이 작품은 건강의 국가 학회 (DK55743, DK087377, DK102716 및 HG006398에 S.A.D)에 의해 지원 되었다. 우리는 박사 Behshad Pournasr, 닥터 제임스 해 슬 롭 그들의 공헌에 대 한 란 Jing를 감사 하 고 싶습니다.

1. 인간의 문화 유도 만능 줄기 세포
<ol><li>
재조합 인간 E Cadherin Fc 융합 단백질 (E-cad-Fc) 또는 다른 행렬 hPSC 문화에 대 한 적합 한 코팅 6<ol>
<li>Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 칼슘 및 마그네슘 (DPBS (+))와 함께 전자 cad Fc 15 μ g/mL를 희석.</li>
		<li>100 m m 정지 조직 문화 요리 희석된 전자 cad Fc의 5 mL와 코트 및 적어도 1 h. 제거 기판에 대 한 37 ˚C에서 품 어와 매체 (예를 들어, 이제 M 매체 라고는 mTeSR1)의 5 mL을 바꿉니다7. 참고: 이 프로토콜에 사용 되는 배양은 게시 프로토콜7다음을 준비 하 고 있다. 그러나, 다른 여러 미디어 준비 설명 되었습니다 또는 사용할 수 상업적으로, 절차와 호환이 되는 가능성이 있습니다.</li>
		<li>액체 질소에서 cryopreserved Ipsc의 유리병을 검색 합니다. 작은 얼음 크리스탈 남아 때까지 37 ˚C에서 해 동. M-중간의 4 mL를 포함 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 부드럽게 플라스틱.</li>
		<li>5 분은 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 다시 셀 Y-27632로 관련, 코일 코일 포함 단백질 키 니 아 제 (바위)의 선택적 억제제의 10 µ M으로 보충 하는 매체의 5 mL을 일시 중단에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>M-중간 단계 1.1.2에서에서 제거 하 고 전자 cad Fc 코팅 100 m m 서 스 펜 션 조직 문화 요리 단계 1.1.4에서에서 셀의 5 mL을 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화에서 인간의 Ipsc 유지
	<ol>
<li>Ipsc 주위에 도달 되 면 80 %confluency, 문화 매체를 제거 하 고 칼슘과 한 번 세척 및 마그네슘 DPBS (-) 무료. DPBS (-) aspirate 고 0.02 %EDTA 솔루션 커버 플레이트, 다음 실 온에서 최대 3 분 동안 품 어 충분 한 양의 추가 합니다. 참고: 80% 합류에 접시 2 x 107 셀을 포함 해야 합니다. 그것은 중요 하지 자라 다 셀, 셀 undifferentiated 형태 유지 되도록입니다. 세포의 pluripotency 줄기 세포 표식 Tra-1-60 또는 동등한8얼룩에 의해 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>마자 셀 출시를 시작으로 0.02 %EDTA 용액을 제거 하 고 셀 출시 M 매체의 10 mL와 함께 요리를 홍수. 부드럽게 pipetting으로 Ipsc의 분리를 지원. 참고: 세포 분리를 위한 평균 부 화 시간은 약 3 분, 그러나이 각 iPSC 라인에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 셀 주위에 포함 된 작은 클러스터로 나와야 한다 5-10 Ipsc 클러스터 당.</li>
		<li>신선한 전자 cad Fc 코팅된 100 m m 정지 조직 문화 접시 M-중간의 5 mL를 포함 된 당 정지 세포의 1/10을 전송 합니다. 37 ˚C O 4% 아래에서 문화를 품 어2/5% CO2 와 변경 매체 매일. 참고: Ipsc pluripotency 홍보 생리 산소 조건 하에서 교양 정기적으로, 비록 Ipsc 또한 주변 산소를 사용 하 여 성장 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 96 잘 접시에 Hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 차별화
참고: 심사와 호환 되는 형식 Ipsc의 차별화에 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 인간의 Ipsc 차별화 하 고 20 일에서 hepatocyte 같은 세포 형성을 유도 하는 것이 가능 하다. 이 대부분 분석 실험에 적합, 문화의 길이 세포의 성숙도 향상 시키기 위해 확장할 수 있습니다.
<ol><li>
감소 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 96-잘 조직 배양 플레이트 코팅
	<ol>
