깊이 저자 박사 아 사코 스 기 모토 (도호쿠 대학) 그녀의 도움이 토론 감사합니다. wyIs251 박사 강 쉔 (스탠포드 대학)에서 관대 한 선물 했다. mnIs17 는 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금 CGC에 의해 제공 했다. 이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 #17 H 05010 및 #16 H 06536와 다이 이치 산 쿄 재단, 뇌 과학 재단과 나이토 재단에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 준비 <ol><li>생성 유전자 변형 C. 선 충 유전자 변형 방법론 18를 사용 하 여 관심사의 변형. 또는, 적절 한 긴장을 꼬마 유전학 센터 (CGC)에서 가져옵니다. 시 냅 스 소포 선구자의 axonal 전송을 시각화 하려면 유전자 변형 라인 wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] 7. IFT 관찰, 유전자 변형 라인 mnIs17 [osm 6::gfp] 19를 얻을. 이러한 긴장은이 프로토콜에 사용 됩니다. 
	참고: 중 extrachromosomal 배열, 게놈 통합, 또는 심지어 GFP 노크에 작품. 배경 신호를 줄이기 위해, 사용 하 여 셀 특정 발기인 보다는 팬-신경 발기인. 
	참고: 벌레의 유지 관리는 다른 프로토콜 20에 설명 되어 있습니다. 변종 선 충 류 성장에 Escherischia 대장균 OP50 급지대의 잔디밭에 유지 되었다 중간 (NGM) 접시 (1.7% (w/v) agarose, 50 mM NaCl, 0.25% (w/v) 펩, 1mm CaCl 2, 5mg/mL 콜레스테롤, 25mm KH 2 포 4, 1mm MgSO 60 mm 직경 플라스틱 접시에 4) 20 ° c.</li>
	<li>성장 벌레의 어떤 라이프 사이클 단계로 NGM 접시에 20 ° C에서 웜. 
	참고: 모든 단계에서 axonal 교통과 IFT를 관찰할 수 있다 하나. 여러 게시 이러한 단계와 시각화 된 밀매 이벤트 14 , , 21 22 사용 하기 때문에 젊은 성인 늦은 L4 좋은 긍정적인 통제는 , 23.</li>
</ol> 2. 10%의 준비 Agarose 참고: 한 천, 한 천 분말, agarose 등 유사한 제품을 제공 하는 많은 공급 업체. 전기 이동 법 학년 agarose를 사용 하 여 (강도 젤 &#62; 1200 g/c m 2). 저렴 한 천 분말 결과 젤은 충분히 강한 벌레를 무력화 하기 때문에 작동 하지 않습니다.
<ol><li>믹스 0.4 g agarose 4에서 mL 증류수 (DW) 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m). 뚜껑을 증발을 피하기 위해 유리 튜브에 넣어.</li>
	<li>90 분 동안 95 ° C 열 블록에 유리 튜브를 넣어. 또한, 다른 유리 튜브 (1.5 c m x 10.5 c m) DW 가득 준비 하 고 95에서 계속 ° C. 넣어 파스퇴르 피펫으로 95 ° C DW ( 그림 1 A). 작은 거품을 많이 agarose 튜브에서 볼 것 이다 그리고 솔루션 탁 되어야 합니다. 솔루션 취소 될 때까지 놔 둬. 다음, agarose 솔루션 균질 될 때까지 아래로 pipetting 혼합. 
	참고: 전자 레인지 10 %agarose 솔루션 DW agarose에서 만든 때를 준비 하는 사용할 수 없습니다. 전자 레인지에 의해 발생 하는 작은 거품 agarose 녹는 것을 방지 합니다. 그러나, 응고 10 %agarose 젤 수 있습니다 쉽게 될 녹아 전자 레인지를 사용 하 여 다시. 10 %agarose 젤을 포함 하는 유리 튜브 미리 준비 하 고 6 개월 이상 4 ° C에서 저장 수 있습니다. 이렇게 필요할 때 전자 레인지를 사용 하 여 주식을 용 해 하 고이 프로토콜의 3 단계에서 시작. 
	참고: Agarose 점차적으로 또는 반복된 응고 및 용 해 후 오랜 시간 동안 95 ° C에서 incubated 경우 응고 능력을 잃는다. 이 경우, 준비 새로운 10 %agarose.</li>
