 10 ㎖의 PAD4 1 L 성장에서 재현 탁 된 세포를 세포를 수확 한 후 = 8.0. </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리기. 10 만 MW 차단 원심 분리기 튜브를 사용하여 4 ° C에서 4,000 rpm으로 원심 분리하여 절반 볼륨에 맑은 상층 액을 집중한다. </li><li> 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 250 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 250 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다 </li><li> 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다 </li><li> (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다 </li><li> 블랙 384 웰 플레이트 및 설계를 얻컨트롤 (NO 세포 용 해물) 및 테스트 우물 (+ 세포 용 해물)에 대한 우물을 먹었다. </li><li> 피펫 시험의 우물에 모든 우물과 세포 용 해물의 피펫 60 μL에 B 액 100 ㎕. 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 모든 우물에 솔루션의 피펫 40 μL와 실온에서 45 분 동안 품어. </li><li> 피펫 모든 우물에 솔루션 C의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션. </li><li> 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다. </li></ol>

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Commun. 3, 676 (2012).</li><li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+induction+of+microRNA-16+in+colon+cancer+cells+by+protein+arginine+deiminase+inhibition+causes+a+p53-dependent+cell+cycle+arrest.">The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest.</a> PLos One. 8, (2013).</li><li>Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4+(PAD4):+Current+understanding+and+future+therapeutic+potential.">Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential.</a> Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53+target+gene+expression+by+peptidylarginine+deiminase+4.">Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4.</a> Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+peptidylarginine+deiminase+(PAD)+inhibitors+regulate+the+autophagy+flux+and+the+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+activity.">Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity.</a> J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).</li><li>Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+deiminase+4:+a+target+for+an+epigenetic+cancer+therapy.">Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy.</a> Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).</li><li>Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluoroacetamidine-based+inactivator+of+protein+arginine+deiminase+4:+design,+synthesis,+and+in+vitro+and+in+vivo+evaluation.">A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+kinetic+studies+of+PADs.">Substrate specificity and kinetic studies of PADs.</a> Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).</li><li>Knipp, M., Vasak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+colorimetric+96-well+microtiter+plate+assay+for+the+determination+of+enzymatically+formed+citrulline.">A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline.</a> Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).</li><li>Knuckley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluopol-ABPP+HTS+assay+to+identify+PAD+inhibitors.">A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors.</a> Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).</li><li>Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+citrulline:+development+of+a+phenylglyoxal-based+probe+to+visualize+protein+citrullination.">Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).</li><li>Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+protein+arginine+deiminase+activity+by+using+fluorescence+quenching:+multicolor+visualization+of+citrullination.">Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).</li><li>Jones, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+screening+of+a+haloacetamidine+containing+library+to+identify+PAD4+selective+inhibitors.">Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors.</a> ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).</li><li>Dreyton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).</li><li>Shimoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deimination+stabilizes+histone+H2A/H2B+dimers+as+revealed+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul...