<li>매트릭스 2 mg/mL 차가운 살 균 DMEM/F12 조직 문화 매체를 diluting 하 여 재고를 준비 합니다. 250 μ aliquots에 매트릭스를 분할 하 고 필요할 때까지-80 ˚C에 저장. 얼음에 30 분 검색에 대 한 얼음에 DMEM/F12의 10 mL 250 μ 2 mg/mL 매트릭스 재고의 약 수를 재개 진정.</li>
		<li>0.05 mg/mL의 최종 농도를 미리 냉장된 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 혼합 하 여 차가운 DMEM/F12의 10 mL와 매트릭스를 결합 합니다.</li>
		<li>96-잘 조직 배양 플레이트의 각 음을 희석된 매트릭스의 100 μ를 전송. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 이상 1 헤에 대 한 행렬을 삭제 하 고 잘 당 50 μ M-중간의 바꿉니다. 37 ° c, 4% O2/5% CO2 필요할 때까지 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플레이트 셀 차별화
	<ol>
<li>셀 접근 80% 합류까지 100 mm 접시에 Ipsc 문화. 접시에 약 2 × 107 셀 포함 되어 있는지 확인 합니다. 셀 흐름 cytometer 또는 hemocytometer 핸드폰 번호를 확인 합니다. 참고: 경험, Ipsc 셀의 품질은 현미경;에 의해 재판 될 수 있다 그러나, 세포의 98 %pluripotency 마커 TRA-1-60 epitope FACS 또는 immunostaining에 의해 측정 될 때 같은 표현 한다. 셀 적극적으로 나누어 남아 자란 하지 중요 하다.</li>
		<li>각 100 mm 접시에서 Ipsc 수확, 문화 매체를 발음 하 고 DPBS (-)의 5 mL로 씻어. 세포 분리 솔루션 (예를 들어, accutase)의 3 mL와는 린스를 장착 하 고 37 ° C, 4% O2/5% CO2에서 약 2 분 동안 품 어. 참고: 그것은 현미경으로 세포의 분리를 수행 해야 합니다. Accutase와 다이제스트 이상 하지 않습니다. 목표는 최소한의 치료와 함께 작은 클러스터로 셀을 공개 하는.</li>
		<li>최대한 빨리 셀 분리 하기 시작, M-중간의 7 mL을 추가 하 여 수확. 주위의 작은 클러스터로 셀 식민지를 해리를 여러 번 플라스틱 3-6 셀 (그림 1A).</li>
		<li>5 분은 상쾌한을 제거 하 고 다시 5 ml M-중간 셀 펠 릿을 일시 중단에 대 한 15 mL 메 마른 분리기 관 300 x g에서 원심 분리기에는 Ipsc를 수집 합니다.</li>
		<li>각 우물에 96-잘 매트릭스 코팅 접시에 셀 현 탁 액 셀의 pipetting 50 μ에 의해 균등 하 게 배포 합니다. 각 96 잘 접시를 설정 하려면, 주위 5 x 106 세포 분화를 설치를 포함 약 80 %confluency 세포와 Ipsc의 하나 100 mm 접시를 사용 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여이 과정을 속도를. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에서 하룻밤 셀 문화. 참고: 동일한 수의 셀을 재현할 차별점을 보장 하기 위해 각 잘 입금이 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포의 분화를 유도
	<ol>
<li>96 잘 접시 셀 각각의 표면에의 적어도 70%를 잘 커버 되도록 현미경으로 검사 합니다. 범위는 70% 미만, 신선한 매체와 매체를 대체 하 고 37 ˚C, 4% O2/5% CO2에 추가적인 24 h에 대 한 품 어. 참고: 일반적으로 분화를 유도 하지 않고 도금 후 48 h에 대 한 셀을 잠복기 차별화의 효율성을 감소 시킨다. 차별화도 발생 주변 산소를 사용 하 여 효율성에 영향을 받는. 수 있지만
</li>
		<li>차별화의 하루 2 하루 1, 바꿉니다 문화 매체 (인슐린), 없이 2 %B27 보충 RPMI 100 ng/mL Activin A, 10 ng/mL BMP4, 및 20 ng/mL FGF2. 잘 당 매체의 100 μ를 추가 하 고 주변 O2/5% CO2 2 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 품 어. 참고: 96 잘 접시의 큰 숫자를 다루는 보조 피 펫 또는 로봇의 사용을 해야 합니다. 12 채널 및 96 채널 펫 매일 매체 변화에 이상적입니다.</li>
		<li>차별화의 주 5 일 3, 대체 RPMI와 문화 매체 (인슐린) 없이 2 %B27 100 ng/mL Activin A. 문화 세포 주변 O2/5% CO2 3 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에 보충.</li>
