This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).

1. 일반 내피 세포 배양 <ol><li> 문화 소 대동맥 내피 세포 젤라틴 코팅 조직 배양 플라스크에 (통로 4-9) (코트 조직 문화 표면을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 / V 젤라틴 w 0.1 %)와 EGM-2 총알 EGM-2 미디어 ( 5 % 소 태아 혈청, 성장 인자 및 하이드로 코르티손을 제외하고 제조업체에서 제공하는 모든 보조제)를 포함하는 키트. </li><li> / PBS에서 EDTA V 37 ° C에서 w 0.05 % w / v 인 트립신 / 0.02 %로 처리하여 수확 세포 : 세포가 거의 합류 아르 (4 분할 약 삼일 포스트 파종 한 후). 대부분의 세포가 분리 한 후, 트립신 다음 원심 분리기 (100 XG, 5 분)을 해소하기 위해 전체 EGM-2 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 이 기판에 설립 부착 (실험 2 : 3 절)와 내피 세포의 후속 탈 부착 : 피브로넥틴에 내피 세포의 드 노보 부착에 관한 연구 (제 2 실험 1)에 대한 세포를 준비합니다. <ol><li> 세척 수확일단 무 혈청 배지 199 / V 소 혈청 알부민 (BSA)과 다시 원심 분리기 (100 XG, 5 분) 1 W %를 함유하는 세포와. </li><li> w 혈청 배지 (199) 함유 1 %에서 셀을 다시 중지 / BSA V에서 2.5 × 105 세포 / ㎖ (세포 기질 임피던스 측정) 또는 5 × 105 세포 / ㎖ (생균 영상 분석) 및 37 ℃에서 유지 사용하기 전에 ° C. 주 : 세포 부착 반응 그래서 다음 프로토콜 동안 세포를 처리하고 치료하는 데 사용되는 모든 장치 및 솔루션은 37 ° C의 일정 온도로 유지되어야한다 (의한 대류 효과, 예) 온도 차이에 매우 민감하다. </li></ol></li></ol> 2. 실험 1 : 기본 및 MPO 산화 피브로넥틴 (셀 기판 임피던스)에 정량화 드 노보 내피 세포 부착 참고 실험 1 정도를 검사하는 MPO 매개하는 피브로넥틴 산화 드 노보을 지원하는 능력을 손상 </em&gt; 정지 내피 세포의 부착. <ol><li> 96 웰 금 전지 기판 임피던스 미세 전극 어레이 상에 코트 피브로넥틴. PBS에 5 ㎍ / ㎖의 80 μL / 웰의 정제 소 피브로넥틴을 추가, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양 및 솔루션을 제거합니다. </li><li> 표면 결합 피브로넥틴 MPO의 결합을 허용하는 MPO와 피브로넥틴 코팅 된 표면을 품어. 80 μL / 정제 된 인간 호중구 MPO의 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)의 20 nm에서하고 37 ℃에서 0.5 시간 동안 품어 추가합니다. </li><li> 워시는 언 바운드 MPO를 제거하는 HBSS로 두 번 표면. </li><li> 개시하기 위해 80 μL / 웰의 HBSS를 함유하는 미세 전극 배열 판의 웰에 H 2 O 2 (0-10 μM 최종 농도)를 첨가의 HOCl 의존 피브로넥틴 산화, MPO를 촉매 작용하고, 37 ℃에서 또 다른 0.5 시간 동안 배양한다. </li><li> 관련 억제제 또는 MPO - 촉매 반응 조절제 (예를 들어, 대안 MPO 효소의 효과를 검토기질, 효소 저해제 또는 항산화 제; ) 자세한 내용은 9 참조, H 2 O 2 첨가하기 직전 HBSS에 추가 할. </li><li> 0.5 시간 후, 잔류 표면 결합 된 산화 종을 해소하기 위해 메티오닌과 표면 처리, 혼란 세포 활성을 발휘 할 수 있습니다 즉, 반응성 단백 결합 된 클로라민을. 물론 당 80 μl의 HBSS에 10 mM의 메티오닌을 추가하고 37 ° C에서 10 분 동안 품어. </li><li> 블록 BSA와 표면. 추가 80 μL / 잘 BSA의에서 PBS에서 V, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 용액을 제거 / w 0.2 %. 주 : 잔존 코팅면 영역은 세포 접착을 지원하고 비 접착 단백질 (예, BSA) 이러한 차단한다 세포 부착 반응 엄격이 경우 피브로넥틴에 채용 정제 된 세포 - 부착 성 매트릭스에 의존하는 것을 보장한다. </li><li> 워시 HBSS로 두 번 표면. 