Name: immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons
Uploaded: 2017-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons at JoVE.com

깊이 저자 박사 아 사코 스 기 모토 (도호쿠 대학) 그녀의 도움이 토론 감사합니다. wyIs251 박사 강 쉔 (스탠포드 대학)에서 관대 한 선물 했다. mnIs17 는 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금 CGC에 의해 제공 했다. 이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 #17 H 05010 및 #16 H 06536와 다이 이치 산 쿄 재단, 뇌 과학 재단과 나이토 재단에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 준비 <ol><li>생성 유전자 변형 C. 선 충 유전자 변형 방법론 18를 사용 하 여 관심사의 변형. 또는, 적절 한 긴장을 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다. 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송을 시각화 하려면 유전자 변형 라인 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT 관찰, 유전자 변형 라인 mnIs17 [osm 6::gfp] 19를 얻을. 이러한 긴장은이 프로토콜에 사용 됩니다. 
	참고: 중 extrachromosomal 배열, 게놈 통합, 또는 심지어 GFP 노크에 작품. 배경 신호를 줄이기 위해, 사용 하 여 셀 특정 발기인 보다는 팬-신경 발기인. 
	참고: 벌레의 유지 관리는 다른 프로토콜 20에 설명 되어 있습니다. 변종 선 충 류 성장에 Escherischia 대장균 OP50 급지대의 잔디밭에 유지 되었다 중간 (NGM) 접시 (1.7% (w/v) agarose, 50 mM NaCl, 0.25% (w/v) 펩, 1mm CaCl 2, 5mg/mL 콜레스테롤, 25mm KH 2 포 4, 1mm MgSO 60 mm 직경 플라스틱 접시에 4) 20 ° c.</li>
	<li>성장 벌레의 어떤 라이프 사이클 단계로 NGM 접시에 20 ° C에서 웜. 
	참고: 모든 단계에서 axonal 교통과 IFT를 관찰할 수 있다 하나. 여러 게시 이러한 단계와 시각화 된 밀매 이벤트 14 , , 21 22 사용 하기 때문에 젊은 성인 늦은 L4 좋은 긍정적인 통제는 , 23.</li>
</ol> 2. 10%의 준비 Agarose 참고: 한 천, 한 천 분말, agarose 등 유사한 제품을 제공 하는 많은 공급 업체. 전기 이동 법 학년 agarose를 사용 하 여 (강도 젤 &#62; 1200 g/c m 2). 저렴 한 천 분말 결과 젤은 충분히 강한 벌레를 무력화 하기 때문에 작동 하지 않습니다.
<ol><li>믹스 0.4 g agarose 4에서 mL 증류수 (DW) 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m). 뚜껑을 증발을 피하기 위해 유리 튜브에 넣어.</li>
	<li>90 분 동안 95 ° C 열 블록에 유리 튜브를 넣어. 또한, 다른 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m) DW 가득 준비 하 고 95에서 계속 ° C. 넣어 파스퇴르 피펫으로 95 ° C DW ( 그림 1 A). 작은 거품을 많이 agarose 튜브에서 볼 것 이다 그리고 솔루션 탁 되어야 합니다. 솔루션 취소 될 때까지 놔 둬. 다음, agarose 솔루션 균질 될 때까지 아래로 pipetting 혼합. 
	참고: 전자 레인지 10 %agarose 솔루션 DW agarose에서 만든 때를 준비 하는 사용할 수 없습니다. 전자 레인지에 의해 발생 하는 작은 거품 agarose 녹는 것을 방지 합니다. 그러나, 응고 10 %agarose 젤 수 있습니다 쉽게 될 녹아 전자 레인지를 사용 하 여 다시. 10 %agarose 젤을 포함 하는 유리 튜브 미리 준비 하 고 6 개월 이상 4 ° C에서 저장 수 있습니다. 이렇게 필요할 때 전자 레인지를 사용 하 여 주식을 용 해 하 고이 프로토콜의 3 단계에서 시작. 
