This research was supported by the NIH Common Fund and Intramural Research Program of the National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases.

1. 지하실 막 매트릭스의 준비 및 plasticware에의 코팅 <ol><li> 얼음에 -20 ° C에서 냉동 기저막 매트릭스 스톡을 넣고 4 ℃에서 밤새 해동. </li><li> 해동 후, 미리 차게 에펜 도르프 튜브에 기저막 매트릭스의 피펫 2 mg을 분취. 필요할 때까지 -20 ° C에서 이러한 보관하십시오. </li><li> , 기저막 매트릭스 코팅 된 플레이트를 준비 에펜 도르프 튜브 사라 얼음의 마지막 조각 (보통 2 ~ 내 시간)까지 얼음에 하나 나누어 해동합니다. </li><li> 해동 후, 기저막 매트릭스 코팅 용액을 차가운 (5 ° C) DMEM / F12 12 ml의 기저막 매트릭스를 추가한다. </li><li> 적절한 배양 용기에 기저막 매트릭스 솔루션을 추가한다. 6 잘 플레이트를 들어, 잘 당 1 ml의 분배. 기저막 매트릭스 솔루션은 완전하게 잘 다루고 있는지 확인하기 위해 판을 소용돌이. </li><li> 파라 필름은 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시를 밀봉하고, 루 부화사용하기 전에 1 시간 동안 m 온도. 또한, 매장 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 4 ° C에서 요리와 코팅 2 주 이내에 사용한다. 참고 : 건조를 방지하기 위해 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 / 접시에 추가 DMEM / F12를 추가합니다. 39 ° C 보관 기저막 매트릭스 - 코팅판 / 접시를 사용하기 전에 생물학적 안전 캐비넷에 배치하고 적어도 30 분 동안 실온에 올 수있다. </li><li> 완전 배지 및 세포의 첨가 이전 대기음 기저막 매트릭스. </li></ol> E8 매체의 제조 2 <ol><li> 4 ℃에서 하룻밤 E8 보충을 해동하여 E8 문화 매체를 준비합니다. </li><li> 500 ml의 재고에서 E8 기초 10 ml의 배지를 제거하고 폐기합니다. </li><li> 직접 E8 기초 배지 490 ml의에 E8 보충의 전체 10 ml의 유리 병을 피펫. 반복 온도 변동 공단에서 bFGF에 저하 될 수로서, 37 ° C 물욕없는 따뜻한 완전한 E8 매체를 수행TE E8 매체. </li><li> 보충 또한 2 주 이내에 완료 E8 매체를 사용합니다. </li></ol> iPSCs 3. 해동 <ol><li> 드라이 아이스에 액체 질소와 장소에서 냉동 iPSCs의 병을 제거합니다. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 유리 병을 해동; 얼음 유적의 아주 작은 조각까지 수조의 유리 병을 소용돌이 친다. </li><li> 생물 안전 캐비닛에 70 % 에탄올 및 전송을 유리 병 스프레이. </li><li> 직접 유리 병에 실온 E8 매체 적가의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 2 ㎖를 피펫을 사용하여, 15ml의 원뿔형 튜브에 E8 배지 9 ㎖ 중에 세포 현탁액을 적가 옮긴다. 세포와 매체가 신속하게 잘 혼합되도록 자주 튜브를 소용돌이. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 세포를 원심 분리기. </li><li> 상등액을 흡인하고, 10 μM Y-27632로 보충 E8의 적절한 부피 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 지하의 적절한 숫자로 셀을 추가 membran하룻밤 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 전자 매트릭스 코팅 우물과 장소. 