참고 : 위의 표면 처리 중에 상당히 셀 기판 읽는데 영향을 미치지 않습니다GS. </li><li> 종자 현탁 내피 세포 (ADD 200 μL / 웰을 약 2.5 × 105 세포 / ml의 무 혈청 배지 (199) 함유 1 % BSA으로 제조 1.3 참조) 네이티브 또는 MPO 산화 피브로넥틴 코팅 표면 상. </li><li> 즉시 세포 (즉, 사전에 어떤 세포 부착 및 퍼짐) 시딩 한 후, (5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에서 수납) 인큐베이터 포트 상에 미세 전극 배열 판을 탑재. <ol><li> 계기 소프트웨어를 사용하는 것은 바로 &#39;블랭크&#39;세포 유착의 부재하에 수득 된 배경에 초기 값 ( &#39;셀 인덱스&#39;) 값을 후속 셀 기판 임피던스 정상화를 가지고 읽기. </li><li> 연속 셀 인덱스 데이터 (하나의 셀 인덱스 읽기 / 분의 최소)의 인수를 시작합니다. </li></ol></li><li> 2 시간 동안의 시간 기간을 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 한 세포를 최대 세포 부착 및 퍼짐 동안 달성된다; 이 반사되고셀 인덱스 값 plateauing는 (도 3a 참조). 참고 : 위의 실험 (실험 1) 피브로넥틴 초기 MPO - 매개 산화가이 기판 상에 세포 접착을 설정하는 내피 세포의 기능을 제한하는 방법을 살펴 본다. 다음 실험 (실험 2) MPO 매개 피브로넥틴의 산화가이 기판에 설립 접착과 내피 세포에서 세포 - 매트릭스 접착 (즉, 탈 ​​부착)의 감소를 촉진하는 방법을 살펴 본다. 이들 두 실험의 처리는 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 타이밍을 제외하고 본질적으로 동일하다 (세포 접착 전에 즉, - 실험 1] 세포 부착 후 - 실험 예 2). </li></ol> 3. 실험 2 : MPO 매개 피브로넥틴 산화 (셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징)에 대한 응답으로 피브로넥틴 내피 세포 드 접착을 정량화 <ol><li> 96 웰 골드 미세 전극 위에 코트 피브로넥틴라이브 세포 이미징 분석을위한 세포 기판 임피던스 측정을위한 rrays (C를 PBS에 5 ㎍ / ㎖의 80 μL / 잘 피브로넥틴의 추가, 37 ℃에서 2 시간 동안 품어) 또는 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시 (2 ml에 추가 / PBS에 5 μg의 / ㎖에서 피브로넥틴의 요리와 37 ℃에서 2 시간 동안 품어). </li><li> 블록 BSA와 표면. 3.1에 ​​표시된 볼륨에서 PBS에서 V / w 0.2 %에서 BSA를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 피브로넥틴 MPO의 결합을 허용하는 MPO와 표면을 품어. 3.1에 ​​표시된 볼륨에서 HBSS에 20 nM의 정제 인간 MPO를 추가하고 37 ℃에서 0.5 시간 동안 품어. </li><li> 워시는 언 바운드 MPO를 제거하는 HBSS로 두 번 표면. </li><li> 네이티브 또는 MPO는 베어링 피브로넥틴 코팅 된 표면에 (참조 1.3 혈청 / BSA 브이 승 1 %를 포함 199 중간에서 제조) 씨 중단 내피 세포. <ol><li> 추가 200 μL / 웰의 96 웰 세포 - 기질 임피던스 미세 전극 배열에 2.5 × 105 세포 / ml. </li> &lt;리&gt; 세포 배양 접시를 바닥 35mm 유리에 5 × 10 5 세포 / ml에서 2 ㎖ / 접시를 추가합니다. </li></ol></li><li> 즉시 (즉, 이전의 어떤 세포 부착 및 확산) 세포를 파종 한 후 : <ol><li> 마운트 96 웰 미세 전극 어레이 (5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에서 수납) 셀 기판 임피던스 인큐베이터 포트 상 플레이트와 셀 인덱스 데이터를 연속 수집 (참조, 2.10을 개시 &#39;빈&#39;판독 걸릴 ). </li><li> 전송 35mm 유리 5 % CO 2 존재하에 37 ° C의 배양기에 세포를 배양 접시 바닥. </li></ol></li><li> 최대 세포 부착 및 확산 (참조 2.11) 할 수 있도록 2 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 간단히 96 웰 미세 전극 배열 판 (이 시점에서 일시 정지 셀 인덱스 수치)를 제거 또는 35mm 유리는 37 ° C 배양기에서 세포 배양 접시 바닥, 세포 상층 액을 제거하고 페이지로 예열 (37 ° C) HBSS (볼륨을 추가어 3.1 단계). 주 : 후자는 산화 반응을 방해 산화 종을 포함하는 대신으로 완전한 배양 배지의 산화 반응을 촉매 작용 MPO 공부 때 HBSS가 이용된다. </li><li> 저해제의 효과를 검사 / MPO - 촉매 반응 (선택적인 효소 기질, 효소 억제제 또는 산화 방지제) 또는 세포 신호 전달 억제제의 조절제는 지금 추가 (예를 들면, 40 μM의 blebbistatin는 액토 마이 오신 수축력을 억제하기 위해). </li><li> 즉시 다시 37 ° C 배양기 포트 (이 시점에서 다시 개시된다 셀 인덱스 수치)에 미세 전극 배열 판을 올려 놓거나 35mm 유리는 다시 37 ° C 배양기에 세포 배양 접시 바닥, 그리고 세포에 평형 수 0.5 시간 동안 HBSS. 