This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. 신경 세포 문화 참고 : 만능 줄기 세포의 섬유 아세포 프로그래밍, 늦게 대뇌 피질의 조상의 지느러미 telencephalon 계통, 유도, 증폭, 및 금융에 대한 헌신 (LCP)는 Boissart 등의 알 4에 설명했다. LCP 유사 세포의 분화 신경 세포는 또한 약간의 수정 Boissart 동부 알 4에 따라 수행 하였다. 또 다른 과정은 뉴런으로 분화 유도 하였다 능성 줄기 세포로의 섬유 모세포의 직접 프로그래밍을 위해 개발되어왔다. 이 피라미드 글루타메이트 성 신경 세포의 선택적 제조 할 수 있으므로,이 프로토콜은 유지되었다. <ol><li> 폴리 오르니 틴 (DPBS에서 1/6로 희석, 주식 농도 0.01 %) DPBS 세 세척 다음 O / N로 커버 글라스 6 웰 배양 판을 취급합니다. 이어서 유동 후드 적어도 10 시간, 라미닌 (1 mg을 / ㎖, DPBS에서 500 배 희석 스톡 농도)를 추가<html> . </li><li> 플레이트 및 저밀도 NSC를 전달 N2 보충제의 (50,000 세포 / cm 2) 유리 DMEM / F12 이루어진 배지 3 ㎖에 커버 슬립 (500 ㎖), 2- 바이알 6 웰 배양 플레이트 (5 ㎖ 각) B27 보충제의 2 병 (각 10ml), 펜 스트렙토 마이신 10 ㎖ (페니실린 = mL 및 스트렙토 마이신 = 10,000 단위 / ㎖ 10,000 단위 /), 2- 머 캅토 에탄올 1 ㎖ (원액 : 50 밀리미터) 및 라미닌 (1 / 500), 성장 인자없이. 중요한 단계 : 셀 클러스터링을 줄이기 위해 느린 회전 움직임 세포를 첨가하여 조심스럽게이 단계를 수행합니다. </li><li> 배지를 제거합니다. 커버 글라스에 부착 된 신경 세포를 유지하고 응집을 방지하기 위해 신선한 라미닌 솔루션의 2 ㎍ / ㎖의를 포함하는 신선한 N2B27 매체를 추가합니다. 3 일마다 매체를 변경합니다. 건조로부터 세포를 방지하기 위해, 새로운 배지를 첨가하기 전에 남아있는 매체 (200 μL)의 일부를 유지한다. 다르게는, 급속하게 진행하고 전체 부피 (3 ㎖)을 변경. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. 렌티 바이러스 형질 도입 참고 : GFP 렌티 바이러스 벡터가 친절하게 파스퇴르 연구소에서 박사 우베 Maskos 연구소 (파리)에서 제공하고 게시 된 프로토콜 (5)에 따라 제조 하였다. GFP의 발현은 마우스 포스 포 키나아제 (PGK) 프로모터에 의해 구동된다. 이 연구를 위해 바이러스 역가 400 NG / μL (PBS 1X에서 원액)이었다. <ol><li> 배양 당 GFP 렌티 바이러스 벡터 웰 (6- 웰 플레이트) 40 ng의 함유 원액 1 μl를 첨가하여 바이러스 입자에 의한 성숙 중 어느 단계에서 인간 IPSC 유래 신경 세포를 형질 도입하고 신선한 배지에서 48 시간 동안 배양한다. 주 :이 프로토콜의 경우, 배양 기간은 척추 구조의 좋은 표시를 허용한다. </li></ol> 3. 면역 형광 주 : 전체 척추 형태의 라벨을 개선하기 위해, 면역 형광 라벨링 투과성이 조건에서 항 GFP 항체를 사용하여 수행 하였다. </p&gt; <ol><li> RT에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 커버 슬립에 형질 세포 배양 배지를 제거하고, 수정 후, 1X PBS (10 분마다)을 3 회 반복한다. </li><li> PBS에 Immerge coverslips를 0.05 % 트리톤 (100X)와 RT에서 1 시간 동안 10 %의 말 혈청, 1X PBS 후 3 번 세척 하였다. </li><li> 1X PBS 100 ㎕를 4 % 말 혈청 및 차 항체 (1 / 1,000) GFP에 대해 발생하고, 각 커버 슬립에 1000 배 희석하여 추가로 보충. 