그것은 해동 후 신속한 복구를 가능하게하는 6 웰 플레이트의 웰 당 최소 0.2 × 10 6 IPSC을 도금하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 유지 보수 및 i​​PSCs의 일상과 Passaging <ol><li> 매일 E8 매체를 새로 고칩니다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 형태와 세포의 포화 상태를 모니터링합니다. 높은 품질의 iPSCs는 별개의 테두리 평면 식민지에서 성장; 개별 식민지는 &quot;조약돌 같은&quot;모양을 가지고있다. </li><li> 통로 iPSCs 세포들은 70 % ~ 포화 상태에 도달 할 때. </li><li> 0.9 g의 NaCl 500 ML의 DPBS에 500 ㎕의 0.5 M EDTA를 추가하여 EDTA의 계대 솔루션을 준비합니다. NaCl을 살균하고, 진공 필터를 용해 잘 섞는다. 계대 이전에 37 ° C의 물을 용기에 계대 용액의 분취 량을 따뜻하게. </li><li> 통로, 기음 문화 매체를 소비하고 따뜻한 싶어서 같은 부피로 한 번 세포를 씻어솔루션을 징. 코트에 대기음, 피펫 충분히 EDTA 계대 솔루션 세포 (6 웰 플레이트의 웰 당 1 mL)를 첨가 하였다. </li><li> 거꾸로 현미경으로 세포를 놓고 IPSC 식민지를 관찰합니다. 자란 콜로니 테두리 내의 구멍의 모양은 2 내지 5 분 이내에 분명해질 것이다. </li><li> 조심스럽게 EDTA의 계대 솔루션을 대기음. </li><li> 직접 잘 계대 할 각에 고압 (6 웰 플레이트를 사용하는 경우) 10ml를 피펫을 사용하여, E8 매체의 4 ml의 분배. </li><li> IPSC 덩어리를 수집하고, 1 ~ 분할 비에 따라 웰의 적절한 개수로 분할 : 1:12 8. 오버 피펫으로 세포 덩어리의 세분화는 가난한 생존 발생합니다하지 마십시오. </li><li> 인큐베이터에서 플레이트를 배치하고, 세포를 분산시키는 전후 및 좌우로 수회 플레이트 바위. </li></ol> Tansfection에 대한 MEFs에와 iPSCs 5. 준비 <ol><li> transfectio하기 48 시간 전에N, 통로 iPSCs는 ~ 1 : 지하실 막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트의 네 개 이상의 우물에 6 그들은 이일 때문에 70 % 융합 될 수 있도록. </li><li> 다음 날, 10 % FBS 및 1X MEM-NEAA 보충 DMEM (높은 포도당)로 구성된 MEF 매체에 DR4 MEFs에 해동. </li><li> ~ 2 × 104 세포 / cm 2에서 2 개의 10-cm 요리에 플레이트 DR4 MEFs에와 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 형질의 날, 30 분 iPSCs에 형질 전환을 수행하기 전에 10 μM Y-27632 보충 E8에 MEF 매체를 변경합니다. </li><li> 옵션 : iPSCs 후 형질의 유세포 분석이 필요한 경우, 실온에서 기저막 매트릭스 코팅 4 ° C 접시와 장소를 제거합니다. </li><li> 선택적 : 4 시간에 형질 감염 전 10 μM의 최종 농도 Y-27632 미리 형질 IPSC 배양을 보충. </li></ol> 6. 부드러운 세포 해리 시약 처리차 형질은 iPSCs의 일렉트로 시스템을 사용하여 <ol><li> 4 ° C에서 P3 일차 전지 형질 솔루션을 꺼내 ~ 실온에 30 분을 제공 할 수 있습니다. 