주 : HBSS에서 0.5 시간 평형화 후, 셀 인덱스 값이 약간 낮은 값으로 안정화; 효소 기질, 효소 및 세포 신호 전달 억제제 또는 항산화 세포를 미리 배양 할 때, 먼저 t을 보장HESE 크게 평형화 후에 얻어진 값에 영향을주지 않는다. </li><li> , MPO가 촉매의 HOCl 의존 피브로넥틴 산화와 탈 부착을 시작합니다. <ol><li> 96 웰 미세 전극 배열 판을 사용하여 셀 임피던스 연구의 경우 : <ol><li> 인큐베이터에서 미세 전극 배열 판을 제거하고 세포 지수 측정을 일시 중지합니다. </li><li> HBSS에 H 2 O 2 (0-10 μM의 최종 농도)를 첨가하고, 부드럽게 반복 피펫으로 혼합한다. </li><li> 즉시, 다시 37 ° C 배양기 포트 상에 미세 전극 배열을 다시 마운트하고 세포 지수 수치의 인수를 다시 시작. </li></ol></li><li> 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시를 사용하여 살아있는 세포 이미징 스터디 : <ol><li> 인큐베이터에서 배양 접시를 제거하고 살아있는 세포 동영상을 녹화하기에 적합 DIC의 광학 63X 물 대물 렌즈가 장착 된 반전 공 초점 현미경의 37 ° C 가열 무대에 탑재합니다. </li><li> 세포에 초점DIC 광학 (; 자세한 내용은, 13 참조 쾰러 조명, 바이어스 지연 및 카메라 오프셋 / 게인)을 최적화 할 수 있습니다. </li><li> DIC 영화를 시작하고 1 분 동안 처리되지 않은 세포의 기준 수치를 기록한다. </li><li> H 2 O 2 (0-10 μM의 최종 농도)를 첨가하고, 부드럽게 반복 피펫으로 혼합한다. 다시 초점 현미경 (필요한 경우) 및 필요한 시간 동안 처리 된 세포의 기록 DIC 영화를 계속한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 및 프리젠 테이션 <ol><li> 셀 기판 임피던스 데이터 <ol><li> 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터 (셀 인덱스 대 시간). </li><li> 셀 드 밀착성 시험 (실험 2 : 제 3)의 경우의 값 MPO 매개 피브로넥틴 산화의 개시 직전에 기록 된 값을 설정하여 데이터를 정규화 한 (즉, 즉시 3.11에서 H 2 O 2의 첨가 이전 .1.1). 참고 :이 상대적으로 보장MPO 매개 피브로넥틴 산화에 의해 유도 된 세포 인덱스 값의 변화는 우물 사이의 절대 셀 인덱스 값에 작은 초기 차이로 숨겨지지 않습니다. <ol><li> 시간에 대한 정규화 된 셀 인덱스 (y 축) (x 축)의 플롯으로서 존재 데이터. </li></ol></li></ol></li><li> (실험 2에서 셀 드 밀착성 시험 : 제 3) 생균 촬상 데이터 <ol><li> DIC 직전에와 표준 이미지 분석 프로그램 (예를 들면, ImageJ에 소프트웨어)에서 MPO 매개 피브로넥틴 산화 개시 후 기록 세포 이미징 영화를 살고 엽니 다. </li><li> 적어도 두 개의 개별 DIC 영화에서 여러 셀을 임의로 선택하여 수동으로 막 에지를 추적하고, 밀폐 된 화소 수를 정량함으로써 순차 프레임 (예를 들면, 1 분 간격)에서의 투영 면적을 측정한다. </li><li> 값을 설정하여 Excel 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터 (시간에 대한 예상 셀 영역) 및 정상화 셀 영역의 데이터는 직전 기록값 1에 MPO 매개 피브로넥틴 산화 개시 (즉, 즉시 3.11.2.3의 H 2 O 2를 첨가하기 이전). </li><li> 시간에 대한 정규화 된 셀 영역 (y 축) (x 축)의 플롯으로서 존재 데이터. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+focal+adhesions+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial focal adhesions and barrier function.</a> J Physiol. 569, 359-366 (2005).</li>
<li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).</li>
<li>Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+extracellular+matrix+and+its+role+in+human+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies.</a> Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).</li>
<li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+transcytosis+of+myeloperoxidase+confers+specificity+to+vascular+ECM+proteins+as+targets+of+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration.</a> J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).</li>