		<li>신선한 문화 매체, 각 치료와 함께 교체 하기 전에 차별화 날 5, 100 μ 0.02 %EDTA 솔루션 30 s, 다음 제거 및 교체에 대 한 잘 신선한 문화 매체와. 참고: Endoderm 차별화 효율적 이면 세포 분화의 단층은 접시에서 필 링을 하는 경향이. 0.02 %EDTA 솔루션 간략 한 치료 세포 분리를 완화 하는 데 도움이 됩니다. 이 치료 차별화 hepatocytes에 영향을 주지 않습니다.</li>
		<li>10 월 6 일 사이 감 별 법, 문화 매체 RPMI / 2% (인슐린)와 B27 20 ng/mL BMP4와 10 ng/mL FGF2 보충 및 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어 교체 합니다. 이 단계 세포 간 조상 세포로 분화를 유도 합니다.</li>
		<li>15 일 11 사이의 차별화, B27 (인슐린)와 보충 문화 매체 RPMI / 2 %20 ng/mL HGF 바꿉니다. 37 ˚C, 4% O2/5% CO2 매일 중간 변화 5 일에 품 어.</li>
		<li>20 일 16 사이의 차별화, 문화 매체는 hepatocyte 세포 배양 매체 (호치민시) 20 ng/mL Oncostatin M (OSM)의 보충 바꿉니다. 주변 O2/5% CO2 5 일 동안 매일 매체 변화에 37 ˚C에서 세포를 품 어. 참고: 개별 웰 스 간의 차별화의 재현성 효율적으로 알 부 민, AFP, 또는 APOB ELISA 매체에 분 비의 상대적 수준을 측정 하 여 결정 될 수 있다 (3.2 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 작은 분자 검사
참고: 다음에서는 가족성 콜레스테롤 혈 증 Ipsc에서 파생 하는 hepatocyte 같은 셀의 매체에서 APOB의 저수준에 사용 될 수 있는 화합물을 식별 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 모델 및 콜레스테롤 낮추는 약물의 식별에 사용 설명 설명에 자세히 이전5,9. 현재 예제에서는 1000 화합물 사우스 캐롤라이나 복합 컬렉션 (SC3) 도서관에서 상영 했다. 각 화합물 2 μ g/mL의 농도에서 시험 되었다.
<ol><li>
IPSC-작은 분자와 파생된 hepatocytes의 치료
	<ol>
<li>2 %DMSO-20 ˚C에서 저장소 작업 주식 20 μ g/mL의 농도에서 화합물의 접시를 생성 하는 마스터 화합물 라이브러리를 희석.</li>
		<li>테스트할 각 화합물 수 있도록 iPSC 파생 hepatocytes의 충분 한 96 잘 접시를 준비 합니다. 참고: 상영 하는 화합물의 수는 필요한 96 잘 접시의 수를 쓰게 됩니다. 일반적으로, 단일 잘 준비 되어야 한다 모든 컨트롤 샘플에 대 한 각 추가 플러스 화합물, 웰 스에 대 한. 플레이트의 바깥쪽 우물은 해석 손상 가장자리 효과의 가능성을 줄이기 위해 일반적으로 피 한다. 복제를 사용 하 여 필요 없이 z-점수 방법을 사용 하 여 조회 수를 확인할 수 있습니다. 복제에 포함 되어 있다면, t 검정을 사용 하 여 더 적합 하다.</li>
		<li>차별화 (하루 20, 참조 2.3.7)의 완료에 신선한 호치민시의 100 μ와 문화 매체 대체Oncostatin M의 20 ng/mL으로 보충. 37 ˚C에서 품 어, 4% O2/5% CO2 정확히 24 h. 신선한 96 잘 접시와-20 ˚C에 게 문화 매체를 검색 합니다. 이 샘플을 사용 하 여 약물의 추가 하기 전에 매체에서 APOB의 수준을 계산.</li>
		<li>20 ng/mL Oncostatin M의 각 음에 보충 하는 신선한 호치민시의 90 μ를 추가 합니다. Pipetting으로 혼합 후 작동 주식에서 각 화합물의 10 μ를 추가 합니다. 치료 샘플에서 최종 농도 일치 하는 37 ˚C에서 품 어 웰 스 제어를 0.2 %DMSO 추가, 주변 O2/5% CO2 정확히 24 h. 문화 매체를 수집 하 고-20 ˚C에 저장. 이 예제를 사용 하 여 화합물과 치료 후 APOB의 수준을 결정 하기 위하여.</li>
		<li>옵션-immunostaining, 세포 생존 능력, 또는 mRNA 수준의 표준 방법을 사용 하 여 분석을 위해 나머지를 처리할 수 있습니다. 참고: 이 화면은 APOB 수준에 빠른 효과 가진 약물을 식별 하도록 설계 되었습니다. 그러나, 질병 모델, 다운스트림 분석 실험, 또는 약 활동의 기계 장치에 따라서 그것은 여러 날에 대 한 샘플을 치료 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ELISA APOB 레벨 결정
	<ol>