사용하기 전에 형질 전환 솔루션으로 전체 100 μL 보충제를 추가합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 부드러운 세포 분리 시약. </li><li> AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 및 PZT-AAVS1-R1) -20 ° C에서와 AAVS1 - CAG-EGFP 기증자를 구합니다. </li><li> 인큐베이터에서 iPSCs를 제거하고 DPBS 한 번 씻는다. </li><li> 웰 당 부드러운 세포 해리 시약 1 mL를 넣고 5 분 동안 37 ° C에서 배양 한 iPSCs, 또는 세포의 50 % 초과가 배양 용기로부터 해리 될 때까지. </li><li> 위로 배양 용기에 남아있는 모든 세포를 해리하고, IP​​SC 덩어리를 깨고 P1000 피펫을 사용하여 몇 번 아래로 세포를 피펫. </li><li> 푸르트에 10 ml의 피펫을 사용하여 각 웰에 E8 매체의 2 mL를 넣고 피펫 위아래로 여러 번어 하나의 세포로 세포 덩어리들을 분해 주 : 세포 덩어리가 충분히 세분화하지 않다면 형질 효율이 크게 감소한다. </li><li> 3 분 100 XG에 15 ML 원뿔 관에서 iPSCs, 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> E8 매체의 최소량 대기음 상등액과 세포를 재현 탁. </li><li> 중요한 얼룩과 같은 0.4 % 트리 판 블루의 신청 후 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. ( &quot;덩어리&quot;1-3 셀)을 계산하는 동안 세포가 충분히 해리되어 있는지 확인합니다. </li><li> 두 15 ML 원뿔 튜브에 각각 3 × 10 6 세포를 분배하고, 3 분 동안 100 XG에서 다시 스핀 다운. 주 : 저속 원심 분리 세포 스트레스를 줄이고 전기 전에 iPSCs 쉽게 재 현탁한다. </li><li> 인간 배아 줄기 세포주 H9 (프로그램 CB-150)에 대한 세포 형 특정 프로그램에 전기 천공 시스템을 설정한다. </li><li> 원심 분리 후, CEL에서 뜨는을 대기음L 펠렛. 한 펠렛, 제어 샘플로 HR 기증자의 10 μg의를 추가합니다. 다른 펠렛의 5 μg의와 함께 HR 기증자의 10 μg의를 추가, 각 실험 시료로 TALEN (PZT-AAVS1-L1 및 PZT-AAVS1-R1). </li><li> P3 일차 세포 형질 감염 용액 100 ㎕ 각각의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 큐벳에 옮긴다. </li><li> 형질 전환을 수행하고 즉시 각 큐벳에 실온 E8 매체의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 5.4에서 준비 DR4의 MEFs에를 포함 한 10 cm 접시에 형질 전환 iPSCs 적하을 전송합니다. </li><li> 옵션 : 형질 전환 효율의 anaylsis 유동 세포 계측법이 필요한 경우 기저막 매트릭스 코팅 6 웰 플레이트 잘 하나에 각 실험에서 몇 방울을 추가합니다. </li><li> 반복은 모두 샘플을 완료 6.15-6.17 단계를 반복합니다. 다음 날, DPBS로 세포를 두 번 씻어 E8보다 피더에 더 IPSC 문화를 지원하기 위해 나타납니다 NutriStem에 문화 매체를 전환합니다. </li><li> TR48 시간 포스트 형질 72에서 ansient EGFP 발현 피크; 원하는 형질 전환 효율을 평가. </li></ol> 표적으로 iPSCs 7. 퓨로 마이신 선택 <ol><li> iPSCs는 70 % 포화 상태에 도달하면 퓨로 마이신 선택을 형질 전환 후 72 시간을 시작합니다. </li><li> NCRM5 iPSCs를 들어, NutriStem 배양 배지로 희석하여 0.5 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신 (1/2 전체 용량)에서 퓨로 마이신 선택을 시작합니다. 