<li>Baldus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+pulmonary+and+vascular+nitrotyrosine+reveals+the+pivotal+role+of+myeloperoxidase+as+a+catalyst+for+tyrosine+nitration+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases.</a> Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).</li>
<li>Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+control+of+endothelial+function+and+dysfunction%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).</li>
<li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-derived+oxidants+selectively+disrupt+the+protein+core+of+the+heparan+sulfate+proteoglycan+perlecan%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan.</a> Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).</li>
<li>Rees, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+subendothelial+matrix+oxidation+by+myeloperoxidase+triggers+myosin+II-dependent+de-adhesion+and+alters+signaling+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells.</a> Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).</li>
<li>Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+real-time+cell+electronic+sensing+%28RT-CES%29+technology+to+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li>
<li>Vissers, M. C., Thomas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypochlorous+acid+disrupts+the+adhesive+properties+of+subendothelial+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix.</a> Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).</li>
<li>Ziv, N. E., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Interference+Contrast+%28DIC%29+Imaging+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Kennett, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+modifies+the+structure+and+function+of+the+extracellular+matrix+proteoglycan+perlecan+by+reaction+with+both+the+protein+core+and+the+heparan+sulfate+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains.</a> Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).</li>
<li>Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+dominates+adhesive+ligand+density+in+regulating+cellular+de-adhesion+and+retraction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics.</a> Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).</li>
<li>Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+subcellular+release+for+studying+the+dynamics+of+cell+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment.</a> Nat Methods. 6, 211-213 (2009).</li>
</ol>