어두운 상자 O에 품어 / N 4 ° C에서, 다음 1X PBS로 3 회 세척한다. </li><li> PBS가 트윈 20의 0.5 %로 보충에 알렉사 형석 488 공역 항체 (1/200)을 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 그런 다음 1X PBS에서 3 회 세척하고 형광 현미경을위한 매체를 장착하여 유리 슬라이드에 커버 슬립을 탑재합니다. </li></ol> 4. 수지상 척추 영상 <ol><li> 공 초점 레이저 주사 현미경을 통해 공 촛점 이미징을 수행합니다. </li><li> 피라미드 형태의 건강한 뉴런을 선택차 전체 수지상 arborization 및 별도의 실험 조건에 따라 최소 10 뉴런을 정량화. 수상 돌기 당 100 ㎛ - 60 정량화. </li><li> 20 μW 주위 샘플 레벨 전형적인 피크 파워와 NA는 대물 1.3 = 40X 오일 및 GFP 여​​기 대 488 nm의 레이저 선을 사용하여 이미지를 획득. 80 nm의 주위에 설정 픽셀 크기가 제대로 돌기 쪽을 샘플링합니다. 주 : 잡음 덴 드라이트 및 등뼈의 적절한 분할을 손상하지 않는 이미지에 대한 후속 호출을 분석. 상술 한 공간 샘플링 및 전력 설정과 함께, 우리는 3.15 μS의 화소 드웰 시간은 이미지를 구축 할 수있는 충분한 광자를 수집하기에 충분한 것을 관찰했다. 희미한 샘플 화질 2-4 스캔을 평균함으로써 개선 될 수있다. 여러 XY 타일의 인수는 다음 함께 처리하기 전에 스티치해야 관심 영역을 커버하기 위해 필요할 수있다. </li><li> 와, Z-스택을 획득, 전체 신경 세포의 볼륨을 샘플링Z는 20 ~ 30 Z 슬라이스를 산출, 150 나노 미터에서 300 나노 미터에 이르기까지 간격. 참고 :이 설정으로 달성 측면 공간 해상도는 234 나노 미터이며, 축 방향 해상도가 591 ㎚이다. 여기서 선택된 샘플링은 적절하지만 축 해상도가 묘화 될 수있는 쪽의 최소 크기보다 큰 경우로, 분석 돌기로부터 측 방향으로 연장되는 쪽을 선호. </li></ol> 돌기 쪽 5. 3D 정량화 주 : 다음 섹션 구체적 분석 Imaris 소프트웨어의 사용을 설명한다. 다른 구현은 유사한 결과를 제공 할 수 NeuronStudio 15 MetaMorph로부터 8 포함한 존재한다. 다음 키 설정을 사용 : <ol><li> 전처리 단계로서, 소프트웨어에 의해 제공되는 화상 처리 시설을 통해 가우시안 필터링을 사용한다. 이미지 처리&gt; Smoo 통해 가우시안 필터링을 수행일&gt; 가우시안 필터. XY의 픽셀 크기와 동일하게 필터 폭을 설정한다. </li><li> 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈을 이용하여, 덴 드라이트의 반자동 추적을 수행한다. <ol><li> 우선, 소프트웨어의 슬라이스 탭 거리 도구를 사용하여, 덴 드라이트 직경 견적. </li><li> 능가 탭에서 필라멘트 도구를 클릭합니다. 더 나은 안정성,이 프로토콜은 반 자동화 된 추적에 의존; 건너 뛰기 자동 생성을 클릭합니다. 모듈 인터페이스는 이제 그리기 탭을 보이고있다. 