	참고: Agarose 점차적으로 또는 반복된 응고 및 용 해 후 오랜 시간 동안 95 ° C에서 incubated 경우 응고 능력을 잃는다. 이 경우, 준비 새로운 10 %agarose.</li>
</ol> 3. Agarose 패드의 준비 <ol><li>따뜻하게 파스퇴르 피펫으로 단계 2.2에서에서 준비를 사용 하 여 76 x 22 mm 슬라이드 위에 2 방울 10 %agarose.</li>
	<li>빨리 agarose 강하 하기 전에 두 번째 76 x 22 m m 2 슬라이드 커버 굳은 에서처럼 그림 1 B, 그리고 밀어 아래로 두 번째 슬라이드에 agarose 솔루션을 평평 하 게. 두께 0.5-1 이어야 한다 m m.</li>
	<li>신속 하 게 파스퇴르 피펫으로 여 플러시 pipetting 95 ° C DW 위아래로 agarose 솔루션은 밖으로 세척 될 때까지. 그렇지 않으면,는 피펫으로 agarose 젤에 의해 막힌 될 것입니다. 95 ° C DW에에서 피 펫 서 둡니다.</li>
	<li>잠깐 1 분입니다. Agarose 패드 고 흐린 되. 그런 다음 ( 그림 1 C) 손으로 떨어져 슬라이드 슬라이드.</li>
</ol> 4. 벌레의 장착 참고:도 적은 양의 웜 운동 방지 좋은 관찰. Levamisole는 agarose 패드 24 , 25에 웜 움직임을 방지 하기 위해 전통적으로 사용 되었습니다. 그러나, Levamisole C. 선 충에 있는 신경 수용 체를 억제 하 고 따라서 신경 15 밀매 이벤트에 영향을 미칠 수 있습니다. Hereis 좋은 대체 17 설명 사용 하 여 폴리스 티 렌 microbeads.
<li><ol>Slidable 미러 transillumination를 장착 스테레오 현미경, 전송 ~ 30 새로운 NGM 적절 한 표시자를 표현 하는 유전자 변형 웜 접시 없이 박테리아 백 금 철사를 사용 하 여 선택. 
	참고: 백 금 철사 선택 백 금 철사 및 만든 파스퇴르 피 펫 (5 인치), 그리고 백 금 철사의 끝이 평평 했다. 백 금 철사 추천의 준비 및 취급이 벌레의 Wormbook (http://www.wormbook.org)에 설명 되어 있습니다.</li>
	<li>접시를 두고 1 분 박테리아는 자동으로 제거 됩니다 벌레의 표면에서 벌레 세균 없이 NGM agarose 젤에 이동.</li>
	<li>넣어는 0.5-1.0 µ L의 2.6 %100 nm 직경 폴리스 티 렌 microbeads 천 패드 ( 그림 1 D)에 물에 드롭. 박테리아 없는 NGM 플레이트의 10-20 벌레는 microbeads에 전송. 방울과 백 금 철사를 사용 하 여 벌레의 중복을 피하기 위해 선택 확산 벌레 시체 ( 그림 1 E).</li>
	<li>22 x 40 m m 2 coverslip ( 그림 1 F) 적용 됩니다. 공기 방울을 제거 하지만 분쇄 웜 방지 부드럽게 밀어. 샘플은 지금 영상에 대 한 준비. 
	참고: 아무 마 취 관리 때문에 벌레만 천 패드, 폴리스 티 렌 microbeads coverslip 17에 의해 생성 된 마찰 힘에 의해 고정 됩니다. 급지대 박테리아 너무 많은 솔루션의 존재는 마찰 힘 약한 하게된다. 
	참고: (예를 들어, 22 x 22 m m 2, 18 x 18 m m 2) coverslips의 다른 크기를 작동합니다. 그러나, 더 큰 coverslips 침수 물 또는 오일 샘플 관찰 하는 동안 유출 대물 렌즈에서 방지할 수 있습니다.</li>
</ol> 5. 관찰 참고: 적절 한 이미징 매개 변수 (레이저 전력, 이득, 범주화, 등) 각 현미경 시스템 및 카메라에 대 한 다를 것 이다. 여기, 회전 디스크 confocal 스캐너와 디지털 CCD 카메라 widefield 현미경 사용 됩니다.
<ol><li>20 ° c, 무대의 온도 제어를 설정 하거나 조정 실내 온도 20 ° c.</li>
	<li>샘플 슬라이드를 현미경 무대 위에. 100 x를 사용 하 여 (수 가늠 구멍 = 1.3 또는 더 나은) 렌즈.</li>
	<li> 그림 2 A (wyIs251 및 axonal 전송) 또는 그림 2 B (mnIs17와 IFT) 긍정적인 컨트롤에 표시 된 영역에 대 한 보고 . 다른 분야는 잘 22로 분석 될 수 있다.</li>