저자는 수 있도록 공개 전혀 없습니다.

세포 부착 및 매트릭스 탈 접착 공정은 셀 기판 임피던스와 생균 분석 이미징을 사용하여 높은 시간 해상도와 실시간으로 정확하게 정량 할 수있다. 종점이 불량 시간 해상도를 제공 세포 부착, 이러한 분석을 통해 실시간 방식은 중요한 이점을 제공한다. 정확하게 높은 시간 해상도와 빠른 탈 부착 반응을 정량화하여, 이러한 분석은에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 방법 형태 응답 행렬 수정?...

세포와 그 주변의 세포 외 기질 간의 안정적인 접착 접촉은 조직의 항상성의 유지 보수를 위해 필요합니다. 예를 들어, 혈관 내 피하 매트릭스 내피 세포 유착은 내피 층의 무결성 및 규제 반투과성 한 혈관 장벽으로서의 기능 항상성을 유지하는데 중요한 역할을한다. 액틴 세포 골격 기계적 중앙 관한 액토 마이 오신의 인장력에 저항하여 세포막의 위치를​​ 결정하는데 중요한 역할을하는 세포 - 매트릭스 계면에서 세포 - 매트릭스 부착 및 접착제 접점 부위에서 매트릭스 분자 접착에 결합된다. 반드시 세포 - 매트릭스 계면에서의 힘의 균형이 급속히 인 사건 변경 셀 매트릭스 밀착성을 변경 세포 외 자극은 &quot;외기 시그널링&quot;의 전달의 결과로, 메카 성 신호 전달 단백질에 의해 &quot;감지&quot;. 이 크로스 토크 내기싸우는 세포 및 주변 세포 외 기질은 세포의 모양, 운동성, 함수, 증식 및 생존을 조절이 중요한 역할을한다. 다양한 병태 생리적 과정 (배아 발달, 염증, 상처 복구 및 암전)은 매트릭스 - 산화제 분해 및 / 또는 효소에 의해 3,4- 접착제 매트릭스 기판의 동적 리모델링을 특징으로한다. 예를 들어, 혈관 내 피하 기질 단백질을 접착 (예를 들어, 피브로넥틴은) 때문에 반응 산화제의 국산화에 인간의 염증성 질환에서 수정 또는 변형 주요 대상으로 연루되어있다 (예를 들면, 차아 염소산,의 HOCl) 백혈구 유래 효소에 의해 염증성 혈관 질환 (그림 1) 5-9시 내피 밑층 내에 축적 폐장 내 myeloperoxidase (MPO). MPO 파생 산화제 및 기타 매트릭스 수정 자극에 의​​해 유도 된 세포 - 매트릭스 접착의 변화는 사장님이다다시 내피 기능과 장벽의 무결성을 교란 내피 세포 신호, 형태와 가능성을 변경하여, 예를 들어, 엘리는 병적 다양한 공정 중에 혈관 항상성 변화에 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포 외 기질 수정에 부착 세포의 형태 학적 및 세포 신호 반응은 이해하기 시작했다. 매트릭스 수정 세포 접착 역학 및 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 운전하는 방법을 이해하기 위해, 기술은 정확하게 높은 시간 해상도로 실시간으로 세포 - 매트릭스 접착의 변화를 정량화하는 것이 필요합니다. 여기서는 상보 셀 기판 임피던스 이러한 기준을 충족하고, 비 침습적 방법으로 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 플랫폼을 제공 생균 이미징 기술을 설명한다. 