최적의 퓨로 마이신 농도는 0.25에서 일부 IPSC 라인 1 ㎍ / MLL에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 매일 매체를 새로 고침 3 일간 NutriStem + 0.5 ㎍ / ㎖의 퓨로 마이신의 문화 iPSCs. </li><li> 삼일 후, 1 ㎍ / ml의 퓨로 마이신의 농도를 증가시킨다. </li><li> / ㎖의 퓨로 마이신 선택 1 μg의 아래 문화 iPSCs 다른 7~8일에 대한, 또는 때까지 별개의 식민지는 식민지 따기위한 충분 나타납니다. </li></ol> 8. 식민지 따기 및 대상 iPSCs의 확장 <ol><li> 사용 기저막코팅하는 매트릭스로 각 웰 (12 ㎖의 DMEM / F12에 희석이 MG 기저막 매트릭스) 기저막 매트릭스 코팅 용액 50 μL를 분배하여 96- 웰 플레이트. 4 ° C에서 하룻밤 사용하기 전에 판을 보관하십시오. </li><li> 기저막 기질 - 코팅 플레이트를 실온으로 온시킨 후, 기저막 매트릭스 대기음 10 μM Y-27632를 각 웰에 100 ㎕를 첨가하여 분배 E8. </li><li> 생물 안전 캐비닛에 거꾸로 현미경을 배치하고 소독 70 % EtOH로 가볍게 스프레이. </li><li> 끝에 작은 &quot;훅&quot;가 이상적인 식민지 따기 도구를 얻기 위해 분젠 버너 위에 유리 파스퇴르 피펫을 당깁니다. 70 % EtOH로 소독하고 건조 후드에 배치합니다. </li><li> 인큐베이터에서 대상 IPSC 식민지를 포함하는 요리를 제거하고 현미경으로 후드에 배치합니다. </li><li> 식민지 따기 도구를 사용하여 식민지 국경 주위에 원을 추적하여 iPSCs를 선택합니다.</li><li> 부드럽게 긁어 판의 표면에서 IPSC 식민지를 제거 식민지 따기 도구의 &quot;훅&quot;를 사용합니다. 큰 콜로니를 들어, 콜로니 재 도금 후 세포 성장을 용이하게 분기에 콜로니 피킹 도구 X 드로잉. </li><li> 세포 덩어리가 분리 자유롭게 떠되면, iPSCs를 수집 ~ 30 μl를 설정 P200의 피펫을 사용합니다. 직접 96 웰 플레이트에 플레이트 세포. </li><li> 옵션 : 다음 37 ℃에서 5 분 동안 소화 50 μL 부드러운 세포 분리 시약을 추가, 에펜 도르프 튜브에 iPSCs를 수집 ~ 5 μL로 설정 P20 피펫을 사용합니다. 소화 후, 부드러운 세포 해리 시약 희석시키고 5 분 동안 표준 테이블 탑 마이크로 원심 200 XG에서 세포를 스핀 다운 에펜 도르프 튜브에 500 μL E8 배지를 추가한다. 그런 매체의 대부분을 대기음 ~ 재현 탁하고 96 웰 플레이트에 세포를 전달하는 30 μl를 떠난다. 참고 :이방법은 세포 덩어리와 촬상 콜로니의 빠른 팽창 해리를 촉진 할 것이다. </li><li> IPSC 식민지 충분한 수의 수집 될 때까지 식민지 따기 계속 (약 실험 당 20 ~ 30 식민지 권장). </li><li> 식민지 따기 후, 하룻밤 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배치합니다. 전체 E8 매체 다음날, 문화 ~ 70 %까지 합류로 새로 고칩니다. </li><li> 로 96 웰에서 통과 세포를 24- 웰, 다음에 6 자, 단계 4.5-4.10에 설명 된대로. 주 : 6- 웰 플레이트 웰보다도 작은 사용시 EDTA 용액 및 E8 매체의 볼륨이 감소 될 비례한다. </li><li> 무작위로 삽입 된 벡터 (16)의 타겟 카세트 통합 및 부재를 확인하기 위해 접합 PCR 남부 오 점 분석에 의해 표적으로 성공을 평가합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