</ol> 3. Agarose 패드의 준비 <ol><li>따뜻하게 파스퇴르 피펫으로 단계 2.2에서에서 준비를 사용 하 여 76 x 22 mm 슬라이드 위에 2 방울 10 %agarose.</li>
	<li>빨리 agarose 강하 하기 전에 두 번째 76 x 22 m m 2 슬라이드 커버 굳은 에서처럼 그림 1 B, 그리고 밀어 아래로 두 번째 슬라이드에 agarose 솔루션을 평평 하 게. 두께 0.5-1 이어야 한다 m m.</li>
	<li>신속 하 게 파스퇴르 피펫으로 여 플러시 pipetting 95 ° C DW 위아래로 agarose 솔루션은 밖으로 세척 될 때까지. 그렇지 않으면,는 피펫으로 agarose 젤에 의해 막힌 될 것입니다. 95 ° C DW에에서 피 펫 서 둡니다.</li>
	<li>잠깐 1 분입니다. Agarose 패드 고 흐린 되. 그런 다음 ( 그림 1 C) 손으로 떨어져 슬라이드 슬라이드.</li>
</ol> 4. 벌레의 장착 참고:도 적은 양의 웜 운동 방지 좋은 관찰. Levamisole는 agarose 패드 24 , 25에 웜 움직임을 방지 하기 위해 전통적으로 사용 되었습니다. 그러나, Levamisole C. 선 충에 있는 신경 수용 체를 억제 하 고 따라서 신경 15 밀매 이벤트에 영향을 미칠 수 있습니다. Hereis 좋은 대체 17 설명 사용 하 여 폴리스 티 렌 microbeads.
<li><ol>Slidable 미러 transillumination를 장착 스테레오 현미경, 전송 ~ 30 새로운 NGM 적절 한 표시자를 표현 하는 유전자 변형 웜 접시 없이 박테리아 백 금 철사를 사용 하 여 선택. 
	참고: 백 금 철사 선택 백 금 철사 및 만든 파스퇴르 피 펫 (5 인치), 그리고 백 금 철사의 끝이 평평 했다. 백 금 철사 추천의 준비 및 취급이 벌레의 Wormbook (http://www.wormbook.org)에 설명 되어 있습니다.</li>
	<li>접시를 두고 1 분 박테리아는 자동으로 제거 됩니다 벌레의 표면에서 벌레 세균 없이 NGM agarose 젤에 이동.</li>
	<li>넣어는 0.5-1.0 µ L의 2.6 %100 nm 직경 폴리스 티 렌 microbeads 천 패드 ( 그림 1 D)에 물에 드롭. 박테리아 없는 NGM 플레이트의 10-20 벌레는 microbeads에 전송. 방울과 백 금 철사를 사용 하 여 벌레의 중복을 피하기 위해 선택 확산 벌레 시체 ( 그림 1 E).</li>
	<li>22 x 40 m m 2 coverslip ( 그림 1 F) 적용 됩니다. 공기 방울을 제거 하지만 분쇄 웜 방지 부드럽게 밀어. 샘플은 지금 영상에 대 한 준비. 
	참고: 아무 마 취 관리 때문에 벌레만 천 패드, 폴리스 티 렌 microbeads coverslip 17에 의해 생성 된 마찰 힘에 의해 고정 됩니다. 급지대 박테리아 너무 많은 솔루션의 존재는 마찰 힘 약한 하게된다. 
	참고: (예를 들어, 22 x 22 m m 2, 18 x 18 m m 2) coverslips의 다른 크기를 작동합니다. 그러나, 더 큰 coverslips 침수 물 또는 오일 샘플 관찰 하는 동안 유출 대물 렌즈에서 방지할 수 있습니다.</li>
</ol> 5. 관찰 참고: 적절 한 이미징 매개 변수 (레이저 전력, 이득, 범주화, 등) 각 현미경 시스템 및 카메라에 대 한 다를 것 이다. 여기, 회전 디스크 confocal 스캐너와 디지털 CCD 카메라 widefield 현미경 사용 됩니다.
<ol><li>20 ° c, 무대의 온도 제어를 설정 하거나 조정 실내 온도 20 ° c.</li>
	<li>샘플 슬라이드를 현미경 무대 위에. 100 x를 사용 하 여 (수 가늠 구멍 = 1.3 또는 더 나은) 렌즈.</li>
	<li> 그림 2 A (wyIs251 및 axonal 전송) 또는 그림 2 B (mnIs17와 IFT) 긍정적인 컨트롤에 표시 된 영역에 대 한 보고 . 다른 분야는 잘 22로 분석 될 수 있다.</li>