여기에있어서, 덴 드라이트 형 등 및 입력 예상 수지상 AutoPath 지름을 선택한다. </li><li> 상자에 커서를 회전, 포인터의 선택 모드를 사용합니다. 수상 돌기 시작 지점에 Shift 키를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 주 : 소프트웨어가 초기 계산을 수행한다. </li><li> 수상 돌기를 따라 포인터를 이동합니다. 시작점에서 (대표파란색 영역으로서 ED), 대부분 수지상 경로를 나타내는 황색 라인이 도시되어있다. 수상 돌기의 엔드 포인트에서 Shift 키를 왼쪽 클릭합니다. </li></ol></li><li> 자동화 된 쪽이 분할을 수행합니다. 주 : 추적 수지상 등뼈가 모듈 인터페이스에 의해 자동으로 발견된다. <ol><li> 모듈 인터페이스에서 작성 탭을 클릭합니다. 다시 드롭 목록에서 덴 드라이트의 직경을 다시 선택하고 보관할 데이터 상자를 선택합니다. 그런 다음 다시 클릭합니다. </li><li> 분할 된 볼륨이 덴 드라이트 실제 용적에 대응되도록 임계 값을 설정한다. 알고리즘으로,. 거리지도에서 최단 거리를 선택하고 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> 가장 작은 척추 헤드 직경 및 최대 길이를 결정, 다시 소프트웨어의 슬라이스 탭의 거리 도구를 사용하여, 다시 능가 탭에 와서 매개 변수를 입력합니다. F또는이 프로토콜은 약 200 값 - 최소 직경 300 nm의 최대 길이 4 μm의 좋은 출발점이다. 허용 지점 쪽이 상자를 선택하지 마십시오. 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> 등뼈를 나타내는 파란색 점은 실제 척추 머리에 지역화 있도록 종자 포인트 임계 값을 조정합니다. 다음 버튼을 클릭합니다. 참고 : 핵심 계산은 현재 수행되고 길어질 수 있습니다. </li></ol></li><li> 모듈 인터페이스의 도구 탭으로 이동하여 척추를 분류. 분류 등뼈를 클릭합니다. 메시지가 사용자 인터페이스에서 다음과 같이 자신의 형태에 의해 정의 된 네 개의 클래스가 있다는 것을 확인하십시오 스터 : 길이 &lt;1 μm의; 버섯 : 길이 (척추)&gt; 3, 최대 폭 (머리)&gt; 폭 (목) × 2 의미; 긴 얇은 : 평균 폭 (머리) ≥ 평균 폭 (목) Filopodia 같은 : 길이 ≤ 4 μm의 (NO 머리). 참고 : 미주리dule 인터페이스 분류의 결과를 포함하는 4 개의 필라멘트 새로운 객체를 생성한다. </li><li> 수출 통계 데이터 :이 네 객체 인터페이스 중 하나에서, 통계 탭으로 이동합니다. 버튼을 파일로 내보내기 모든 통계를 클릭합니다. 참고 : 다른 통계 값이 수상 돌기 위해 내보낼 수 있습니다 (.. 예를 들면, 길이, 면적, 등등 직경, 분기 깊이, 분기 각도, 볼륨을 의미), 그리고 척추 (예 :, 진 직도, 첨부 파일, 길이와 별개의 볼륨의 영역 척추 부품, 척추 직경, 밀도, 등.) </li></ol>

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

피라미드 신경 세포의 형태 학적 특성의 정량화 소프트웨어에 의존했다. 필라멘트 트레이서 인터페이스는 뉴런 및 등뼈의 분할을 위해 사용하고, XT 모듈들은 분석을 위해 사용 하였다. 우리의 기술의 정확성을 분석하기 위해, 우리는 먼저 배양 6, 7 및 인간 뇌 조직 3 쥐 성숙한 피라미드 신경 세포를 사용하여 게시 된 것과 측정 형태 학적 파라미터 (길이, 면?...