(1) 효율적으로 형질 전환에 의해 iPSCs에 TALEN 및 기증자 플라스미드를 전달; AAVS1 안전 항구의 성공적인 세대를위한 가장 중요한 단계는 인간의 iPSCs가되는 대상 (2) 형질 전환 후 형질 전환 및 도금 밀도 전에 단일 세포로 iPSCs의 분리를 최적화; (3) 투여 량 및 IPSC 라인의 성장에 기초한 약물 - 선택 시간을 최적화; (4)주의 깊게 해부 및 대상 식민지를 따기와 / 웰 새 접시에 전송. Hockemeyer의 용지 (10...

배아 줄기 세포와 유사한 유도 만능 줄기 세포로 (iPSCs)를 인간의 체세포를 재 프로그램 할 수있는 기능이 처음 다카하시 등에 의해 발견되었다. 2007 1. 레트로 바이러스는 네 개의 전사 인자를 발현하는 형질 도입 인간 피부 섬유 아세포 (소위 불리는 야마나카는 OCT3 요인 / 4, SOX2, C-Myc와, 그리고 Klf4)는 형태, 증식, 유전자 발현 및 후생 유전 학적 상태에 따라 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기)에 매우 유사한 것으로 나타났다; 결정적 iPSCs 또한 모든 세 배엽 (1)의 세포로 분화 할 수있다. iPSCs의 증식 잠재력과 차별화 용량은 그들에게 매우 매력적인 도구를 만드는; 특정 질병을 앓고있는 환자로부터 세포를 재 프로그래밍함으로써 iPSCs 체외 질병 모델 시스템과 같은 잠재적 치료제로서 모두 사용될 수있다. 후자의 목적을 위해, 몇 가지 문제 iPSCs의 잠재력하기 전에 해결해야임상 환경에서 실현 될 수있다; 시험 관내 배양 된 인간 배아 줄기 및 iPSCs, 리 프로그래밍 및 세포 유지하는 동안 이종 유도체의 사용의 발암 가능성, 및 생체 내에서 이식 된 세포를 추적 할 필요성은 Hentze 외 의해 검토 다 능성 줄기 세포의 임상 적용 (모든 중요한 장애물이다. 2). 분화 된 세포를 이식 후 추적의 필요성에 이상적인 솔루션에 관계없이 응용 프로그램의 침묵과 잡색 레지스트 시각적으로 검출 마커를 포함한다. 외래 DNA가 안전한 항구 궤적에 도입 될 때 통합 된 유전자의 강력하고 지속적인 표현은 가장 쉽게 달성 할 수있다; 즉, 통합 벡터의 충분한 전사를 활성화 이웃 게놈 부위에서 유전자 발현의 3 교란을 완화하는 동시에. 아주 잘 그것의 발견 이후 특징으로 한 그러한 사이트는 아데노 관련 바이러스 integr입니다단백질 인산 가수 분해 효소 (1) 규제 서브 유닛 12C (PPP1R12C) 유전자의 첫 번째 인트론에 ATION 사이트 1 (AAVS1). 이 궤적 유지 및 연장 시간을 통해 통합 된 유전자의 강력한 표현 문화의 체외 분화 3뿐만 아니라, 전사 섭 4에서 유전자를 둘러싼 보호하기 위해 허용 할뿐만 아니라 보였다; 두 기능으로 인해 AAVS1 사이트 (5)의 측면에 내인성 염색질 절연체 요소의 존재에 의한 것으로 생각된다. 방금 지난 10 년간 게놈 엔지니어링 툴의 발전은 크게 임의의 세포 유형의 유전 조작이 달성 될 수있는 용이성 및 효율성을 촉진 하였다. 초기의 성공적인 실험는 ESC -6,7- 타겟팅 유전자를 달성하기 위해 도입 된 도너 내인성 상동 재조합 (HR)의 상당히 낮은 수준에 의존하지만, 예컨대 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 유의 사항과 부위 - 특이 적 뉴 클레아 제의 사용ficantly 같은 실험 8,9의 효율성을 크게 증가 이중 가닥 DNA 휴식의 생성을 통해 상동 재조합을 유도한다. 모두 전사 활성제와 같은 이펙터 식물 병원성 크 산토 모나스 장군의 (이야기)와 원핵 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) 효율적인 사이트 별 디자이너 클레아 제에 / Cas9 시스템의 용도 변경은 만능 줄기 세포에서 표적 유전자를했다 접근 실행 가능한 방법론 10-13. 최근의 논문은 이야기 클레아 제 (TALENs) (14)를 사용하여 인간 iPSCs의 AAVS1 안전 항구의 궤적에 녹색 형광 기자 카세트의 안정적 통합을위한 효율적인 방법을 설명했다. 이러한 목표 iPSCs는의 유용성에 대한 강력한 증거를 제공, 심지어 심근 경색 (MI)의 마우스 모델로 심근 세포 이식에 관한 분화 후 자신의 형광을 유지안정적으로 형광 만능 줄기 세포 (14). 타겟팅 콜로니를 수득하기 위해, 유전자 트랩 방법 플라이 싱 - 억 셉터 (SA)는, 2A 자체 절단 단백질 서열은 내인성 PPP1R12C 프로모터의 제어 하에서 퓨로 마이신 N- 아세틸 전이 효소 (PAC) 유전자를 배치 상기 사용 하였다; 따라서, AAVS1 유전자좌 DNA 공여체를 도입 한 경우에만 iPSCs는 퓨로 마이신 내성에 기초하여 선택 가능하게 이들을 렌더링 PAC 표현; (그림 1, 15). 이 프로토콜에 기반 iPSCs를 AAVS1-GFP iPSCs가 TALENs와 iPSCs를 형질 감염의 과정과 AAVS1 안전 항구의 궤적에 4.2kb DNA 단편을 통합 할 수있는 9.8 킬로바이트 기증자를 포함, 최근 종이 (14)에보고 생성 선택하는 절차의 자세한 사항 퓨로 마이신 저항 및 클론 확장을위한 따기 식민지. 본원에 설명 된 기술들은 많은 유전체 공학 실험에 적용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1437">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">NAME OF MATERIAL/EQUIPMENT</td>
