The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

먹이 박테리아 1. 준비 주 :이 항목은 먹이 세균 (대장균 OP50)의 제조를 설명한다. <ol><li> E.의 단일 콜로니를 분리 무균 원성 국물 (LB) 한천 플레이트에서 대장균 균주 OP50는 멸균 LB 배지 300 ml의에 접종합니다. </li><li> 포화 상태에 도달 할 때까지 접종 문화, 200 rpm으로 37 ° C에서 통에 밤새 성장하도록 허용합니다. </li><li> 6 멸균, 미리 무게를 50 ML 원뿔 튜브에 OP50을 전송합니다. 6000 RPM (5000 XG)에서 5 분 동안 원심 분리하여 세균 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 멸균 M9 50 ml의 세균을 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 두 번째 세척 후 더 M9는 튜브에 남아 있지 않도록 보장, 나머지 M9를 제거합니다. </li><li> 박테리아 펠렛을 함유하는 튜브를 칭량 펠릿의 중량을 결정하고 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 무게를 뺀다. </li><li> 펠릿 난을 재현 탁M9 N 100 mg / ml의 농도로. </li><li> 이 웜 문화에 사용 될 때까지 4 ℃에서 OP50 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 선충 성장 중간 (NGM) 페트리 접시 2. 준비 주 :이 섹션은 판 C.는 NGM 페트리 접시의 준비에 대해 설명합니다 엘레 웜은 정기적으로 실험실에서 유지됩니다. <ol><li> NGM 한천 배지를 압력솥. </li><li> 무균 절차를 이용하여, 연동 펌프를 이용하여 6cm 페트리 접시에 NGM 한천 용액 17㎖의 분배. 주 : 판에서 한천의 일정 금액이 다른 하나의 판에서 전환 할 때 현미경을 재조명의 필요성을 감소시킨다. </li><li> 한천 응고하자 여분의 수분이 증발 할 수 있도록 사용하기 전에 2~3일 실온에서 접시를 남겨주세요. </li><li> 멸균 기법을 사용 NGM 플레이트 종자. OP50 액체 배양의 1-2 방울을 적용하고 유리 막대를 사용하여 확산. 확인되지판의 가장자리에 박테리아 잔디 모든 방법을 전파한다. </li><li> OP50 잔디가 벌레를 성장 판을 사용하기 전에 실온에서 1~2 일 동안 성장하는 것을 허용합니다. </li></ol> 동기 웜 인구의 3 준비 주 : C.의 수명 엘레는 배아 단계, 네 애벌레 단계 (L1-L4) 및 성인으로 구성되어 있습니다. 이 섹션에서는 웜의 시대 - 동기 인구의 준비에 대해 설명합니다. 표백제 처리 후 C.elegans과 접촉 모든 자료는 멸균해야합니다. <ol><li> 1 일 - 임신하는 웜 인구의 준비 <ol><li> 웜 인구의 대부분이 굶주린 L1 유충 구성하는 NGM 플레이트를 사용합니다. </li><li> 멸균 웜 L1 애벌레 선택 수집하고 신선한 6cm의 NGM 플레이트로 전송은 OP50 시드. 벌레의 대부분이 임신하는 성인 때까지 20 ℃에서 약 65 시간 동안 품어. 에판 혼잡을 방지하고 각 신선한 NGM 판에 L1 유충 이상의 하나 또는 두 개의 클러스터를 전송하지 않습니다, 벌레 박테리아를 파괴없이 증가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 4 일 - 동기화 된 L1 유충 인구의 설립 <ol><li> M9의 1-2 ml로를 세척하여 NGM 판에서 임신하는 벌레를 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송. </li><li> 임신하는 웜이 약 5 ~ 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 침전 보자. 웜 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 2-4 마이크로 원심 튜브 웜 펠렛을 전송하고 표백제 / NaOH 용액 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 2 ~ 3 분 동안 품어. 모든 벌레가 죽었 확인 실체 현미경 하에서 반응의 진행을 모니터링합니다. 배아가 죽을 수 있으므로 이상 5 분 표백하지 마십시오. </li><li> 3,000 RPM (900 XG)에서 1 분 동안 원심 분리하여 벌레를 수집합니다. 상층 액을 제거하고 멸균 M9의 1 ml에 추가반응을 중화. </li><li> 3,000 RPM (900 XG)에서 1 분 동안 원심 분리하여 두 번 벌레를 씻으십시오. </li><li> 상층 액을 제거하고 최대 100 ~ 200 μL에 M9를 추가합니다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫 웜의 드롭을 추가 사용 / M9는 배아가 부화 할 수 있도록 20 ° C에서 최소 24 시간 동안 그들을 NGM 판을 지우고 배양 혼합. 참고 : 음식없이 유충의 성장은 L1 단계에서 중단 될 것입니다. </li></ol></li><li> 5 일 - 동기화 된 L4 애벌레 인구의 설립 <ol><li> M9의 1-2 ml로 판을 세척하여 맑은 NGM 판에서 L1 유충을 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송. </li><li> 약 5 분 동안 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 죽은 성인 웜 침전물을 보자. </li><li> 새로운 원뿔 15 ML 튜브의 L1 웜은 상층 액을 수집하고, 2,600 RPM (1,000 XG)에서 2 분 동안 원심 분리하여 웜을 침전. </li><li> 뜨는 르를 제거약 500 μL AVING. </li><li> 실체 현미경을 이용하여 10 μL 삭제 웜의 수를 카운팅함으로써 M9 웜 용액의 농도를 결정한다. 