This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

1. 팁 수정 <ol><li> 구매 질화 규소 (Si3N4), 실리콘 팁 AFM 캔틸레버 (~ 2 nm 인 캔틸레버 공칭 반경). </li><li> 20 분 동안 무수 에탄올에 침지하여 각 AFM 캔틸레버를 청소합니다. 실온에서 건조. 그런 다음 5 분 동안 O 2 플라즈마에 노출시킴으로써, 캔틸레버를 처리한다. </li><li> (15)의 비율 (3cm) 용액을 함유하는 메틸 트리에 톡시 실란 및 3- (아미노 프로필) 트리에 톡시 실란을 상기 클린 팁 일시 : 1 (V / V)를 불활성 분위기 (질소 또는 아르곤 중)하에 데시 케이 터에서하고 데시 케이 터에 연결 진공 펌프. 2 시간 동안 진공 혼합 실란 화합물의 두 종류의 단층을 형성한다. </li><li> 핫 플레이트에 팁을 배치 (이 과정에 대한 제작) 금속 팁 홀더를 사용합니다. 이어서 대기압 조건에서 70 ° C에서 10 분 동안 팁을 건조. 사용하기 전에 에탄올을 사용하여 핫 플레이트, 금속 홀더와 핀셋을 청소합니다. </li><li> 객실 t의 팁 쿨럼 온하고 1 시간 동안 0.5 % (v / v)의 트라이 에틸 아민을 함유하는 클로로포름 5mm의 농도 플루 오레-PEG-N 히드 록시 숙신이 미드의 용액 (FMOC-PEG-NHS, MW 5,000 다)시에 끝 몰입 실온. </li><li> 5 분 동안 클로로포름의 팁을 찍어 후 추가로 5 분 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 찍어. 부착 된 PEG 분자의 FMOC기를 탈 보호하기 위해 30 분 동안 DMF 중의 20 % 피 페리 딘 (V / V)의 팁을 담근다. 4 분 후, 추가로 4 분 동안 N- 메틸 -2- 피 롤리 돈 (NMP)에 DMF에 팁을 찍어. 세 번 찍기 순차를 반복합니다. </li><li> 아미노산의 커플 링, 보호 N 말단 아미노산 (AA) / 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIPEA) / 2- (1H- 벤조 트리아 졸 -1- 일) -1,1,3,3- 테트라 메틸 hexafluophosphate을 함유하는 용액으로 끝 몰입 1.5 시간 동안 5 ㎖ NMP 30 mm의 총 농도에서 1 : 1 : 1의 몰비 (HBTU). </li><li> 펩티드 결합의 경우, 5 ㎖의 용액으로 계속 팁을 찍어보호 된 펩타이드의 40 mg의 aining (N 단자와 사이드 체인, 예를 FMOC-Gln의 (트리트) -Pro-의 Ala-빼앗아 (tBu 중에서) -Ser (tBu 중에서) -Arg에 대한 (PBF) -Tyr (tBu 중에서) -COOH.) 15 mg의 2- (1H- 벤조 트리아 졸 -1- 일) -1,1,3,3- 테트라 메틸 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU), 및 2 시간 동안 NMP에 DIPEA 5 ㎖. </li><li> 4 분 동안 NMP의 팁을 찍어. 이어서, 아세틸기로 리밍 무료 / 미 NH 2 보호 몰비 4에 무수 아세트산 / DIPEA의 혼합물을 30 분 동안 팁을 찍어 : 1 NMP에서 0.65 M의 합계 농도. </li><li> 펩타이드 결합의 경우, 두 개의 추가 단계를 수행합니다. <ol><li> 펩티드의 측쇄 탈 보호 1 시간 동안 95 % TFA, 2.5 % 트라이 아이소 프로필 실란 및 2.5 %의 물을 함유하는 용액으로 끝 몰입하고 클로로포름, DMF로 세척하기 위해. </li><li> 30 분 동안 DMF 중의 20 % 피 페리 딘 (V / V)로 팁을 펩티드의 FMOC기를 제거 몰입하기 위해. </li></ol></li><li> 순차적으로 펩타이드 / 아미노산 기능화를 찍어클로로포름, 50 % 에탄올 및 물 (아미노산) (펩티드) DMF 또는 NMP에서 네 분마다 D 팁. 마지막으로 공기의 팁을 건조. </li></ol> 2. 표면 준비 <ol><li> 운모를 준비합니다. 스카치 테이프를 이용하여 각각의 사용 전에 기판 (9.9 mm 직경)을 절단. 그런 다음, 트리플 증류수 (TDW)로 표면을 세척한다. </li><li> 산화 티타늄이 코팅 된 실리콘을 준비합니다. <ol><li> 다이아몬드 펜을 사용 2cm 사각형으로 실리콘 웨이퍼 (100)를 잘라. </li><li> 아세톤으로 채워 15 ㎖의 시험관에 상기 기판을 위치시키고 초음파 조에서 5 분 동안 초음파 처리하여. 이어서, 이소프로판올로 채워진 15ml의 시험관이 배치면을 5 분 동안 초음파 처리하여. 질소를 이용하여 기판을 건조. </li><li> 5 % (중량 / 부피) 용액을 제조하기 위해 에탄올에 계면 활성제 (예하여, Byk-348)를 녹인다. 