이 작품 재생 의학 (CIRM; DR1 01444, CL1 00521, TB1-01177, FA1 00616 및 TG2-01151 보조금), 버몬트 커뮤니티 재단, Breaux 재단, 비전, 캘리포니아 연구소에 대 한 화 환 이니셔티브에 의해 지원 되었다 그리고 기초 싸우는 장 님 윈 Gund 변환 연구 가속 프로그램.

1. 프로토콜의 하루 14 일 0 시 약 준비 <ol><li>다음 중간 구성 요소 준비: 100 x N2 보충의 2 개 mL의 1 mL을 추가 하 여 <ol><li>망막 차별화의 만들 100 mL 매체 (RDM) 50 x B27 보충, 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) Dulbecco의 96 mL에 x 100의 1 mL &#39; s 수정 필수 매체/영양소 혼합 F12 9 (DMEM/F12).</li>
		<li>게 10 mL의 멸 균 물, vortexing, 볼륨 살 균 물 10 mL에 8 mL에 NIC의 녹이는 1.221 g 1 M 니코틴 (NIC)의. 멸 균 필터 솔루션.</li>
	</ol></li> <li>다음 성장 요인 및 작은 분자 준비: <ol><li>Reconstitute 재조합 마우스 머리, 인간 dickkopf WNT 신호 통로 억제제 1 (DKK-1), 100 µ g/ml 각 0.1% 소 혈 청 알 부 민에 IGF-1 (BSA) 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS). 필요에 따라 약 수와 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장소.</li>
		<li>다시 10 µ g/mL 및 재조합 형 인간/마우스/쥐 Activin A를 100 µ g/mL 각 PBS에 0.1 %BSA FGF-기본 구성. 필요에 따라 약 수와 최대 1 년-80 ° C에서 저장소.</li>
		<li>Reconstitute 수 5402 (FGF 수용 체 특정 티로신 키 니 아 제 억제 물) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase 키 3, GSK-3β, 억제제) 10 m m 각 디 메 틸 sulfoxide (DMSO). 약 수와 최대 1 년 또는 6 개월,-20 ° C에 게 각각.</li>
	</ol></li> <li>하루 0 / 하루 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (EDTA PBS의 1 L 당 0.2 g), 1 X PBS-/-다음을 얻기 없이 칼슘 또는 마그네슘, pH 7.4 (PBS), 1 x 트립 신 같은 분리 효소 (TDE) DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE 지원 매체 (RSM), 및 Y-27632 dihydrochloride (10 µ M에서 사용).</li>
</ol> 2. : 0 하루 차별화 Pluripotent 줄기 세포 통로의 뿌리고 전에 약 80% 합류 급지대, 혈 청 없는 조건에서 <ol><li>성장 줄기 세포 식민지. 
	참고:이 단계를 최적화에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>코트 12 잘 플레이트 세포 외 매트릭스 기반 하이드로 겔 (ECMH) 제조 업체의 권장 사항에 따라와. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c.</li>
	<li>RDM와 PBS-/-성장 요소를 추가 하기 전에 하루에 0 하 고 37 ° C에 물 욕조에 따뜻한 필요한 양의 약 수. 실내 온도에 EDTA를 가져올.</li>
	<li>는 10mm NIC, 50 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1으로 따뜻하게 RDM 0 하루에 필요한 성장 인자를 추가합니다. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC의 100 µ L, 머리의 5 µ l, 1 µ L DKK-1, 그리고 IGF-1의 1 µ L RDM의 10 mL.</li>
	<li>모든 차별화 된 식민지에서 차별 화를 위한 passaged 줄기 세포 형태에 따라 제거를 선택 합니다. P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 수동으로 제거 하는 차별화 된 셀. 
	참고: 식민지 내의 불투명 셀 뿐만 아니라 식민지 사이 Fibroblastic 셀 제거할 차별화 된 셀을 나타냅니다. 차별화 된 셀에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.</li>
	<li>12-잘 접시 (1:4)의 4 우물으로 6 잘 플레이트의 단일 잘 통과. 
	참고:이 단계에서 줄기 세포를 뿌리고에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
	<ol><li>줄기 세포에서 줄기 세포 중간 발음 하 고 씻어 미리 데워 공영-/-의 2 개 mL를 한번 우물.</li>
		<li>발음 PBS-/-와 린스 각 세 번 잘 6 잘 플레이트의 당 EDTA의 1 mL.</li>
		<li>부드럽게 접시를 기울기 고 EDTA를 발음. 중간 셀 리프팅 피하기 위해 어떤 식으로든에서 접시를 선동 하지 마십시오.</li>
		<li>3 세척 후 EDTA의 1 mL을 추가 하 고 3-5 분에 대 한 후드에 실 온에서 품 어. 이 잠복기 동안 접시를 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>는 EDTA를 발음 하 고 여분의 매체의 0.5 mL와 함께 시드 것입니다 잘 당 RDM의 1 mL를 추가 합니다. 예를 들어 12-잘 접시의 4 우물에 접시를 RDM의 4.5 mL 6 잘 플레이트의 1 세척.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드럽게 세포를 분리. 원뿔 튜브에 있는 모든 셀을 수집 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 RDM 셀 triturate. 셀의 큰 덩어리를 분리 하지만 단일 세포 현 탁 액을 triturate 하지 마십시오. 셀에 피펫으로에 균등 하 게 배포 합니다. 접시에 뚝을 방지 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료.</li>
		<li>ECM 코팅 12-잘 접시 (잘 당 세포 현 탁 액 1 mL)에 셀 씨.</li>
		<li>우물에 걸쳐 균등 하 게 셀을 앞뒤로 접시 기울기. 부드럽게 장소에서 37 ° C, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 다음 중간 변경까지.</li>
		<li>참고 정확한 시간. 매일 같은 시간에 변경 중간.</li>
	</ol></li></ol> 3. 하루 1 ~ 14: 추가의 성장 요인 <ol><li>1 일: 모든 우물 (우물 당 1 mL)에 매체 변경 RDM을 사용 하 여 0 (단계 2.4 참조)에 대 한 성장 인자 성분과.</li>
	<li>주 2: 10 mm NIC RDM (우물 당 1 mL), 5 ng/mL FGF-기본, 10 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC, FGF-기본 5 µ L, 머리의 1 µ L, DKK1의 1 µ L 및 i g f 1의 1 µ L의 100 µ L RDM의 10 mL.</li>
	<li>주 4: 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, DKK1의 1 µ L 및 IGF-1의 1 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL. 
	참고:이 단계에서 세포는 confluent 관찰.</li>
	<li>주 6: 5402 100 ng/mL activin A와 10 µ M 수 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 activin A의 10 µ L 및 10 µ L의 수 5402 ~ 10 mL RDM 추가.</li>
	<li>일 8, 10, 12: 3 µ M와 100 ng/mL activin A, 10 µ M 수 5402, RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경 CHIR99021. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, 10 µ L의 수 5402, 및 CHIR99021의 3 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL.</li>