적어도 5 방울을 계산합니다. </li><li> 20 ~ 25 웜 / μL로 웜의 농도를 조정하고 OP50 시드 NGM 판에 웜 / M9 믹스의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 그들은 L4 단계에 도달 할 때까지 L1 동기화 된 인구가 성장 할 수 있도록 (주말을 통해 배양 용) 15 ° C에서 65 시간 동안 품어. </li></ol></li></ol> 96 웰 플레이트에서 화학 물질에 웜의 4 노출 참고 :이 섹션은 Pxol1의 사용에 대해 설명 :: C를 포함하는 GFP 전사 기자 엘레 변형은 이수성의 유도를위한 화면으로 이동합니다. <ol><li> M9의 1-2 ml로 판을 세척하여 맑은 NGM 판에서 L4 유충을 수집하고 원뿔 15 ML 튜브로 전송. </li><li> 하단에 L4 웜 침전물하자15 ml의 약 5 ~ 10 분 동안 원뿔 튜브. 웜 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> M9의 3-5 ml에 첨가하고, 실체 현미경을 이용하여 10 ㎕의 방울 웜의 수를 카운팅함으로써 M9 용액 웜의 농도를 결정한다. 각 샘플에 대해 적어도 5 방울을 계산합니다. </li><li> M9 1,000 웜 / ml의 농도로 재현 탁 웜. </li><li> 섹션 1에서 OP50 박테리아 희석 M9와 10 배. 낮은 온도는 웜 개발에 영향을주기 때문에 재 부유 세균은 실내 온도에 도달해야합니다. </li><li> 제 (단계 4.4) 웜 / M9 믹스 100 ㎕를 추가하고 2ml의 깊은 환저 96- 웰 플레이트의 각 웰에 (단계 4.5)으로 희석 OP50 세균 400 μL를 추가, 멀티 채널 피펫을 사용. 마지막에, 각 웰은 500 μL 100 웜이있을 것이다. </li><li> 최종 제안 CONCENTR을 달성하기 위해, 목적하는 웰에 시험 물질 또는 적절한 제어 중 0.5 μl를 추가100 μM의 ATION는, 농도는 일반적으로 C. 화학 화면에 사용 엘레 (12). 최종 농도 0.1 % DMSO 또는 에탄올 용매 컨트롤을 노출. 참고 : 우리는 긍정적 인 제어와 같은 nocodazole (100 μM)의 사용을 권장합니다. </li><li> 접착 필름을 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 우물 사이에 교차 오염을 방지하기 위해 잘 판을 밀봉해야합니다. </li><li> 알루미늄 호일로 접시를 감싸. </li><li> 시간의 적당한 길이 (24 또는 65 시간)에 적합한 온도의 셰이커 (170-180 RPM)에 접시를 전송합니다. 실내의 온도는 웜의 성장에 영향을 미친다; 20 ° C의 주변 온도를 유지한다. </li></ol> 384 웰 플레이트에서 임신하는 웜 5. 이미지 획득 참고 :이 섹션은 성인 자웅 동체의 자궁 내 배아에서 GFP의 발현을 시각화, 이미지 노출 Pxol1 :: GFP 벌레에 함량이 높은 현미경의 사용에 대해 설명합니다. 용각 384 웰 플레이트가 상영 될, 4 × 96 웰 플레이트에서 웜을 사용합니다. <ol><li> 셰이커 화학 물질에의 노출 후 10 ~ 15 분 동안 96 웰 플레이트 나머지는 어른 벌레가 판의 바닥에 침전 수 있도록 할 수 있습니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 판의 맨 아래에있는 벌레를 방해하지 않도록 매우 조심, M9의 350 μl를 제거합니다. </li><li> M9 1 ml의 단계를 반복 5.1 벌레를 씻으십시오. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 판의 맨 아래에있는 벌레를 방해하지 않도록 참 조심, M9 1 ㎖를 제거합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 나머지 M9에 웜을 재현 탁하고, 96 웰 플레이트에서 웜 / M9 믹스 100 ㎕를 모으고 검은 벽 / 클리어 바닥 384- 웰 플레이트의 웰에로드. 384 웰 플레이트의 모든 우물이로드 될 때까지, 4 × 96 웰 플레이트에서 웜을 사용하여 프로세스를 반복합니다. 주 : 중요을 증가시키기 위해 모든 웰은 동일한 볼륨을 갖도록위한이미지 획득 과정의 효율성 및 오토 포커스의 속도. 각 웰은 80-100 웜 사이에 포함해야합니다. </li><li> 각 웰의 levamisole (100 μM)의 1 μl를 추가하고 벌레가 약 30 분 동안 품어 보자. 주 :의 levamisole가 아세틸 콜린 수용체 작용 물질로서 작용하고 벌레를 고정화. </li><li> 자동화 된 영상을 제공 할 수있는 위드 함량이 높은 현미경으로 접시를 전송합니다. </li><li> 이미지 수집의 경우, 제조업체의 지침에 따라 높은 함량의 이미지 수집 및 분석 소프트웨어를 사용합니다. 물론 당 1 영상을 획득 할 수 4X 목표를 선택합니다. </li><li> 화상 취득을 시작하기 전에, 2160 X 2160 노출 이미지의 해상도가 45 밀리 초에 GFP 촬상 파라미터를 조정한다. </li><li> 웰 벌레의 총 수로 나눈 GFP 양성 벌레의 수와 데이터를 수집, 측정, 후자는 웰 사이의 일관성이 비교적. </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 기재된 방법은 생식선 독성의 식별을위한 제 대규모 전략을 구성한다. 그것은 충실하게 생식 기능 장애에 대한 프록시로 사용되는 초기 배아에서 이수성의 유도를보고 GFP 형질 전환 Pxol-1 :: GFP 포함하는 변형의 사용을 필요로한다. 방법 C. 동기화의주의를 포함 엘레 웜 인구와 자동화 된 고 함량 현미경으로 GFP 긍정적 인 웜의 영상 다음 96 웰 형식의 화학 물질에 웜 &#39;...