	<li>세트 매개 변수 (CCD 이득 = 200, Binning = 1 또는 2, 488에서 레이저 전원 nm = 1.0-1.3 mW). 시간 경과 기록 4 프레임/s에서 최대 1 분 mutli-TIFF 형식으로 파일 저장에 대 한 수행. 
	참고: 경우 GFP 신호 사라지고 GFP::RAB 3 또는 OSM 6::GFP 30에 대 한 관찰을 계속 하기가 s, 레이저 힘이 너무 강해. 이 경우, 레이저 파워를 줄일 수 있습니다. 반대로, 기공을 운동 기록 레이저 파워는 너무 약하다. 이 경우, 레이저 파워 증가.</li>
	<li>다른 벌레를 관찰 하 고 5.3 및 5.4 반복. 관측 최대 20 분 동안 지난 수 있습니다 하지만 각 웜 p의 효과 피하기 위해 한 번만 기록해 야hoto 손상. 
	참고: 중요 한 결함 7 , , 27 28 없이 적어도 20 분 동안 벌레 관찰 되었습니다. 더 이상 관찰 가능 피난처 있을 수 있습니다 &#39; t 되었습니다 아직 테스트. 신경 죽음의 명확한 표시 neurite 붓기 같은 신경 형태학의 변화 이다. 약한 GFP 신호는 축 삭과 dendrites wyIs251와 mnIs17에서 볼 수 있는, neurite 형태학 축 삭 또는 모 수석 보고 그냥 쉽게 확인할 수 있습니다. 신경 형태는 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	<li>동영상 파일 생성.
	<ol><li>오픈 멀티 TIFF 파일 피지 소프트웨어를 사용 하 여. 파일 이동 &#62; 오픈 단계 5.4에에서 저장 된 멀티 TIFF 파일을 선택 합니다. 
		참고: 피지는 jttps://fiji.sc에서 다운로드할 수 있습니다. 이미지 J와 플러그인 또한 kymographs를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 하는 경우 선택한 플러그인. 관련 지침에 따라</li> <li>클릭는 &#34; 사각형 선택 &#34; ( 그림 3, 화살표) 버튼과 선택 사각형을 그려서 관심 영역 으로 컴퓨터 마우스 (노란색 사각형 그림 3 A). 이미지로 이동 &#62; 스택 &#62; 도구 &#62; Substacks 고 영화에 포함 된 슬라이스 번호를 선택 하십시오. 생성 되는 substack.</li>
		<li>Substack 창을 클릭 하 여 활성화 하 고 이미지로 이동 &#62; 조정 &#62; 밝기/대비. 밝기 및 대비를 조정 하는 창이 나타난다. 창에서 슬라이드 상단 바 (최소) 오른쪽에 배경 신호 사라진다 고 두 번째 최고 (최대) 바 왼쪽 그래서 그 움직이는 소포 및 입자 볼 수 있는 배경 위에 아주 잘.</li>
		<li>이미지로 이동 &#62; 스택 &#62; Stamper 시간. 영화 단계 5.4에서에서 4 프레임/s, 기록 시간 간격 이다 0.25 s. 따라서, 입력 &#34; 0.25 &#34; 간격에서.</li>
		<li>다른 이름으로 저장을 선택 하 여 동영상 파일 생성 &#62; AVI 파일 메뉴 (영화 1, 2). 
		참고: 적절 한 플러그인을 사용 하 여 저장할 수 있습니다 파일을 다른 형식으로 같은 &#34; mpeg4 &#34; 또는 &#34; mov &#34; 파일.</li>
	</ol></li> <li>생성 kymographs.
	<ol><li>피지 소프트웨어를 사용 하 여 다시 원래의 동영상 파일을 열고 단계 5.6.2 5.6.3 밝기 및 대비를 조정 하려면 반복.</li>
		<li>클릭 &#34; 세그먼트 라인 &#34; ( 그림 3 B, 화살표). 속눈썹 또는 축 삭 (노란 선, 그림 3 B에) 따라 세그먼트 선을 그리는 마우스를 사용 하 여.</li>
		<li>이동 분석 &#62; 멀티 Kymograph &#62; 멀티 Kymograph ( 그림 3 C). 선 폭 창이 나타납니다 ( 그림 3 D). 유형 &#34; 3 &#34; 선 폭 창에서 확인을 클릭 합니다 ( 그림 3 D).</li>
		<li>Kymograph 창이 생성 됩니다. TIFF 또는 JPEG 형식으로 이미지를 저장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).</li><li>Holzbaur, E. L., Scherer, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