</ol> 4. RPE의 통로 0에 농축 하루 <ol><li>코트 6 잘 플레이트 성장 인자와 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH를 감소. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c.</li>
	<li>약 수 필요한 DPBS의 볼륨과 RDM의 농축 및 37 물 욕조에 따뜻한 음 당 1 mL ° C. 가져와 37의 실내 온도 따뜻한 필요한 볼륨 RSM, 항균 약, 및 Y-27632의 TDE ° c.</li>
	<li>추가 항균 성 시 약 그리고 Y-27632 0.5 x 및 RSM 각각 10 µ M 작곡. 첫 번째 4-7 일 동안이 매체를 사용 하 여 첨부 파일을 개선.</li>
	<li>Aspirate 지출된 매체에서 우물 및 미리 따뜻하게 RDM (성장 인자 필요)의 당 1 mL을 추가.</li>
	<li>해 현미경을 사용 하 여 수동으로 해 부와 P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 모든 비 RPE 세포 떨어져 다쳤어요. 
	참고: 예의 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오.</li>
	<li>RDM 발음 해 부, 후와 모든 파편 세포. 잘 당 미리 따뜻하게 DPBS의 1 mL로 두 번 세척.</li>
	<li>12-잘 접시의 당 TDE의 0.5 mL을 추가 하 고 5 분 부드럽게 접시에서 셀을 제거 하려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 품 어. P1000 피펫으로 부드럽게 셀/TDE 정지를 3-4 회를 위아래로 pipetting으로 triturate를 사용 하 여 균일 한 현 탁 액을 만듭니다.</li>
	<li>셀/TDE 정지 Y-27632 없이 미리 따뜻하게 RSM에 1시 10분 희석. 실 온에서 5 분 동안 173 x g에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>발음 셀 펠 릿에서 매체와 10 µ M와 RSM에 셀 resuspend Y-27632 (1 mL 당 잘 농축).</li>
	<li>변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산.</li>
	<li>씨 셀 성장 인자 감소 ECM 코팅 플레이트 1 x 10 5 셀/cm 2 10 µ M와 RSM의 4 mL Y-27632.</li>
	<li>10 µ M는 RSM 바꿉니다 Y-27632 셀 시드 후 48 h 대체 미디어 (예: 월요일과 목요일에) 매 3-4 일을 계속. 10 µ M를 교체 하지 마십시오 4-7 일 후 Y-27632.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO 2 28 ~ 35 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 대체는 RSM 매 3-4 일 (예: 월요일과 목요일에) 계속.</li>
</ol> 5. 성숙: 통로 1과 2의 RPE 참고: 괄호로 표시 된 볼륨의 6 잘 플레이트 또는 T75 플라스 크 1에 대 한 표시 됩니다.
<ol><li>통로 0의 28 ~ 35 일 사이 코트 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH와 6 잘 플레이트 (T75 플라스 크).</li>
	<li>약 수 DPBS 볼륨 RSM 필요 하 고 37 물 욕조에 따뜻한 실내 온도에 ° C.가지고 TDE.</li>
	<li>Aspirate 우물에서 매체와 세척 잘 두 번와 함께 보낸 미리 따뜻하게 DPBS의 2ml (10 mL). 
	참고: 10 µ M를 사용 하지 마십시오 Y-27632.</li>
	<li>발음 DPBS TDE의 1 mL (5 mL)을 추가 하 고. 5 분 동안 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 넣습니다. 부 화, 후 보기 세포 세포를 확인 하는 거꾸로 한 현미경에 계약 하 분리.</li>
	<li>부드럽게 잘 또는 플라스 크의 밑면에서 셀을 제거는 적절 한 크기의 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여.</li>
	<li>P1000 팁 (10 mL 혈 청 학적인 피펫으로)를 사용 하 여 부드럽게 triturate 셀/TDE 정지 아래로 3-4 회를 균일 한 현 탁 액을 만듭니다.</li>
	<li>는 RSM에 셀 서 스 펜 션 1시 10분 희석. 린스 잘/플라스 크 희석된 세포 현 탁 액에 추가 하는 RSM의 2 mL (5 mL)을 예약. 
	참고: 초과 25 분 효소 노출 시간을 허용 하지 않습니다</li>
	<li>173 x g 실 온에서 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심.</li>
	<li>셀 펠 릿에서 매체를 발음 하 고 RSM의 1 mL (5 mL)에 셀 resuspend</li>
	<li>변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산.</li>
	<li>1 x 10 5 셀/cm 2 4 mL (15 mL) RSM의 ECMH 코팅 접시에 셀 씨.</li>
	<li>30 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 변화는 RSM 3-4 일 마다 계속.</li>
	<li>하루 30 구절 구절 1 ~ 2에서에서 셀에 위의 절차 (단계 5.2-5.11)을 반복.</li>
</ol> 6. 중간 셀 은행 만들기:의 Cryopreservation 통로 2 일 3-5 RPE 참고: subconfluent (50%) 이며, 안료를 회복 하지는 하는 동안 셀 Cryopreserve.
<ol><li>Cryopreservation 매체의 볼륨 10% DMSO 3 x 10 6 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 계산 셀의 수에 따라,.</li>
	<li>수행 단계 5.2 5.8입니다. 3 x 10 6 셀/mL에 10 %DMSO cryopreservation 매체에 셀 펠 릿 resuspend 고 1.2 mL 극저온 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL.</li>
	<li>-1 ° C/min에서 멋진 하룻밤-80 ° C에서 배치 하는 설계 된 냉동 컨테이너에 극저온 튜브를 배치 합니다. 장기 저장을 위한 액체 질소에 전송. 
	참고: 이러한 셀 녹고 시 통로 3 될 것입니다. 셀을 특성화 하기 전에 30 일에 대 한 문화. 씨앗 통로 3 RPE 1.5 x 10에서 5 cm 2 녹고 시 당. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease.">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li><li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelial+Cells:+Development+In+Vivo+and+Derivation+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+In+Vitro+for+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li><li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical/&#946;-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells.">Canonical/&#946;-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel,+synthetic+substrate.">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium:+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage.">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-directed,+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. 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박사 Clegg 재생 패치 기술 LLC의 공동 설립자 이다.