<li>두 사전 및 사후 약물 치료 샘플 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간의 APOB ELISA 개발 키트를 사용 하 여에서 Apolipoprotein B (APOB) 농도 결정 합니다.</li>
		<li>
다음 솔루션을 준비 하 고
		<ol>
<li>0.05%의 구성 워시 버퍼 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.</li>
			<li>인큐베이션 버퍼, 0.05% 트윈 20 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 이루어져 있습니다. 사용까지 4 ˚C에 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>2 µ g/ml PBS, pH 7.4에에서 diluting 하 여 APOB (20/17 mAB) 항 체를 준비 합니다. 잘 당 희석된 항 체의 100 μ를 추가 하 고 밤새 4 ˚C에서 품 어.</li>
		<li>분석 결과 격판덮개에서 항 체를 제거 하 고 각 PBS, pH 7.4의 200 μ로 잘 두 번 세척.</li>
		<li>0.05%의 200 μ/잘 추가 트윈 20, 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, pH 7.4에에서 고 실 온에서 1 h 떨고 플랫폼에 품 어.</li>
		<li>PBS, APOB의 다음 농도와 pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 사용 하 여 8 포인트 표준 곡선을 준비: 300 ng/mL, 200 ng/mL, 175 ng/mL, 150 ng/mL, 125 ng/mL, 100 ng/mL, 75 ng/mL, 및 50 ng/mL.</li>
		<li>PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA 테스트 샘플 1: 4을 희석.</li>
		<li>인큐베이션 버퍼와 차단의 1 시간 후 버퍼를 삭제 하 고 5 번와 200 μ 0.05%의 분석 결과 접시 세척 PBS, pH 7.4에에서 트윈 20.</li>
		<li>완전히 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 시험 접시에 희석된 샘플 및 APOB 표준의 90 μ를 전송. 1 시간에 대 한 통에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플을 삭제 하 고 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. PBS, pH 7.4에에서 0.05% 트윈 20 및 0.1 %BSA mAB LDL 11 biotin 희석된 1:1,000의 당 100 μ를 추가 합니다. 1 h 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>시 무시 하 고 잘 세척 버퍼 당 200 μ와 5 번 씻어. 추가 Streptavidin HRP 항 체의 당 100 μ (1:1, 000 부 화 버퍼를 사용 하 여 희석), 다음 1 시간을 위한 떨고 플랫폼에 실 온에서 품 어.</li>
		<li>삭제 시와 200 μ 0.05%로 씻어 PBS, pH 7.4 잘 당에 트윈 20. 세척 총 5 회 반복 합니다. 완전히 시험 접시에서 잔여 세척 버퍼를 제거 하 고 Tetramethylbenzidin (TMB) 기판 솔루션의 당 100 μ 추가 하 고 8 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>TMB 기판 제거 하지 않고 직접 중지 솔루션 (1N HCl)의 당 100 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>450에서 흡 광도 결정 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>4 매개 변수 로지스틱 회귀 방법을 사용 하 여 다음 각 샘플10APOB의 농도 정의 하는 데 사용 하는 표준 곡선을 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>사전 마약 검사: APOB 낮은 잠재력을 가진 화합물을 식별 하는 각 샘플에서 APOB의 사후 약 비율 매체 수준.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Lu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+progenitor+cells+of+biliary+origin+with+liver+repopulation+capacity.">Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