	<li>세트 매개 변수 (CCD 이득 = 200, Binning = 1 또는 2, 488에서 레이저 전원 nm = 1.0-1.3 mW). 시간 경과 기록 4 프레임/s에서 최대 1 분 mutli-TIFF 형식으로 파일 저장에 대 한 수행. 
	참고: 경우 GFP 신호 사라지고 GFP::RAB 3 또는 OSM 6::GFP 30에 대 한 관찰을 계속 하기가 s, 레이저 힘이 너무 강해. 이 경우, 레이저 파워를 줄일 수 있습니다. 반대로, 기공을 운동 기록 레이저 파워는 너무 약하다. 이 경우, 레이저 파워 증가.</li>
	<li>다른 벌레를 관찰 하 고 5.3 및 5.4 반복. 관측 최대 20 분 동안 지난 수 있습니다 하지만 각 웜 p의 효과 피하기 위해 한 번만 기록해 야hoto 손상. 
	참고: 중요 한 결함 7 , , 27 28 없이 적어도 20 분 동안 벌레 관찰 되었습니다. 더 이상 관찰 가능 피난처 있을 수 있습니다 &#39; t 되었습니다 아직 테스트. 신경 죽음의 명확한 표시 neurite 붓기 같은 신경 형태학의 변화 이다. 약한 GFP 신호는 축 삭과 dendrites wyIs251와 mnIs17에서 볼 수 있는, neurite 형태학 축 삭 또는 모 수석 보고 그냥 쉽게 확인할 수 있습니다. 신경 형태는 그림 2에 표시 됩니다.</li>
	<li>동영상 파일 생성.
	<ol><li>오픈 멀티 TIFF 파일 피지 소프트웨어를 사용 하 여. 파일 이동 &#62; 오픈 단계 5.4에에서 저장 된 멀티 TIFF 파일을 선택 합니다. 
		참고: 피지는 jttps://fiji.sc에서 다운로드할 수 있습니다. 이미지 J와 플러그인 또한 kymographs를 생성 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이렇게 하는 경우 선택한 플러그인. 관련 지침에 따라</li> <li>클릭는 &#34; 사각형 선택 &#34; ( 그림 3, 화살표) 버튼과 선택 사각형을 그려서 관심 영역 으로 컴퓨터 마우스 (노란색 사각형 그림 3 A). 이미지로 이동 &#62; 스택 &#62; 도구 &#62; Substacks 고 영화에 포함 된 슬라이스 번호를 선택 하십시오. 생성 되는 substack.</li>
		<li>Substack 창을 클릭 하 여 활성화 하 고 이미지로 이동 &#62; 조정 &#62; 밝기/대비. 밝기 및 대비를 조정 하는 창이 나타난다. 창에서 슬라이드 상단 바 (최소) 오른쪽에 배경 신호 사라진다 고 두 번째 최고 (최대) 바 왼쪽 그래서 그 움직이는 소포 및 입자 볼 수 있는 배경 위에 아주 잘.</li>
		<li>이미지로 이동 &#62; 스택 &#62; Stamper 시간. 영화 단계 5.4에서에서 4 프레임/s, 기록 시간 간격 이다 0.25 s. 따라서, 입력 &#34; 0.25 &#34; 간격에서.</li>
		<li>다른 이름으로 저장을 선택 하 여 동영상 파일 생성 &#62; AVI 파일 메뉴 (영화 1, 2). 
		참고: 적절 한 플러그인을 사용 하 여 저장할 수 있습니다 파일을 다른 형식으로 같은 &#34; mpeg4 &#34; 또는 &#34; mov &#34; 파일.</li>
	</ol></li> <li>생성 kymographs.
	<ol><li>피지 소프트웨어를 사용 하 여 다시 원래의 동영상 파일을 열고 단계 5.6.2 5.6.3 밝기 및 대비를 조정 하려면 반복.</li>
		<li>클릭 &#34; 세그먼트 라인 &#34; ( 그림 3 B, 화살표). 속눈썹 또는 축 삭 (노란 선, 그림 3 B에) 따라 세그먼트 선을 그리는 마우스를 사용 하 여.</li>
		<li>이동 분석 &#62; 멀티 Kymograph &#62; 멀티 Kymograph ( 그림 3 C). 선 폭 창이 나타납니다 ( 그림 3 D). 유형 &#34; 3 &#34; 선 폭 창에서 확인을 클릭 합니다 ( 그림 3 D).</li>