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드는 피더, 혈 청 없는 문화 메서드에서 두 인간의 배아 및 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 최적화 되었다. 1998 년에 인간 배아 줄기 세포의 초기 절연 하 고 2007 년에 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 파생, 이후 다양 한 줄기 세포 배양 방법 되었습니다14,,1516, 개발 17. 이러한 메서드는이 차별화에 취약 줄기 세포 식민지 생산 충분 해야 한다. 제대로 파생 하 고 유지 pluripotent 줄기 세포를이 방법의 적용에 알려진된 제한이 있다.
가장 중요 한 단계는 차별화 (2.5 단계)의 0에 줄기 세포와 수동의 해 부 하루 14 (4.5 단계) 과정에 대 한 잠재적인 필요성의 뿌리고. 줄기 세포 식민지에서 차별화 된 세포를 제거 하 때, 켄트18에서 이미지를 참조 하십시오. 같이, 식민지와 식민지 내의 불투명 셀 사이 fibroblastic 셀18이 프로토콜 시작 하기 전에 제거 해야 하는 차별화 된 셀을 나타냅니다. 정의 된 가장자리와만 undifferentiated, 단단히 포장 식민지 차별 화를 위한 passaged 해야 합니다.
잘 (단계 2.6.7) 당 시드 줄기 세포 수가 줄기 세포 통과 따라 단일 셀 서 스 펜 션에 triturated 수 없습니다 고 수 없습니다 정확 하 게 계산 된 hemocytometer를 사용 하 여 사실에 의해 복잡 합니다. 80 %confluent 줄기 세포의 근사는 12-잘 접시의 4 우물에 뿌리고 1 6 잘 플레이트의 잘 표시 됩니다. 성장 율 등 줄기 세포 라인의 차이점 미숙한 RPE 일 0 ~ 4 사이의 합류를 도달 하는 얼마나 빨리 발생할 수 있습니다. 줄기 세포는 정확한 합류에 RPE를 생산할 예정 이다 하지만 셀 수확량 부정적인 영향을 세포가이 단계에서 너무 부족 하는 경우. 미 숙 RPE 세포 하루 4 주 1에 거의 100% 합칠 약 40-50% 합칠 이어야 한다. 셀 4 또는 6 일까 confluent 단층을 생산 하지는 경우 0에서 프로토콜 높은 시드 밀도에서 반복 한다. 예를 들어 6 잘 플레이트의 1은 0에서 12-잘 접시의 4 우물에 passaged 미 숙 RPE의 하루 4에서 100% 합칠을 하지 않는 경우 0에 1:3 또는 1:2 통로에 시드 줄이거나 더 confluent 될 줄기 세포 허용 전에 뿌리고. 여러 셀 라인 비교 일관 된 시드 밀도 설정 하는 것이 중요 하다.
하루 14에 수동 절 개 단계가입니다 비 RPE 세포는 문화 (그림 2C)에 존재 하는 경우에 필요. 프로토콜에 CHIR99021의 추가, 이후 많은 pluripotent 줄기 세포 라인에 작은 수동 절 개가 필요합니다. 일부 준비 신경 패치의 높은 발병 률을가지고 그리고 그 세포를 제거 하는 것이 중요. RPE 0 통과 통로 3에서 가능한 경우, 모든 비 RPE 세포를 제거 하는 충분 한 시간을가지고 차별화 프로토콜 반복 가능 하다. 이 자주 발생 하지 않습니다 하지만 그것은 필요할 때 하루에 14에 있는 해 부 단계를 최적화할 수 있습니다 참고로 여기 언급.
비용 뿐 아니라 문화 방법, 효율, 정량화에서 변화 하는 RPE 분화 프로토콜의 다양 한 고 기능성 평가, 후자는 되었습니다 검토 철저 하 게2. 우리는 14 일 방법의 효능, 적응성, 및 셀 라인4,,78의 넓은 범위에 적용 여기서 설명 선호 합니다. 이 프로토콜에서 cryopreservation 단계는 또한 나중에 사용, 실험에 많은 많은 변화를 피하는 중간 셀 은행을 만드는 주요 이점을 제공 합니다. 12-잘 접시의만 4 우물에서 시작 해 서, 그것이 통로 0에서 6-잘 접시와 통로 1과 2에 T75 플라스 크로 확장 가능 합니다. 통로 2 일 3-5에 셀 여전히 subconfluent 그리고 안료, 회복 하지는 가능 하다 cryopreserve 세포의 수백만의 수만 하 고 성숙한 RPE, 지정 통로 3 일간 30을 해 동 하, RNA 식, 단백질 표정, 성장 인자를 확인 하기 분 비, 식 균 작용, 등등입니다. 우리는 또한 최대 13 구절 19RPE 확장 프로토콜을 설립 했다.
앞으로 봐서,이 방법은 iPSC 눈 질병의 모델링 및 생성 RPE 세포 치료에 대 한 유용 있을 것입니다. IPSC 질병 모델링에 관해서는이 프로토콜 RPE CRISPR 수정 같은 환자에서 수정 되지 않은 컨트롤 라인에서 생산 하는 실험실에서 사용 현재 됩니다. 또한,이 프로토콜은 합성 기판 및 세포 치료에 필요한 좋은 제조 관행을 준수 하는 데 유용 이종 무료 조건에 적응할 수 있습니다.