미국에서 상업에 등록 된 약 87,000 화학 물질이이 건강에 미치는 영향 1 테스트 한의 또 적은 수 있습니다. 테스트 한 것들 중에서 일부만 특히 여성 생식 세포 발생과 분화 동안 포유류 이른 생식 이벤트의 변경을 결정하는데 어려움으로 인해 일부 생식 건강에 미치는 영향에 대해 평가되었다. 사실, 첫 번째 감수 이벤트는 여성 포유 동물의 배아 발달의 초기 단계 동안 자리를 차지할 때문에 액세스 및 심사 목적에 맞는 숫자를 수집하기가 어렵습니다. 생식 세포는 세대 간의 중요한 연결을 제공하고, 그것의 적절한 기능은 세포의 염색체 분열의 복잡한 프로그램의 정확한 실행이 감수 분열이라에 따라 달라집니다. 감수 과정의 조절 곤란 저감 다산 및 생산 될 수있다염색체의 이상 수의 생식 세포 및 배아는 조건 이수성 불린다. 감수 분열 염색체 편석 에러는 인간의 건강에 매우 적합하다. 염색체 이상은 1 (150) 출산의 주파수, 삼 염색체 21, 18, ​​13뿐만 아니라 가장 흔한 유형 2,3 인 X와 Y 염색체 오류, 일반적이다. 또한, 염색체의 기원을 포함한 선천성 기형이, 미국 4 환경의 영향이 염색체 분리와 행동에 영향을 미칠 수 있다는 생각 유아 사망의 주요 원인이되는 5 개의 새로운 것이 아니다,하지만 여전히 제대로 이해된다. 그것은 인간의 불임, 초기 개발 및 전반적인 생식 건강을 방해 우리의 환경에 도입 된 화학 물질의 어떤 조사하는 것이 중요하다. 포유 동물 모델의 이러한 한계의 관점에서, 우리는 &lt;회충 생식 독성을 테스트하기 위해 높은 처리량 스크린 분석법을 개발EM&gt; C. 엘레. 우리는 작은 크기, 낮은 비용, 짧은 재생주기, 생식 세포의 비율이 높은 및 조작 (6)의 용이성으로이 일반적으로 사용되는 유전자 모델 시스템에서 제공하는 여러 가지 중요한 기능을 동원했다. 웜 96- 웰 플레이트 또는 대량의 액체 배양 물에서 성장 될 수 있고, 투명성 때문에 직접 형광 리포터 검출 용 플레이트 상에 이미징 될 수있다. 후술 분석은 이러한 특성을 활용하고 및 배아 생식 세포 분열 이수성의 유도를 검출하는 형광 리포터에게 Pxol :: GFP-1을 함유하는 웜 변형을 이용한다. 이 리포터 균주의 사용은 주로 암수 웜 인구 남성 일반적 드문에 기초한다. 이 남성은 (&lt;0.2 %)이 자연스럽게 X 염색체 7의 분리에 오류를 발생. 그러나 생식 세포 분열로 자주 염색체의 분리의 오류로 연결과 heterochromosomes, 그것은 남성의 표현형 (X의 missegregation)뿐만 아니라 배아 치사 (염색체의 missegregation)의 높은 발병률을 모두 상관 관계. 배아 치사의 문제를 회피하면서 쉽게 수컷의 유도를 검출하기 위해, 남성 특이 프로모터 (XOL-1) 여전히 웜의 자궁 내에 포함 된 초기 배아에서 GFP의 발현을 구동하는 데 사용된다. 이와 같이, GFP 발현의 배아 외관 aneuploid 배아의 존재에 대한 프록시로서 사용된다. 이 방법은 이전 생식계 정비 및 감수 8,9에 관여 유전자를 동정하는데 사용되어왔다. 화학적 선별하도록 구성된,이 균주는 높은 처리량 스크린 매체에 사용된다. 중요한 것은, 변형 충실 화학 물질의 aneugenicity를보고하고 포유 동물의 생식 엔드 포인트 (10)에 따라서 관련이있다. 여기에 설명 된 분석은보고 제약 및 화학 산업 설정에서 독성 학자들에게 특히 유용 할 것입니다빠르게 생식 엔드 포인트에 대한 화학 물질의 독성을 평가합니다. 또한,이 분석은 완전히 21 세기 보고서 11 독성에 강조 정부의 우선 순위로 정렬합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