포유 동물 단백질의 다수 무겁게 리보솜에 의한 단백질의 생합성 다음 효소의 작용에 의해 변성된다. 이러한 번역 후 변형 (PTMS)는 크게 단백질 1-3 (다른 기능 사이)의 크기, 전하, 구조 및 올리고머 상태를 변경하여 프로테옴의 기능적 다양성을 증가시킬 수있다. 그 결과, 단백질 구조의 변화는 단백질 분해, 세포 분화, 시그널링, 유전자 발현의 조절, 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 같은 생리 학적 결과로 이어질 수있다. 이러한 수정은 인간의 모든 단백질의 큰 비율에 널리 퍼져 있지만 히스톤 단백질이 공유 수정 4의 비정상적으로 높은 숫자를 받아야에 터미널이 종료됩니다. 히스톤 단백질은 게놈 DNA의 응축을 촉진 구조 단백질의 패밀리이다. 구조화되지 않은 히스톤 꼬리의 공유 수정 세리 의해 수행 및 규제, 잔류 (작가)의 공유 변형을 촉진 같은 수정 (지우개), 역 및 변경을 구별 할 수 효소의 S는 히스톤 꼬리 (독자) 5-7에 각인된다. 실제로, 공지 PTMS 대부분 메틸화, 인산화, 아세틸, sumoylation, 유비퀴틴 및 citrullination 8 포함한 히스톤이 짧은 세그먼트 내에서 관찰 할 수있다. Citrullination는 비 t의 RNA 부호화 펩 티딜 - 시트룰린 (도 1a)에 펩 티딜 - 아르기닌의 변환을 수반한다. 이 측쇄 중화에 책임 단백질, PAD의 구성원 칼슘 의존적 효소이다 모두. 9,10이 단백질 군 (p는 rginine d를 eiminase eptide)를. 현재까지, 패드 가족의 다섯 멤버는 (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 및 PAD6)를 설명 하였다. 이 가족의 각 구성원은 별개의 세포 단백질을 대상으로 나타나고 또한 유니 표시가야 조직 분포 프로필. PAD4 핵 지역화 시퀀스 (11)를 통해 핵 내에서 지역화 된 것으로 알려진이 단백질 가족의 유일한 구성원입니다. 따라서,이 히스톤의 H2A 아르기닌 잔기 (3)의 N 말단 꼬리에서 아르기닌 측쇄 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 및 H3R26) 및 H4 (H4R3) (12)를 포함하여 핵 대상 번호를 deiminate 것으로 밝혀졌다, 13. PAD 동위 효소의 각 특정 중요한 생리 기능을 가지고 있지만, PAD4 인해 병에 걸린와 건강한 세포 모두에서 인간의 프로세스의 수의 역할에 훨씬 더 많은 관심을 받고있다. 최근 PAD4가 능성 전사 네트워크 (14)의 구성원이 될 것으로 나타났다. 두 PAD4 발현 수준과 활성 마우스에서 리 프로그래밍 및 접지 상태 능성 상태 동안 상승되는 것으로 도시 하였다. 줄기 세포 유전자의 조절을 제어함으로써, PAD4 세포 리 프로그래밍 효율의 중추적 인 역할을 유지할 수있다. PAD4도에 연루되었는지에 병원균의 결합 호중구 세포 트랩의 형성은 자신의 시스템 정리를 할 수 있습니다. PAD4 의한 히스톤 단백질의 hypercitrullination 따라서 세균 감염 15,16 떨어져 병동, 트랩에 의한 세포 외 병원균의 캡슐화 용 기재로서 기능 염색질의 decondensation을 유도한다. 또한 PAD4 인간 질병의 수가 활성 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 것은 이미 PAD4의 비정상적 발현은 류마티스 관절염의 발병과 중증도와 연관되어 있음을 보여왔다, 알쯔하이머, ​​파킨슨 병 및 다발성 경화증 17. 실제로, 안티 - 시트룰린 단백질 항체의 존재는 류마티스 관절염 (18)의 가장 안전하고 확실한 진단 및 예후 바이오 마커이다. 마찬가지로, 조절 곤란 PAD4 활성은 최근 난소, 유방, 폐, 포함한 인간 암의 다수 관찰되었다D 식도암 19-22. PAD4과 암 사이의 링크는 p53 종양 억제 단백질 22, 23 ELK1 종양 유전자를 통해 또는 통해 매개되는 것으로 나타났다 이전 작업은 PAD4가 새로운 항암 치료 표적 17,24,25이 될 수 있다고 제안했다. 원리 연구의 증거로, 대장 암 세포주 HCT116에 shRNA를 통해 PAD4의 고갈은 세포 사멸과 세포주기 정지 (26)을 유도하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. 최근에 개발 돌이킬 수 PAD4 억제제 쥐 27 종양 질량의 70 % 감소되었다. 아주 현저하게, PAD4 억제는 변형되지 않은 세포를 살려주는 동안 암 세포를 선택적으로 죽이는 결과 표적 치료의 역할을 한 것으로 보입니다. PAD4의 기능을 해제하는 작은 분자의 사용은 암 세포를 대상으로 또는 기존의 암 화학 요법 (28)을 증가시키기 위해 강력하고 새로운 전략으로 증명할 수 있습니다. 불행하게도, 포십t 가역 PAD4 억제제는 아직 발견해야합니다. 공유 억제제의 수는 아르기닌 기판 27,29,30 모방 건강 및 질병 상태 모두에서 세포 PAD4의 역할을 이해하는데 실질적인 도구적일 수 클로로 / 플루오 imidine 핸들을 사용하여 개발되어왔다. 그러나, 이들 분자는 유사한 효능을 가진 활성 패드 모두 억제한다. 따라서 PAD4의 활성에 대해보고 용이 한 분석에 대한 필요성이 매우 중요하다. 현재까지 PAD4 분석법 비색 판독 31 반응으로부터 암모니아의 방출을 연결하는 설명되었지만, 형광 편광 분석법 (32) 형광 표지 chloroamidine 기질 유사체를 이용하는 글리 옥살과 시트룰린 (33) 사이의 산 - 보조 반응에 의존하고, 몇 단계 34 dequenching 형광에 PAD4 활동. 이들 중에서, 단지 공유 개질제 haloacetamidine 전략은 높은 처리량 scre와 호환되도록 입증개로 인한 플랫폼 32,35,36. 우리는 확실 PAD4의 활성을 측정 손쉬운 형광 계 분석을 설명한다. 강한 신호 대 잡음비, 분석 속도 및 측정의 견고성을 표시 분석은, 진정으로 강력하고 선택 PAD4 억제제를 발견 할 가능성이있다.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)</td><td>Amresco</td><td>J106-2KG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.amresco-inc.com/&quot;&gt;http://www.amresco-inc.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP902-25&amp;nbsp;</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com/&quot;&gt;http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Isopropylthiagalactonse (IPTG)</td><td>Life Technogolies</td><td>15529-019</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lifetechnologies.com/&quot;&gt;http://www.lifetechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>All Buffer Salts&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.</td></tr><tr><td>Protino Glutathione (GSH) agarose&amp;nbsp;</td><td>Machery-Nagel</td><td>745500.10</td><td>Store at 4 &amp;deg;C; http://www.mn-net.com/</td></tr><tr><td>Chloroamidine&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemical&amp;nbsp;</td><td>10599</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384)</td><td></td><td></td><td>Purchase from Corning; Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.tecan.com/&quot;&gt;www.tecan.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.perkinelmer.com/&quot;&gt;http://www.perkinelmer.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