		<li>Kymograph 창이 생성 됩니다. TIFF 또는 JPEG 형식으로 이미지를 저장.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177-206 (2012).</li><li>Kumar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+Kinesin-3+motor+UNC-104/KIF1A+is+degraded+upon+loss+of+specific+binding+to+cargo.">The Caenorhabditis elegans Kinesin-3 motor UNC-104/KIF1A is degraded upon loss of specific binding to cargo.</a> PLoS Genet. 6 (11), 1001200 (2010).</li><li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vesicle+protein+SAM-4+regulates+the+processivity+of+synaptic+vesicle+transport.">The vesicle protein SAM-4 regulates the processivity of synaptic vesicle transport.</a> PLoS Genet. 10 (10), 1004644 (2014).</li><li>Blacque, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WD+repeat-containing+protein+IFTA-1+is+required+for+retrograde+intraflagellar+transport.">The WD repeat-containing protein IFTA-1 is required for retrograde intraflagellar transport.</a> Mol Biol Cell. 17 (12), 5053-5062 (2006).</li><li>Evans, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modulation+of+IFT+kinesins+extends+the+sensory+repertoire+of+ciliated+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Functional modulation of IFT kinesins extends the sensory repertoire of ciliated neurons in Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biol. 172 (5), 663-669 (2006).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Prevo, B., Mangeol, P., Oswald, F., Scholey, J. M., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+differentiation+of+cooperating+kinesin-2+motors+orchestrates+cargo+import+and+transport+in+C.+elegans+cilia.">Functional differentiation of cooperating kinesin-2 motors orchestrates cargo import and transport in C. elegans cilia.</a> Nat Cell Biol. 17 (12), 1536-1545 (2015).</li><li>Robison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detyrosinated+microtubules+buckle+and+bear+load+in+contracting+cardiomyocytes.">Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes.</a> Science. 352 (6284), 0659 (2016).</li><li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics.">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Mol Biol Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li></ol>