망막 색소 상피 대뇌에 대 한 중요 한 지원을 제공 하는 색소 세포의 단층 이다. 망막 색소 상피 세포 (RPE) 비전, 빛을 흡수, 영양소와 이온 수송, retinoid 사이클링, 포토 리셉터 외부 세그먼트 먹어서에 있는 수많은 기능 그리고 성장 인자 분 비1. 망막 dystrophies RPE 및 비전, 연령 관련 황 반 변성, 망막 화 등의 손실에 결과의 기능에 영향을 주는 다양 한이 있다. RPE의 만능 줄기 세포에서 생성 수 있습니다 이러한 눈 질병을 이해 하는 연구 하며 셀 요법2RPE의 무제한 소스를 제공할 수 있습니다. 사실, 여러 임상 시험 진행 RPE pluripotent 줄기 세포3에서 파생 된 사용 하는.
이 분화 프로토콜 Buchholz4 에 의해 원래 기술 되었다 고 Clegg5에서 이전에 게시 방법에 근거 했다. 절차 정상적인 vivo에서 발달 과정 조작 인슐린 성장 인자 (IGF), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF-2; 통해 RPE 운명 향해 undifferentiated pluripotent 줄기 세포를 직접 모방 FGF-basic), 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 및 WNT 통로4,5. 프로토콜은 크게 나왔고 97.77% ± 0.1% pre melanosome 단백질 (PMEL) 긍정적인 세포, 그리고 이종 무료 조건6,7에 적응 되어 프로토콜에 늦게 WNT 통로 주 작동 근의 추가 의해 향상 됩니다. 결과 RPE 사본 및 단백질 수준 적절 한 극성으로 알려진된 RPE 성장 인자를 분 비 하는 포토 리셉터 외부 세그먼트8먹어서 수행 RPE 마커를 표현 하기 위해 표시 되었습니다. 이 프로토콜은 더 신속 하 고 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자8의 간단한 제거를 포함 하는 차별화의 "자발적인" 프로토콜 보다 안정적입니다. 또한, RNA 시퀀싱 데이터 표시 RPE이이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 그 얻은 일반적인 자발적인 방법8을 사용 하 여 매우 유사 하다. 14 일 메서드 Mazzoni9 (안료, 편광, phagocytic, 포스트 mitotic, 다각형)9에 의해 언급 "5 P의" 맞는 RPE 생성 합니다. 이 절차는 여러 실험실에서 재현할 것을 입증 했다, 그러나 최근 몇 년 동안10,,1112 에 게시 된 몇 가지 추가 감독된 차별화 방법을 인정 하 길 , 13.