우리는 표시 방법이 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징 APPRO통증 용이 세포 부착의 역학을 모니터링하고 네이티브 및 변성 매트릭스 기판 상에 (즉, 새로이 세포 부착) 확산 및 (ii) (즉, 디 - 부착 세포 - 매트릭스 박리 동성을 측정하기 위해 (ⅰ)에 이용 될 수있다 ) 매트릭스 수정 자극에 노출 부착 세포에 의해. xCELLigence 셀 기판 임피던스 바이오 센서 시스템은 96 웰 금 미세 전극 어레이의 표면에 임피던스를 정량함으로써 셀 매트릭스의 접촉 면적의 연속 측정을 제공하고, &#39;셀 인덱스&#39;무 차원 값으로서 이러한 임피던스 측정을 나타낸다고 또한 (절연막) 세포막과 전극면 (11) 사이의 평균 거리의 변화에 민감한 반면, 셀 기판 컨택트 (10) (도 2)의 면적에 거의 비례한다. 셀 인덱스 값에서 추가의 증가는 세포 간 긴밀한 접점 그쪽 형성시 달성t는,이 연구에서 설명하는 실험 내에서 우선하지 않습니다 (11)의 조건을 세포층의 전류 흐름을 제한합니다. 경과 미분 간섭 콘트라스트의 이미지 분석에 의한 시간이 지남에 각 셀의 투영 면적의 측정은 (DIC) 영화 셀 기판의 접촉 면적의 변화의 상보 척도를 제공하고 사람의 정확한 성격과 역학에 관한 추가 정보를 제공한다 세포 기질 임피던스 방식에 의해 정량화 형태 학적 변화. 구체적으로, 우리는 (예를 들면, 피브로넥틴) (ⅰ) 접착 피하 기질 단백질의 산화를 MPO 매개 어떻게 모니터링 정제 피브로넥틴 및 (ⅱ) 트리거 셀 매트릭스 드에 현탁 내피 세포의 드 노보 밀착성을 감소하기 위해 이러한 접근법의 적용을 설명 피브로넥틴에 설립 접착 내피 세포에 -adhesion. 병렬 세포 신호를 수행하는 관련 BIOCHEM를 사용하여 시간이 지남에 따라 분석하여분석적인 (예를 들어, 웨스턴 블랏), 접착 의존성 세포 시그널링 이벤트에 접착 / 디 접착 공정과 관련된 변화와의 시간적 인과 관계가 결정될 수있다. 이러한 접근 방식은 최근의 MPO 피하 침착에 의해 촉매 산화 외 매트릭스는 기존 액토 마이 오신의 수축력 (9)에 의해 구동되는 내피 세포의 세포 - 매트릭스 밀착성 급속한 손실을 유발 함을 입증하기 위해 사용되었다. 중요한 것은, 두 세포 접착의 변화 및 ​​결정되는 신호 접착 의존성 세포 사이의 시간적 관계를 가능하게하여, 이러한 방법은 MPO에 의한 매트릭스 수정 및 휴대 탈 부착 값이 SRC 키나아제를 포함한 중요한 접착 의존성 세포 신호 전달 경로의 변화를 트리거 발견 의존성 paxillin 인산화 및 미오신 경쇄 II의 인산화 (그림 1) 9. 산화 환원에 의존 신호, INV의 모드세포 - 매트릭스 접착을 방해 외 산화 반응에 의해 세포 내 신호 이벤트의 활성화를 olving, 셀의 신규 모드 &quot;아웃 사이드 레 독스 신호&quot;(도 1)이라 나타낸다 시그널링 구. 일반적으로, 이러한 상보 셀 기판 임피던스 바이오 센서 및 생균 촬상 방식은 매트릭스 - 수정 자극 또는 대리인이 세포 접착 역학, 형태의 변화를 구동 방법 상이한 드러내는 다양한 적용 상이한 부착 세포 유형 내에서 시그널링 귀중한되어야 실험 설정. 다음 프로토콜은 드 노보 내피 세포 부착 (실험 1) 및 내피 세포의 탈 부착 (실험 2) 프로세스에 MPO 매개 매트릭스 산화의 영향을 정량화하는 방법을 설명합니다. MPO는 피브로넥틴 및 기타 접착제 피하 세포 외 기질 단백질과 우리에게 탐욕스럽게 결합ES (H 2 O 2) 염화물 이온 (CL을 -) 변환 과산화수소 이들 기질 단백질로 국소 반응 및 세포 접착 특성 (도 1) 8,9 방해 반응성 염소 산화제 차아 산 (의 HOCl)에, (12).

