이 방법은 높은 순도인간 간싹 선조및 간세포 같이 세포의 다수의 생성을 가능하게 합니다. 이 간 세포를 생성하는 기능은 재생 의학 및 그밖 필드에 중요할 수 있었습니다. 간 분화를 촉진하고 원치 않는 세포 유형의 형성을 억제하기 위해 발달 신호 경로를 제어함으로써,이 방법은 각각 분화의 6 및 18 일에 의해 인간 간 새싹 선조및 간세포 와 같은 세포의 효율적인 생성을 가능하게한다.
이 기술의 주요 장점은 생성 된 인간 간 세포의 높은 순도이다. 이 절차이기 위해 교반 바가 들어 있는 원추형 플라스크에 50밀리리터의 IMDM을 추가합니다. 중간 을 섭씨 50도까지 가열하고 0.5 그램의 PVA를 추가하면서 지속적으로 교반하여 밀리리터 당 10 밀리그램의 농도로 PVA 스톡을 준비합니다.
그런 다음 가열 패드에서 PVA 용액을 제거하고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 용액이 냉각되면 멸균, 0.2 마이크로미터 필터를 통해 필터링합니다. 텍스처 프로토콜 중 하나에 설명된 대로 필터링된 PVA와 다른 시약을 결합하여 CDM2 및 CDM3를 준비합니다.
멸균, 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여 모든 미디어를 필터링합니다. 그런 다음 표에 설명된 대로 나머지 기본 미디어인 CDM4 및 CDM5를 텍스트 프로토콜 중 하나에 준비합니다. 분화 매체를 준비하려면 먼저 실온에서 냉동 된 작은 분자 및 / 또는 성장 인자를 해동하십시오.
Aliquot는 필요한 양의 염기 배지를 내분하고 지정된 소분자 및 성장 인자를 적절한 농도에서 기저 배지에 첨가한다. 사용하기 전날, 섭씨 4도에서 매트릭스를 해동하십시오. 다음 날, 500 마이크로리터의 매트릭스를 콜드 DMEM 50 밀리리터에 추가하여 1대 100의 비율로 매트릭스를 희석시하십시오.
희석된 매트릭스를 우물 표면을 덮기 위해 충분한 양의 용액을 사용하여 필요한 수의 우물로 파이펫을 넣습니다. 매트릭스 코팅 플레이트를 섭씨 37도에서 인큐베이터로 최소 60분간 옮김합니다. 파종 직전에 코팅된 우물에서 나머지 매트릭스 용액을 흡인합니다.
그런 다음, 크게 수렴 hPSC 배양 플레이트에서 배지를 흡인하고 상업적으로 구입 한 해리제를 추가하여 세포가 성장하는 표면을 덮기 위해 충분히 사용해야합니다. 해리 에이전트에서 hPSC를 5분 동안 섭씨 37도에서 또는 일부 식민지가 분리되기 시작할 때까지 hPSC를 배양합니다. 다음으로 DMEM 및 F-12를 추가하여 해리제를 희석시합니다.
5 밀리리터 세로지오니컬 파이펫을 사용하여 여러 번 부드럽게 파이펫을 사용하여 우물 표면에서 모든 세포를 씻어냅니다. 50 밀리리터 원옥 튜브에서 다시 중단된 단일 세포를 수집하고 필요에 따라 DMEM 및 F-12로 희석하십시오. 수집된 hPSC의 이 튜브는 350배, 섭씨 4도에서 3분간 세포를 펠릿으로 처리합니다.
원심 분리를 기다리는 동안 hPSC가 시드되는 플레이트에서 행렬을 흡인시합니다. 받는 우물에 충분한 양의 mTeSR 미디어를 추가하여 이를 다룹니다. 원심분리가 완료되면, 상류체를 주의 깊게 흡인하여 원추형 튜브 의 바닥에 펠렛 hPSC를 남깁니다.
mTeSR에서 세포 펠릿을 소판하여 상업적으로 획득한 티아조빈의 1마이크로몰라로 보충하였다. P1000 파이펫을 사용하여 2~3회 부드럽게 세살하여 셀 펠릿을 단일 셀 서스펜션으로 균일하게 재보냅니다. 즉시 혈전계로 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 피펫하고 세포의 수를 계산합니다.
도금에 대한 원하는 세포 농도를 달성하기 위해 티아조빈 보충 mTeSR로 재부유 된 hPSC의 부피를 조정합니다. 그런 다음, 전지가 균등하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 교차 패턴으로 플레이트를 여러 번 흔들어 놓습니다. hPSC가 적어도 24 시간 동안 도금 된 후, 상 대비 현미경을 사용하여 도금 된 hPSC 콜로니의 직경에 특정 중점을 둔 세포의 형태를 확인하십시오.
다음으로 텍스트 프로토콜 의 탁 2에 설명된 대로 1일 APS 차별화 매체를 준비합니다. 시드 후 하루, 도금 hPSC에서 티아조빈 보충 mTeSR을 흡인하고 간략하게 IMDM 매체로 씻어. 이 후 hPSC에 하루 1 개의 매체를 추가합니다.
시간을 기록하고 세포를 인큐베이터에 다시 넣고 섭씨 37도에서 넣습니다. 필요한 분화 매체를 준비하고 하루 중 같은 시간에 각각분화하는 날에 세포에 추가하여 후속 분화 단계를 계속하십시오. 이 연구에서는, 간 싹 선조와 그 후에 간세포 같이 세포의 풍부한 인구는 hPSCs에서 생성됩니다.
분화의 둘째 날까지, 원시 적 줄무늬 세포는 2 일 결정적인 엔데덤 세포로 분화했습니다. 이 세포의 대다수는 SOX17 및 FOXA2를 발현합니다. 분화의 셋째 날까지, 내분 세포는 모양에 다각형을 나타나는 전구선으로 분화했다.
나중에, 6 일째에, 전대장 선조는 간 싹 선조로 분화했습니다. 이 간 싹 선조는 AFP, TPX3 및 HNF4alpha를 표현합니다. 3hPSC 라인을 통해, 이 방법은 hPSC에서 간 분화의 18 일 후에, 약 89%의 효율성에 있는 6개의 AFP 양성 간 선조를 생성합니다, 알부민 양성 간세포 같이 세포가 나타납니다.
형태학적으로, 이 세포는 담즙 카날리큘리를 연상시키는 밝은 테두리를 형성하는 상피로 나타납니다. 이 단계에서, 18 hPSC 유래 간세포의 세포질은 핵보다는 어둡게 나타납니다. 분화를 위해 인간 만능 줄기 세포를 파종할 때, 올바른 밀도로 그들을 씨앗을 뿌리고 또한 판을 흔들어 우물에 걸쳐 분배하는 것이 필수적입니다.
체외에서 인간 간세포를 생성하는 능력은 과학자들이 간 발달의 기전을 조사 할 수있는 가능하게하는 기술입니다. 이 방법은 간 기능 및 질병을 조사하고 결국 간 부전을 위한 새로운 치료를 가능하게 하기 위하여 이용될 수 있던 시험관에서 인간 간세포의 다수를 생성합니다.