저자는 공개 상관이 있다.

기존의 방법에 관하여 제한 여기 설명 하는 방법은 관찰 axonal 전송 등 IFT 빠른 이벤트 최적화 됩니다. 따라서, 동원 정지는 더 이상 부 화 보다 우선 됩니다. 우리는 중요 한 섭 동 없이 적어도 20 분 동안 매매 이벤트를 관찰할 수 있다,이 방법은 않을 수 있습니다 항상 축 삭 신장 등 셀 마이그레이션 더 이상 관찰을 요구 하는 느린 이벤트를 관찰 하는 적당 한. 더 이상 관찰에 대 한 ?...

라이브 셀 이미징 세포내 수송을 분석 하기 위한 필수적인 도구입니다. 신경 세포 생물학에서 라이브 셀 이미징 axonal 전송의 분석 신경 기능과 morphogenesis1를 이해 하기 위한 필수적입니다. 결함 axonal 전송에 여러 가지 신경 장애2기반이 됩니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 수행 axonal 전송 anterogradely 그리고 retrogradely, 각각1,2.
속눈썹은 다른 세포질 격실 있는 microtubule 네트워크 및 밀매 기계는 고도로 발달된3. 단백질 종합 기계 하지 속눈썹 팁 속눈썹 단백질 세포질에서 수송 되어야 한다 즉, 속눈썹에 지역화 됩니다. 속눈썹 전용 kinesin 다, 라는 각각 kinesin-2와 세포질 다-2, 속눈썹4, intraflagellar 전송 (IFT)5라는 현상의 구성 요소를 전송. IFT의 장애 ciliopathies6라는 질병의 스펙트럼을 발생 합니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 의해 IFT 메커니즘의 분석 속눈썹 형성과 pathogenesis의 기본 메커니즘을 이해 해야 합니다.
꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 교통과 IFT7,,89공부 하기 좋은 모델입니다. 관찰 하기 위해 IFT, Chlamydomonas 은 모델 생물5,6으로 널리 사용 되었습니다. Chlamydomonas 는 단 세포 유기 체, 노화, 신경 기능과 동작 IFT의 관계 분석 하기 어려울 것 이다. 또한, CRISPR/Cas9 등 필수 유전자 기술 하지 Chlamydomonas에 적용 되었을. 높은 모델 생물, 초파리, 쥐 등 자주 axonal 교통과 IFT 중단 하면 치명적인 고기 axonal 교통과 IFT morphogenesis 및 동물 10의 항상성 위해 필수적 이기 때문에 11. 마우스의 경우 세포 배양과 transfection은 일반적으로 필요 axonal 교통과 IFT, 많은 기술 및 광범위 한 시간12,13필요를 관찰 합니다. 또한, 중요 한 생리 적 맥락을 많이 배양된 세포 및 셀 손실 수 있습니다. C. 선 충 돌연변이 axonal 전송 또는 IFT 혼란 된다 신 경계는 벌레의 생존에 필수적 이기 때문에 없습니다 종종 치명적인7,,914. Axonal 교통과 IFT 관찰할 수 있습니다 직접 vivo에서 절 개 없이 선 충 C. 투명 이며 따라서 GFP 태그 마커를 관찰 하기 쉽게 때문에.
C. 선 충, 마 취16, 또는 microbeads17미세 장치15, agarose 패드를 사용 하 여 고정을 여러 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 마 취의 포함 신경15밀매 이벤트를 억제 수 있습니다. 미세 장치 메서드는 분명 단점은 그 미세 장치를 준비 하 고 항상 쉽지 않다입니다. 대신, immobilization agarose 패드와 microbeads에 의해 C. 선 충에서 시간 경과 화상 진 찰을 수행 하는 편리 하 고 쉬운 방법 이다. 여기, 제가 설명 C. 선 충 을 무력화 하 고 시각화 axonal 전송 IFT에서 vivo에서 에서이 기본 프로토콜 C. 선 충. 다른 방법에 비해, 여기 설명 하는 방법을 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 훨씬 저렴 하 고 쉽게 수행 하는.