저자는 공개 상관이 있다.

기존의 방법에 관하여 제한 여기 설명 하는 방법은 관찰 axonal 전송 등 IFT 빠른 이벤트 최적화 됩니다. 따라서, 동원 정지는 더 이상 부 화 보다 우선 됩니다. 우리는 중요 한 섭 동 없이 적어도 20 분 동안 매매 이벤트를 관찰할 수 있다,이 방법은 않을 수 있습니다 항상 축 삭 신장 등 셀 마이그레이션 더 이상 관찰을 요구 하는 느린 이벤트를 관찰 하는 적당 한. 더 이상 관찰에 대 한 ?...

라이브 셀 이미징 세포내 수송을 분석 하기 위한 필수적인 도구입니다. 신경 세포 생물학에서 라이브 셀 이미징 axonal 전송의 분석 신경 기능과 morphogenesis1를 이해 하기 위한 필수적입니다. 결함 axonal 전송에 여러 가지 신경 장애2기반이 됩니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 수행 axonal 전송 anterogradely 그리고 retrogradely, 각각1,2.
속눈썹은 다른 세포질 격실 있는 microtubule 네트워크 및 밀매 기계는 고도로 발달된3. 단백질 종합 기계 하지 속눈썹 팁 속눈썹 단백질 세포질에서 수송 되어야 한다 즉, 속눈썹에 지역화 됩니다. 속눈썹 전용 kinesin 다, 라는 각각 kinesin-2와 세포질 다-2, 속눈썹4, intraflagellar 전송 (IFT)5라는 현상의 구성 요소를 전송. IFT의 장애 ciliopathies6라는 질병의 스펙트럼을 발생 합니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 의해 IFT 메커니즘의 분석 속눈썹 형성과 pathogenesis의 기본 메커니즘을 이해 해야 합니다.
꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 교통과 IFT7,,89공부 하기 좋은 모델입니다. 관찰 하기 위해 IFT, Chlamydomonas 은 모델 생물5,6으로 널리 사용 되었습니다. Chlamydomonas 는 단 세포 유기 체, 노화, 신경 기능과 동작 IFT의 관계 분석 하기 어려울 것 이다. 또한, CRISPR/Cas9 등 필수 유전자 기술 하지 Chlamydomonas에 적용 되었을. 높은 모델 생물, 초파리, 쥐 등 자주 axonal 교통과 IFT 중단 하면 치명적인 고기 axonal 교통과 IFT morphogenesis 및 동물 10의 항상성 위해 필수적 이기 때문에 11. 마우스의 경우 세포 배양과 transfection은 일반적으로 필요 axonal 교통과 IFT, 많은 기술 및 광범위 한 시간12,13필요를 관찰 합니다. 또한, 중요 한 생리 적 맥락을 많이 배양된 세포 및 셀 손실 수 있습니다. C. 선 충 돌연변이 axonal 전송 또는 IFT 혼란 된다 신 경계는 벌레의 생존에 필수적 이기 때문에 없습니다 종종 치명적인7,,914. Axonal 교통과 IFT 관찰할 수 있습니다 직접 vivo에서 절 개 없이 선 충 C. 투명 이며 따라서 GFP 태그 마커를 관찰 하기 쉽게 때문에.
C. 선 충, 마 취16, 또는 microbeads17미세 장치15, agarose 패드를 사용 하 여 고정을 여러 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 마 취의 포함 신경15밀매 이벤트를 억제 수 있습니다. 미세 장치 메서드는 분명 단점은 그 미세 장치를 준비 하 고 항상 쉽지 않다입니다. 대신, immobilization agarose 패드와 microbeads에 의해 C. 선 충에서 시간 경과 화상 진 찰을 수행 하는 편리 하 고 쉬운 방법 이다. 여기, 제가 설명 C. 선 충 을 무력화 하 고 시각화 axonal 전송 IFT에서 vivo에서 에서이 기본 프로토콜 C. 선 충. 다른 방법에 비해, 여기 설명 하는 방법을 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 훨씬 저렴 하 고 쉽게 수행 하는.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Slideglass (76&#160; x 26 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">S1111</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Coverglass (22&#160; x 40 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Matsunami</td>
			<td style="width:139px;">C024401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Agarose</td>
			<td style="width:167px;">Wako</td>
			<td style="width:139px;">318-01195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Polystylene microbeads 0.1 micron</td>
			<td style="width:167px;">Polysciences</td>
			<td style="width:139px;">#00876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Heat block</td>
			<td style="width:167px;">TAITEC</td>
			<td style="width:139px;">0063288-000</td>
			<td>CTU-mini</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Microscope</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX-71</td>
			<td>widefield microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Spinning disk Scanner</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:139px;">CSU-X1</td>
			<td>spinning disc confocal scanner&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Digital CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Hamamatsu Photonics</td>
			<td style="width:139px;">C10600-10B</td>
			<td>ORCA-R2 degital CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Objective lens (x100, NA1.4)</td>
			<td style="width:167px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">UPLSAPO 100XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Pasteur pipette (5 inch)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">IK-PAS-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm)</td>
			<td style="width:167px;">IWAKI</td>
			<td style="width:139px;">9820TST15-105NP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">TV9211: wyIs251</td>
			<td style="width:167px;">Laboratory of Kang Shen</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">OTL11: mnIs17</td>
			<td style="width:167px;">Ref. 27, 29</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">435064-9000-000</td>
			<td>STEMI 508&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mirror transillumination unit</td>
			<td style="width:167px;">Carl Zeiss</td>
			<td>435425-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">platinum wire (0.2 mm)</td>
			<td style="width:167px;">Nilaco Corporation</td>
			<td style="width:139px;">m78483501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm plastic dish</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">#351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Fiji</td>
			<td style="width:167px;">N/A</td>
			<td style="width:139px;">N/A</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">nematode growth medium (NGM)&#160;&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immobilization of caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons