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet</td><td>Baker</td><td>model: SG603A-HE, type: A2, class: 2</td><td>6&#039; Baker laminar flow biosafety cabinet</td></tr><tr><td>Dissection Hood</td><td>Labconco</td><td>Model 3970405</td><td>laminar flow bench top</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td>heated stage</td></tr><tr><td>air-jacketed CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC and 5% CO2</td></tr><tr><td>inverted phase contrast microscope</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth Factors and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse noggin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human DKK-1</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IGF-1</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human/mouse/rat Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF inhibitor</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Substrates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>growth factor reduced ECMH</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (no calcium, no magnesium)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE supporting medium)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>cryopreservation medium</td></tr><tr><td>1.2 mL Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (freezing container)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>freezing container</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>antimicrobial reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>Used during differentiation.</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Used during RPE maturation.</td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>Used during RPE maturation.</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Used during passages.</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Used during passages before cell count.</td></tr></tbody></table>

rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells

만능 줄기 세포의 감 별 법으로 망막 안료 상피 세포 (RPE)를 직접 하는 강력한 방법을 설명 합니다. 제공 하는 상세 하 고 철저 한 프로토콜의 목적은 각 단계를 명확 하 게 설명 하 고이 분야에서 연구원에 게 쉽게 사용할 수 있도록. 이 프로토콜 필요 최소한의 또는 더 수동 해 부와 RPE의 동종 계층에서 발생 합니다. 여기에 제시 된 방법을 위해 효과적 이기 위하여 보였다 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 인간 배아 줄기 세포. 또한, 우리 cryopreservation 중간 셀 은행의 장기 저장을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 RPE iPSC 접시에 질병 모델링 또는 임상 응용 프로그램에 유용할 수 있습니다.