<table><tbody><tr><td>Slideglass (76&amp;nbsp; x 26 mm)</td><td>Matsunami</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass (22&amp;nbsp; x 40 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C024401</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wako</td><td>318-01195</td><td></td></tr><tr><td>Polystylene microbeads 0.1 micron</td><td>Polysciences</td><td>#00876</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>TAITEC</td><td>0063288-000</td><td>CTU-mini</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>widefield microscope</td></tr><tr><td>Spinning disk Scanner</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>spinning disc confocal scanner&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital CCD camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C10600-10B</td><td>ORCA-R2 degital CCD camera</td></tr><tr><td>Objective lens (x100, NA1.4)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100XO</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipette (5 inch)</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td><td>IWAKI</td><td>9820TST15-105NP</td><td></td></tr><tr><td>TV9211: &lt;em&gt;wyIs251&lt;/em&gt;</td><td>Laboratory of Kang Shen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OTL11: &lt;em&gt;mnIs17&lt;/em&gt;</td><td>Ref. 27, 29</td><td>N/A</td><td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>435064-9000-000</td><td>STEMI 508&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mirror transillumination unit</td><td>Carl Zeiss</td><td>435425-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>platinum wire (0.2 mm)</td><td>Nilaco Corporation</td><td>m78483501</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic dish</td><td>Falcon</td><td>#351007</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>nematode growth medium (NGM)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Axonal 전송 및 intraflagellar 전송 (IFT) 축 삭과 속눈썹 morphogenesis 및 기능에 대 한 필수적입니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 분자 모터를 각각 참가자 및 역행 전송 규제 있습니다. 이 모터는 레일으로 microtubule 네트워크를 사용합니다. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서공부 하는 강력한 모델 생물 이다. 나 axonal 교통과 IFT 생활에서 관찰 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, C. 선 충. 수송된 화물 화물 단백질 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 단백질을 사용 하 여 태그를 추가 하 여 구상 될 수 있다. C. 선 충 은 투명 하 고 GFP 태그 화물 단백질 세포 특정 발기인에서 특정 셀에 표현 될 수 있습니다. 살아있는 벌레 살인 또는 벌레를 마비 없이 10 %agarose 젤에 microbeads에 의해 해결할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 화물 움직임 관찰 될 수 있다 직접 축 삭 및 생활의 속눈썹에 절 개 없이 C. 선 충 . 이 메서드는 대상 단백질을 수정 하 여 셀 또는 셀에 표현에서 어떤 화물 분자의 관찰에 적용할 수 있습니다. 가장 기본적인 단백질 분자 모터 및 axonal 교통과 IFT에 관련 된 어댑터 단백질 C. 선 충에 보존 됩니다. 다른 모델 유기 체에 비해, 돌연변이 얻은 고 C. 선 충에 더 쉽게 유지. 이 메서드를 결합 하 여 다양 한 선 충 C. 돌연변이와 axonal 교통과 IFT의 분자 메커니즘 명확히 수 있습니다.

DA9 신경 axonal 전송 WyIs251 선, 참가자 및 GFP::RAB-3의 역행 axonal 수송을 사용 하 여 DA9 모터 신경에 동시에 기록 될 수 있습니다. 참가자 및 역행 DA9 신경 근 등 축 삭에서의 평균 속도 약 1.8, 2.6 μ m/s, 각각22. 움직이는 소포 수 0.03 μ s 당 축 삭의 당 0.018에 대 한 것입니다. 따라서, 100 x 렌즈를 사용 하 여 DA9 축 삭의 10 μ m의 30 s 관찰, 대 한 ...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

8.0K 조회수.  Tohoku University. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

연구

생화학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

신경과학

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

발생학

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans의 장기 성장 및 이미징을위한 간단한 미세 유체 칩

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

생체공학

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

예쁜꼬마선충(C. elegans)을 대량으로 고정시키기 위한 냉각 스테이지 건설 및 운영

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), but require strong animal immobilization to prevent motion blur in the images. Unfortunately, most current immobilization techniques require substantial manual effort, rendering high-resolution imaging low-throughput. Immobilization of C. elegans is greatly simplified by using a cooling approach that can easily immobilize entire populations directly on their cultivation plates. The cooling stage can establish and maintain a wide range of temperatures with a uniform distribution on the cultivation plate. In this article, the whole process of building the cooling stage is documented. The aim is that a typical researcher can build an operational cooling stage in their laboratory following this protocol without difficulty. Utilization of the cooling stage following three protocols is shown, and each protocol has advantages for different experiments. Also shown is an example cooling profile of the stage as it approaches its final temperature and some helpful tips in using cooling immobilization.

저자 스포트라이트: 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 배양 플레이트에 고정시키기 위한 냉각 스테이지의 조립 및 작동  

This paper describes protocols for constructing and operating a cooling stage to immobilize C. elegans on their original cultivation plates en masse.

예쁜꼬마선충을 배양 플레이트에 고정시키기 위한 냉각 단계의 조립 및 작동

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

요약

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생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

예쁜꼬마선충을 배양 플레이트에 고정시키기 위한 냉각 단계의 조립 및 작동

예쁜꼬마선충을 배양 플레이트에 고정시키기 위한 냉각 단계의 조립 및 작동