대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 돌기 쪽은 설치류, 영장류, 그리고 인간의 뇌에서 이러한 신경 세포 아형의 기저와 혀끝의 수상 돌기를 따라 분포되어 작고 얇은 돌기 있습니다. 그들은 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트이며, 학습과인지 과정의 주요 기능을 표시합니다. 인간 돌기 쪽의 상세한 구조는 기술적으로 전자 현미경 (2)에 의해 연구되었다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요하고 무거운 부하를 나타냅니다. 최근 돌기 쪽의 형태의 3 차원 (3D)는 크게 재구성 척추 수동 분석 (3)에 결합 된 특정 소프트웨어를 사용하여 인간의 뇌 피질에서보고되었다. 면역 결합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기술을 형광 현미경에 의해 식별 및 척추 모양 측정 정확한 도구를 나타낸다. 이 방법은 쉽게 배양 신경에 적용 할 수있다. 하우버전, 데이터는 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)에서 파생 된 인간의 신경 세포에 척추 성숙과 형태의 분석보고되지 않았다. 이 연구의 목적은 시험 관내에서 배양 된 신경 세포에서 돌기 척추 촬상을 허용하는 프로토콜을 기술 하였다. Imaris 소프트웨어 필라멘트 추적기 모듈과 GFP 표지, 공 초점 현미경 및 3D 분석은 본 프로토콜에 사용 하였다. II 신경 줄기 세포로부터의 IV (NSC)에 층의 피질 글루타메이트 성 신경 세포를 획득하는 데 필요한 배양 단계는 여기서 설명 간략하다. 인간의 NSC 생산을위한 전체 프로토콜은 이미 다른 곳에서 4 게시되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

돌기 쪽은 중추 신경계의 흥분성 시냅스의 후 시냅스 구획에 해당하는 작은 돌기입니다. 그들은 수상 돌기를 따라 배포됩니다. 이들의 형태는 신경 세포의 활동에 크게 의존, 그들은 동적입니다. 돌기 쪽은 표면과 시냅스 밀도의 수준에서 글루타메이트 수용체 (AMPA와 NMDA 수용체)을 표현한다. 각각의 척추는 신경 세포가 독립적으로 주 및 지역 활동을 제어 할 수 있습니다. 척추 모폴로지 광범위 생체 내 접근법과 설치류로부터 얻어지는 신경 조직 배양을 모두 사용하여, 뇌 피질의 글루타메이트 피라미드 세포에서 연구되어왔다. 설치류 배양 뉴런과 일차원 정량 분석 1에 도시 된 바와 같이 신경 병리학 적 조건은, 변경된 척추 유도 및 성숙에 관련 될 수있다. 본 연구는 인간의 cortic를 사용하여 척추 형태학의 3D 정량 분석​​을위한 프로토콜을 설명신경줄 기세포 (늦은 피질 전구 세포)로부터 유래 된 알 뉴런. 이러한 세포는 처음에 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 얻었다. 이 프로토콜은 다른 배양 기간에서 척추 모폴로지의 분석이 가능하고, 정신 질환 환자로부터 수득 된 것과 제어 개체로부터 얻은 유도 된 다 능성 줄기 세포 사이와 비교 가능.

<html> 본 연구는 IPSC에서 파​​생 된 피라미드 신경 세포의 배양 수상 돌기의 척추 정량 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 척추 인간의 신경 세포에 성숙 표준 설치류 신경의 문화 쪽의 성숙뿐만 아니라에서 생체 내 동물 모델과의 가능한 비교 분석을 할 수 있습니다. 도 1a는 피라미드 피질 뉴런의 생산을 허용 문화의 상이한 단계의 구조를...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K 조회수.  Institut Pasteur.  피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다. 

비디오: Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...