Axonal 전송 및 intraflagellar 전송 (IFT) 축 삭과 속눈썹 morphogenesis 및 기능에 대 한 필수적입니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 분자 모터를 각각 참가자 및 역행 전송 규제 있습니다. 이 모터는 레일으로 microtubule 네트워크를 사용합니다. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서공부 하는 강력한 모델 생물 이다. 나 axonal 교통과 IFT 생활에서 관찰 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, C. 선 충. 수송된 화물 화물 단백질 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 단백질을 사용 하 여 태그를 추가 하 여 구상 될 수 있다. C. 선 충 은 투명 하 고 GFP 태그 화물 단백질 세포 특정 발기인에서 특정 셀에 표현 될 수 있습니다. 살아있는 벌레 살인 또는 벌레를 마비 없이 10 %agarose 젤에 microbeads에 의해 해결할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 화물 움직임 관찰 될 수 있다 직접 축 삭 및 생활의 속눈썹에 절 개 없이 C. 선 충 . 이 메서드는 대상 단백질을 수정 하 여 셀 또는 셀에 표현에서 어떤 화물 분자의 관찰에 적용할 수 있습니다. 가장 기본적인 단백질 분자 모터 및 axonal 교통과 IFT에 관련 된 어댑터 단백질 C. 선 충에 보존 됩니다. 다른 모델 유기 체에 비해, 돌연변이 얻은 고 C. 선 충에 더 쉽게 유지. 이 메서드를 결합 하 여 다양 한 선 충 C. 돌연변이와 axonal 교통과 IFT의 분자 메커니즘 명확히 수 있습니다.

DA9 신경 axonal 전송 WyIs251 선, 참가자 및 GFP::RAB-3의 역행 axonal 수송을 사용 하 여 DA9 모터 신경에 동시에 기록 될 수 있습니다. 참가자 및 역행 DA9 신경 근 등 축 삭에서의 평균 속도 약 1.8, 2.6 μ m/s, 각각22. 움직이는 소포 수 0.03 μ s 당 축 삭의 당 0.018에 대 한 것입니다. 따라서, 100 x 렌즈를 사용 하 여 DA9 축 삭의 10 μ m의 30 s 관찰, 대 한 ...

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Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

immobilization-caenorhabditis-elegans-to-analyze-intracellular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

7.9K 조회수.  Tohoku University. The overall goal of this time lapse recording is to observe the intracellular transport events in Caenorhabditis elegans neurons.This method can help answer key questions in the cell biology field such as axonal transport and interflagellar transport.The main advantage of this technique is that one can observe intracellular transport in C.Elegans without dissection.Start this experiment by growing transgenic C.elegans strain of interest at 20

비디오: Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

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The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

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Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...