우리의 환경에 존재하는 화학 물질의 수천의 생식 독성을 확인하는 것은 환경 보건 분야에서 가장 밝히는 과제 중 하나가되었습니다. 이것은 척추 동물의 높은 번호를 필요로하지 않고, (1) 정확하게 (2) 높은 처리량 방식으로 중간에서 이렇게 생식 과정 키 기능 요점을 되풀이하고있다 모델 시스템의 소수에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다. 우리는 선충 C. 여기에 분석을 설명 aneuploid 배아의 유도를 모니터링하여 생식 세포 독성 물질의 신속한 식별 할 수 간스. GFP 리포터 라인을 이용하여, 배아 파괴로 인한 염색체 분리에 오차가 용이하게 시각화 및 자동화 된 형광 현미경에 의해 정량화. 따라서, 그 독성에 대한 화합물의 특정 세트의 스크리닝은 수일 384 96- 웰 플레이트 형식으로 수행 될 수있다. 긍정적 인 시간의 차 분석그는 염색체 이상은 감수 분열 또는 초기 배아 염색체 분리에 유래 오류 여부를 판단하기 위해 수행 될 수있다. 전부,이 분석 결과 화학 물질에의 노출 다음과 생식 기능 장애의 신속한 평가를위한 빠른 첫 번째 패스 전략을 나타냅니다.

이러한 미세 소관 독 Nocodazole 등의 화학 약품에 Pxol-1 :: GFP 기자 균주의 노출 (그림 1) DMSO 제어에 비해 노출 성인 자웅 동체의 자궁에 GFP를 발현하는 배아의 높은 비율의 유도에 이르게. GFP 양성 배아 다른 배아뿐만 아니라 동물의 소화관에서 관찰 자동 형광 관찰 약한 배경 형광보다 상당히 밝습니다. 웜 직접 노출 384- 웰 플레이트 상에 결상 및 적어도 하나 GFP 양성 배아를 함유 ...

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K 조회수.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

화학 물질 안전 검사 및 시스템 생물학 데이터 생성을 위해 발생 독성 시험 법을 바탕으로 인간 다 능성 줄기 세포

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

연구

발생학

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

메다카 계란을 사용하여 실버 Nanocolloids의 염도에 의존하는 독성 분석

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

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The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...