			<td style="width:123px;">COMPANY</td>
			<td style="width:123px;">CATALOG #</td>
			<td style="width:603px;">COMMENTS/DESCRIPTION</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Essential 8 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>Store basal medium at 4&#176;C. Store supplement at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm TC-Treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DR4 MEF 2M IRR - Academic</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6204G</td>
			<td>Store in liquid Nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-040</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Defined Fetal Bovine Serum, US Origin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw at 4&#176;C overnight and aliquot. Store aliquots at -20&#176;C until needed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector Core unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001B</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4D-Nucleofector X unit&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1001X</td>
			<td>part of the electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C and warm an aliquot in a 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem XF/FF Culture Medium</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Thaw overnight at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>52637 and 52638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>22212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Prepare working aliquots of 1 mg/mL in ddH2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120V 60Hz</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75-004-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TX-750 4 &#215; 750mL Swinging Bucket Rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transfection, selection, and colony-picking of human induced pluripotent stem cells talen-targeted with a gfp gene into the aavs1 safe harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

프로토콜의 시각화는 iPSCs가 NutriStem에 대한 하나 E8 녹색 또는 청색에 의해 강조 다른 배지에서 배양있는 기간으로, 그림 2에서 제공됩니다. 그것은 단지 고품질 iPSCs를 형질 것이 중요하다; 일상적인 유지 보수 전반에 걸쳐 배양 접시를 검토하고 IPSC 문화는 조약돌 모양의 형태를 베어링 주로 별개의 식민지 (그림 3A)가 들어 있는지 확인; 분화 세포는 배양의 10 % 이상을 점?...

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

transfection-selection-colony-picking-human-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

19.2K 조회수.  National Institutes of Health. TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

비디오: Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

연구

발생학

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...