기반으로 하는 대상 약물 발견, 작은 분자 식별 됩니다 특정 단백질의 활동에 영향을 주는 많은 기존 심사 활동의 초점이 되었습니다. 이 이렇게는 수많은 제약, 반전 형, 고전 학, 바탕 화면을 제공 하 고 있지만 임상 효능1되었습니다 일등석에서 화합물을 식별 하는 것에 더 성공한 되었습니다. Phenotypic 약물 발견에 단점은 적절 한 질병 모델의 가용성에 의존입니다. 이 질병의 ?...

희귀 한 질병을 대상으로 사용할 수 있는 약물을 확인 성공 심사에 사용할 수 있는 분석 실험의 발달에 의존 합니다. 가설 또는 대상 기반 화면 (역방향 약리학) 유용 합니다, 하지만 질병의 분자 기준의 상세한 이해를 요구. Phenotypic 화면 (클래식 약리학) 생화학 경로 대 한 자세한 이해에 대 한 필요 하지만 대신 질병의 이상 정확 하 게 반영 하는 모델의 개발에 따라. 대상-기반 접근에 대 한 열정에 불구 하 고 FDA 승인 첫-에서-클래스 약물의 분석 공개 phenotypic 스크린 훨씬 더 성공적인1되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 심사 하는 높은 처리량에 대 한 플랫폼을 설정 하 대사 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하 사용 될 수 있다입니다. 여러 생체 외에서 모델 기본 hepatocytes은 세포 및 간 조상 세포2를 포함 하 여 기술 되었다. 그러나, 대부분 이러한 모델의 한계, 있고 정확 하 게 문화에서 대사 간 결함의 이상 정리 수 있습니다 새로운 모델에 대 한 필요가 있다. 최근, 인간의 pluripotent 줄기 세포 유전자 편집 함께 액세스 환자 필요 없이 문화에 희귀 질환의 희귀 한 것도 모델 수 있는 기회를 제공 직접3. 환자 전용 Ipsc의 사용 하면서 희귀 한 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 발견 하는 도구는 개념적으로 합리적으로이 접근4의 타당성을 입증 하는 몇 가지 보고서만 있다. 그러나, 우리는 최근 iPSC 파생 hepatocytes 약물 간 신진 대사5결함의 치료를 위해 repurposed 수 성공적으로 확인을 사용 하는 플랫폼을 설립.
이 프로토콜 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시에 인간의 Ipsc를 차별화 하 고 작은 분자의 라이브러리 화면에 그들을 사용 하 여 과정을 설명 합니다. 그것은 또한 신진 대사 간 질환의 예로 콜레스테롤 혈 증을 사용 하 여 끝점 분석을 설명 합니다. 이 방법은 역할 및 전염 성 간 질환, 간 대사 질환, 약물 독성, 및 다른 간 질환의 맥락에서 작은 분자의 응용 연구에 유용 해야 한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="959">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:588px;">100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430167</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-wells tissue culture plate&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human Albumin</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A 0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human FOXA2(6C12)</td>
			<td>Novus Biological</td>
			<td>H00003170-M12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human HNF4 alpha</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human Oct-3/4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human SOX17</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FCMAB115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Activin A Recombinant Human Protein&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHC9563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Supplement, minus insulin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>0050129SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Supplement, serum free&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BMP4 Recombinant Human Protein&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHC9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Dissociation Reagent StemPro&#160; Accutase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>7572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS+(calcium, magnesium)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS-(no calcium, no magnesium)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12, HEPES&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ELISA human APOB ELISA development kit</td>
			<td>Mabtech</td>
			<td>3715-1H-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepatocyte Growth Factor&#160; (HGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHC0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHC5015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&#160;</td>
			<td>STEMCELL technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 Medium, HEPES&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td>
			<td>Primorigen Biosciences</td>
			<td>S2071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMB-ELISA Substrate Solution</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>34022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>FCMAB115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene (EDTA) 0.02%&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-711E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Y-27632 ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