<table><tbody><tr><td>96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system</td></tr><tr><td>blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>selective inhibitor of non-muscle myosin-II</td></tr><tr><td>Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>endothelial cell growth media kit</td></tr><tr><td>Fibronectin, lyophilized powder</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging</td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>cell culture substratum</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>serum-free cell media</td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase</td></tr><tr><td>Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes</td><td>Millipore</td><td>475911</td><td></td></tr><tr><td>RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

using cell-substrate impedance and live cell imaging to measure real-time changes in cellular adhesion and de-adhesion induced by matrix modification

셀 매트릭스 접착 세포 형태를 제어 및 시그널링에 중요한 역할을한다. 세포 접착 매트릭스 (예, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 및 다른 매트릭스 - 수정 산화제 / 염증 동안 방출 효소)를 방해 자극 질환의 수가 세포 기능, 표현형과 생존의 병리학 적 변화를 유발에 관여된다. 여기서는 (병리 생리 매트릭스 수정 자극으로 내피 세포 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제를 사용하여) 셀 기판 임피던스와 생균 촬상 접근 용이 정확하게 세포 부착 및 매트릭스 변형에 의해 유도 된 디 밀착성 실시간 변화를 정량화하기 위해 이용 될 수있는 방법을 설명하는 높은 시간 해상도와 비 침습적 방법. xCELLigence 셀 기판 임피던스 시스템은 연속적으로 금 미세 전극 배열상에서 성장한 세포에서 세포 - 기판 계면에서 임피던스를 측정함으로써 세포 매트릭스의 접착 면적을 정량화한다. 의 이미지 분석 시간 경과 differen간섭은 최초 콘트라스트 영화 셀 매트릭스의 접촉 면적의 변화를 나타내는, 시간이 지남에 따라 각 셀의 투영 면적의 변화를 정량화한다. 두 기술은 정확하게 세포 접착 및 탈 부착 프로세스에 급격한 변화를 정량화. 미세 바이오 센서 어레이에 관한 셀 기판 임피던스는 견고한 높은 처리량 측정 용 플랫폼을 제공한다. 라이브 세포 이미징은 세포 기질 임피던스 측정에 의해 정량 형태 학적 변화의 특성과 역학에 대한 추가 세부 사항을 제공 분석한다. 이러한 접근법은 상보 세포 내 세포 외 기질 성분의 myeloperoxidase가 촉매 작용 산화가 빠르게 변형 세포 부착, 형태 변화 및 ​​내피 세포에서 트리거 시그널링 방법에 유용한 새로운 통찰력을 제공한다. 이러한 접근은 다른 매트릭스 수정 자극 및 관련 자기편 세포 (예를 들면, 상피 세포)에 대한 응답으로 세포 접착 역학 연구를위한 적용 할 수 있습니다.