이 메서드는 RPE의 균질, 안료, 및 cuboidal 단층의 생산에 결과. 그림 1 에 타임 라인 이미지 그림2에 해당 합니다. 그림 2A같이 줄기 세포 식민지 식민지 또는 식민지 내의 불투명 셀 사이 fibroblastic 셀 정의 된 가장자리와 밀접 하 게 포장 된다. 그림 2B 에 subconfluent는 미숙한 RPE의 표현을 제공 합니다. 만약 셀 이미 confluent이 단계에서 그들은 차별화 과정에 중요 한 계획을 확장할 수 없습니다. 심각 하 게 subconfluent 셀 수 설정 하는 단층 고 단단한 접속점, 상피의 형성 됩니다. 이 합류를 최적화 하는 방법에 대 한 내용은 토론 섹션에 설명 되어 있습니다. 그림 2C 표시 비-RPE이 분화 과정 중 발생할 수 있는 두 가지 가장 일반적인 유형의 형태: 신경 또는 fibroblastic 패치. 그것은 정의 fibroblastic 같은 패치는 거의 해 현미경에 반투명 반면 이러한 신경 패치 해 현미경에 특히 불투명 표시 해야 합니다. 그것은 더 쉽게 합성 가벼운 현미경과 해 현미경에 그들을 식별 하는 에탄올 증거 실험실 펜 조직 문화 접시에 이러한 영역을 표시 하려면 유용할 수 있습니다. 그림 2D-F 특성 밝은 테두리, 조약돌 형태학 및 RPE의 건강 하 고 성숙한 문화를 나타내는 착 색을 표시 합니다. 그림 3 은 단계 대조와 밝은 분야 현미경 검사 법에 의해 묘사 하는 완전히 성숙한 RPE의 다른 모습을 보여 더 높은 확대 이미지입니다. 통로 3 일간 30, 세포는 RNA, 단백질 표정, 성장 인자 분 비, 표현과 먹어서2,4,6 등 이전 출판물에서 설명 된 특성에 대 한 ,7. 이러한 characterizations 이러한 이미지에 표시 하는 셀은 뿐만 아니라 안료 cuboidal, 하지만 또한 phagocytic, 포스트 mitotic 그리고 편광 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
그림 1:. 성장 요인의 추가 및 RPE의 성숙에 대 한 타임 라인. 성장 인자는 하루 0-14에서에서 12-잘 접시에 추가 됩니다. RPE 성숙은 6 잘 플레이트 또는 30 일 후 재개 (통로 3 일간 30)에 농축의 날부터 T75 플라스 크에서 경작 된 화살표는 효소 셀 뿌리고 나타냅니다. (A-E) 아래 그림 2에 이미지에 해당 하는 타임 라인. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
그림 2: 대표적인 형태 및 RPE 성숙의 합류. 유도 만능 줄기 세포 감 별 법 (A)에 뿌리고 직전. 하루 2 (B)에서 일 14;에 선택 제거 농축 전에 미 숙 RPE 세포 subconfluent 비 RPE 패치 (흰색 화살표 표시) 패치 또는 불투명 "리본" (C)으로 표시 됩니다. RPE 통로 0, 1 및 3 일 30에에 (D, E 및 F). 눈금 막대 = 200 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
그림 3: RPE 통로 3에 성숙: 하루 30 Cuboidal 형태학 단계 대조 (A)에 묘사 된 고 밝은 필드 (B)에 묘사 된 착 색. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K 조회수.  University of California, Santa Barbara. 이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

유전학

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

의학

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

인간 배아 줄기 세포에서 향상된 3D 신경 망막 분화

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

저자 스포트라이트: 질병 모델링을 위한 간단하고 효율적인 신경 망막 오가노이드 생산

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

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Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

인간 만능 줄기세포에서 신경 망막 생성

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