fluorescence-based monitoring of pad4 activity via a pro-fluorescence substrate analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

처음에, 그것은 ZRcoum는 96- 웰 플레이트 형식으로 PAD4의 활성에보고 할 수 있음을 입증 하였다. 웰은 상기 기판과 함께 ZRcoum PAD4의 존재 / 부재 하에서 배양 하였다. 15분의 475 nm의 필터 (도 2A) - 37 ° C에서 45 분의 인큐베이션 기간 후, 형광 40분의 340로 측정 하였다. 예상 한 바와 같이, 형광 레벨은 ZRcoum (또는 시트룰린 ZRcoum) 내의 형광 ?...

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Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.8K 조회수.  Lehigh University. PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

비디오: Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and biochemically verified was opsin, the apoprotein of the photoreceptor rhodopsin. Rhodopsin is a G protein-coupled receptor localized in rod photoreceptor disc membranes of the retina where it is responsible for the perception of light. Rhodopsin&#39;s scramblase activity does not depend on its ligand 11-cis-retinal, i.e., the apoprotein opsin is also active as a scramblase. Although constitutive and regulated phospholipid scrambling play an important role in cell physiology, only a few phospholipid scramblases have been identified so far besides opsin. Here we describe a fluorescence-based assay of opsin&#39;s scramblase activity. Opsin is reconstituted into large unilamellar liposomes composed of phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and a trace quantity of fluorescent NBD-labeled PC (1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine). Scramblase activity is determined by measuring the extent to which NBD-PC molecules located in the inner leaflet of the vesicle are able to access the outer leaflet where their fluorescence is chemically eliminated by a reducing agent that cannot cross the membrane. The methods we describe have general applicability and can be used to identify and characterize scramblase activities of other membrane proteins.

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

연구

생화학

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

생물학

<meta charset="utf8"></head><body>내피 세포에서 프로테아제 활성화 수용체 리간드 연구

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding dyes and imaging instruments that can measure fluorescent emissions from up to 1,536 wells simultaneously. However, these instruments are much more expensive and can be challenging to maintain relative to widely available plate readers that scan wells individually. Described here is an optimized plate reader assay for use with an endothelial cell line (EA.hy926) to measure the protease-activated receptor (PAR)-driven activation of G&#945;q signaling and subsequent calcium mobilization using the calcium-binding dye Fluo-4. This assay has been used to characterize a range of PAR ligands, including the allosteric PAR1-targeting anti-inflammatory "parmodulin" ligands identified in the Dockendorff lab. This protocol obviates the need for an automated liquid handler and permits the medium-throughput screening of PAR ligands in 96-well plates and should be applicable to the study of other receptors that initiate calcium mobilization.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 염증 조절을 위한 프로테아제 활성화 수용체를 표적으로 하는 파모듈린 개발

An improved protocol for a calcium mobilization assay with endothelial cells, used to identify ligands of protease-activated receptors (PARs), has been developed. The new protocol reduces total assay time by 90-120 min and yields reproducible concentration-response curves.

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader(플레이트 리더를 사용한 칼슘 동원 분석으로 프로테아제 활성화 수용체의 조절인자 특성 분석)

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

요약

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인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader(플레이트 리더를 사용한 칼슘 동원 분석으로 프로테아제 활성화 수용체의 조절인자 특성 분석)

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader(플레이트 리더를 사용한 칼슘 동원 분석으로 프로테아제 활성화 수용체의 조절인자 특성 분석)

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader(플레이트 리더를 사용한 칼슘 동원 분석으로 프로테아제 활성화 수용체의 조절인자 특성 분석)

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화