기본 상 MPO 매개 피브로넥틴 산화 (실험 2) 내피 세포 현탁액. 시딩에 대한 응답으로 최대한의 세포 부착 및 확산에 MPO (무료) 피브로넥틴 또는 MPO-베어링 피브로넥틴 결과에 피브로넥틴에서 내피 세포의 탈 부착의 실시간 정량 2 시간 내에, 세포 기질 임피던스 측정 (도 3a) 세포에서 지수 값 plateauing 것으로 판단. MPO 매개 피브로넥틴의 산화 실험 1?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification at JoVE.

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

using-cell-substrate-impedance-live-cell-imaging-to-measure-real-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.9K 조회수.  University of New South Wales.  여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다. 

비디오: Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

연구

생체공학

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These acquired abnormalities in complex, multilayered molecular signaling networks induce aberrant cell proliferation and survival, extracellular matrix degradation, and metastasis to distant organs. Approximately 90% of cancer-related deaths are estimated to be caused by the direct or indirect effects of metastatic dissemination. Therefore, it is important to establish a highly reliable, comprehensive system to characterize cancer cell behaviors upon genetic and environmental manipulations. Such a system can give a clear understanding of the molecular regulation of cancer metastasis and the opportunity for successful development of stratified, precise therapeutic strategies. Hence, accurate determination of cancer cell behaviors such as migration and invasion with gain or loss of function of gene(s) allows assessment of the aggressive nature of cancer cells. The real-time measurement system based on cell impedance enables researchers to continually acquire data during a whole experiment and instantly compare and quantify the results under various experimental conditions. Unlike conventional methods, this method does not require fixation, staining, and sample processing to analyze cells that migrate or invade. This method paper emphasizes detailed procedures for real-time determination of migration and invasion of glioblastoma cancer cells.

Cancer is a lethal disease due to its ability to metastasize to different organs. Determining the ability of cancer cells to migrate and invade under various treatment conditions is crucial to assessing therapeutic strategies. This protocol presents a method to assess the real-time metastatic abilities of a glioblastoma cancer cell line.&#160;

암세포 이동 및 침입에 대한 임피던스 기반 실시간 측정

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

암 연구학

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of cancer cell populations typically generate a single endpoint measurement that does not distinguish between cancer cell subpopulations with different invasive potential. Also, the tumor microenvironment consists of different resident stromal and immune cells that alter and participate in the invasive behavior of cancer cells. Invasion into tissues also plays a role in immune cell subpopulations fending off microorganisms or eliminating diseased cells from the parenchyma and endothelial cells during tissue remodeling and angiogenesis. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) that utilizes impedance biosensors to monitor cell invasion was a major step forward beyond endpoint measurement of invasion: this provides continuous measurements over time and thus can reveal differences in invasion rates that are lost in the endpoint assay. Using current RTCA technology, we expanded dual-chamber arrays by adding a further chamber that can contain stromal and/or immune cells and allows measuring the rate of invasion under the influence of secreted factors from co-cultured stromal or immune cells over time. Beyond this, the unique design allows for detaching chambers at any time and isolating of the most invasive cancer cell, or other cell subpopulations that are present in heterogeneous mixes of tumor isolates tested. These most invasive cancer cells and other cell subpopulations drive malignant progression to metastatic disease, and their molecular characteristics are important for in-depth mechanistic studies, the development of diagnostic probes for their detection, and the assessment of vulnerabilities. Thus, the inclusion of small- or large-molecule drugs can be used to test the potential of therapies that target cancer and/or stromal cell subpopulations with the goal of inhibiting (e.g., cancer cells) or enhancing (e.g., immune cells) invasive behavior.

We describe an approach to detect and capture invasive cell subpopulations in real-time. The experimental design uses Real-Time Cellular Analysis by monitoring changes in the electric impedance of cells. Invasive cancer, immune, endothelial or stromal cells in complex tissues can be captured, and the impact of co-cultures can be assessed.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

생물학

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.