Hepatocyte 모양의 세포 (HLCs)로 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)를 차별 하는 능력 선된 천 성 간 물질 대사 연구에 새로운 기회를 제공 합니다. 그러나, 잠재적으로 간 질환 치료에 사용 될 수 있는 작은 분자의 id를 지 원하는 플랫폼을 제공 하는 절차 화합물의 수천을 심사와 호환 되는 문화 형식이 필요 합니다. 여기, 우리는 hepatocyte 같은 셀 96-잘 조직 문화 접시에 인간의 Ipsc의 재현 차별화를 허용 하는 완전히 정의 된 문화 조건을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 가족성 콜레스테롤 혈 증 환자에서 발생 하는 iPSC 파생 hepatocytes에서 생산 하는 Apolipoprotein B (APOB) 낮은 화면 화합물 그들의 능력에 대 한 플랫폼을 사용 하 여 제공 합니다. 약물 발견과 호환 되는 플랫폼의 가용성 간에 영향을 주는 질병에 대 한 새로운 치료제를 식별 하는 연구를 허용 해야 합니다.

Hepatocyte의 세대 - 세포 처럼: 그림 1 는 hepatocyte 같은 셀에 인간의 Ipsc의 분화 하는 동안 발생 하는 변경의 기간을 설명 합니다. 전자 Cad Fc에 Ipsc의 문화 제공 약 2 mm 직경 식민지 만능 마커 OCT4 표현 (그림 1A-B). 전자 cadherin 매트릭스에 성장 하는 세포의 형태는 약간 다른 다른 표?...

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

약물 발견에 대 한 만능 줄기 세포 유래 Hepatocyte 같은 세포를 유도 하는 인간을 사용 하 여

여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K 조회수.  Medical University of South Carolina. 여기에 제시 된 프로토콜 간 질환의 치료에 대 한 작은 분자를 식별 하기 위한 플랫폼을 설명 합니다. 단계별 설명 Ipsc 96 잘 접시에서 hepatocyte 특성을 가진 세포로 분화 하 고 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 활동 화면 셀을 사용 하는 방법을 자세히 제시 합니다.

비디오: Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

연구

발생학

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for differentiating hiPSCs into cardiomyocytes (hiPSC-CMs), endothelial cells (hiPSC-ECs), and smooth muscle cells (SMCs) are often limited by low yield, purity, and/or poor phenotypic stability. Here, we present novel protocols for generating hiPSC-CMs, -ECs, and -SMCs that are substantially more efficient than conventional methods, as well as a method for combining cell injection with a cytokine-containing patch created over the site of administration. The patch improves both the retention of the injected cells, by sealing the needle track to prevent the cells from being squeezed out of the myocardium, and cell survival, by releasing insulin-like growth factor (IGF) over an extended period. In a swine model of myocardial ischemia-reperfusion injury, the rate of engraftment was more than two-fold greater when the cells were administered with the cytokine-containing patch comparing to the cells without patch, and treatment with both the cells and the patch, but not with the cells alone, was associated with significant improvements in cardiac function and infarct size.

We present three novel and more efficient protocols for differentiating human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells and a delivery method that improves the engraftment of transplanted cells by combining cell injection with patch-mediated cytokine delivery.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

만능 줄기 세포에서 세포 처럼 Hepatocyte의 반자동된 생산

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...