그 후, 2 ㎖의 30 %의 이산화 티탄 분산액에 계면 활성제 용액 0.02 mL를 첨가. </li><li> 생성 된 용액에서 0 캐스트 놓습니다.깨끗한 Si 기판에 2 mL를. </li><li> 공기에서 2 시간 동안 250 ° C에서 이러한 드롭 주조 표면을 어닐링. (41) </li></ol></li></ol> 3. 단일 분자 힘 분광학 측정 <ol><li> 시중에서 판매하는 두 구성 요소 접착제와 AFM의 금속 홀더에 원하는 표면을 연결합니다. 작은 페트리 접시 모양 된 AFM의 유리 홀더 금속 홀더를 배치합니다. 트리스 완충액 (50 mM의 pH는 7.4) 또는 원하는 매체와이 홀더를 입력합니다. 그런 다음, 팁 홀더 아래 AFM 무대에 홀더를 배치합니다. </li><li> 약 10 %의 절대 불확실성과 함께합니다 (AFM 소프트웨어에 포함 된) 열 변동 방법 (26)를 사용하여 10 ~ 30 PN / 나노 미터에 이르는 스프링 상수와 AFM의 캔틸레버를 보정합니다. </li><li> 이 압축에 의해 기판과 접촉 할 때까지 기판에 아미노산 또는 펩티드 - 작용 팁에 근접하여 상호 작용하는 힘을 측정~ 200 PN의 힘과 즉시 ~ 200 nm의 거리를 0.1 ~ 0.8 μm의 / s의에서, 다양한 속도로 끝을 철회. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 포토 다이오드 감도 (V / m)을 승산하고, 실험적으로 결정된 스프링 정수를 사용하여 (V)을 강제로 변위 값을 변환한다. (42)이 AFM 소프트웨어에 의해 자동으로 수행된다. <ol><li> 곡선의 단일 분자 이벤트, 기록 수백 (800-1,500)와 FD 곡선을 구하십시오. 단일 분자 곡선의 두 피크를 얻었다 : 첫 번째 피크는 팁과 표면과 표면 분자의 특이 적 상호 작용에 대한 두 번째 피크 사이의 대응 비특이적 상호 작용을 나타낸다. 상기 FD 곡선이 두 피크 이상을 함유하는 경우, 가장 가능한 힘의 계산에서 그들을 버린다. 참고 : 하나의 접착 이벤트가 (10에서 곡선의 30 %)을 고려됩니다. (43) </li></ol></li><l난&gt; 다음의 히스토그램의 제조에 사용되는 부하율의 세트를 획득하기 직전 파열 겉보기 충전율 웜 형상 쇄 (WLC) 모델 (44)과의 거리 커브 대 맞는 적어도 50 힘을 계산하는데 명백한 로딩 속도. 기판으로부터 캔틸레버를 분리 한 후에 시행 점프의 펩타이드 / 아미노산과 표면 사이의 결합 해제 력을 유도. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

프로토콜에서 1.3, 1.4 및 1.7의 광범위한 치료에 매우 부드러운 방식으로 수행되어야 단계. 단계 130에서, 팁 실란 혼합물 실란 화 과정이 불활성 대기 (수분이 없음)에서 수행되어야 접촉이어야한다. (45) 이것은 적층 형성을 방지하기 위하여 실란 분자가 쉽게 수분의 존재하에 가수 분해를 받아야하기 때문에 수행된다. (45) 단계 140에서, 온도 및 시간을 적절하게 유지되어야한다. 단계 1.5을 시작하기 전에, 팁은 실온으로 냉각한다; 그렇지 않으면이 손상됩니다. 결합 단계 (170)에서, HBTU 및 검사 아미노산 또는 펩티드 완전히 혼합물에 용해한다. 결합 후, 다른 용매와 팁을 세척하는 팁에 대한 손상을 방지하기 위해 매우 부드러운 방식으로 수행해야합니다. 보고 된 기술은 APPL 될 수 있습니다어떤 펩타이드 나 아미노산에 IED. 실리콘 팁을 수정하려면, 우리는 실란을 사용합니다. 이 변경 될 수 있습니다 일반적인 화학이다. 예를 들어, 하나의 팁을 수정하는 PEG 화 실란 중 두 가지 유형을 사용할 수있다. 팁은 금으로 제조되는 경우 23, 25, 26 후 티올 기의 선단부의 변형에 사용될 수있다. 대체 프로토콜 니트릴 로트리 아세테이트 (NTA)이 함께 재조합 히스티딘 표지 된 단백질, 히스티딘 타겟팅 할 링커를로 끝나는 이용한다. 최근 Lyubchenko 등. 합성을 설명하고 신규 중합체 링커 검사 SMFS 여러 실험에서의 응용을 나타내었다. 링커의 합성이 잘 발달 포스 (PA) 화학을 기반으로합니다. 이 화학 물질은 소정의 길이와 PA 조성 링커의 일상 합성을 할 수 있습니다. 이러한 링커는 길이가 균일하고 다양한 작용기로 종결 될 수있다.또한, 생체 분자는 황원자 골드 폼 공유 결합 네이티브 또는 설계 티올기를 통해 금 기재 또는 팁에 고정 될 수있다. 이 방법은 대량의 단일 분자 레벨에서의 표면으로부터 분자를 바인딩 해제되지하는데 필요한 힘의 양적 상세한 측정을 허용한다. 이 기술의 미래의 애플리케이션은 팁 부착 단백질의 새로운 복합 재료의 설계를 포함한다. 새로운 복합 재료 및 기능면의 설계 및 개발은 무기 물질과 단백질 또는 펩티드 사이의 상호 작용의 기본적인 이해를 얻는 이점 것이다. AFM과 SMFS 여기에서 제공하는 프로토콜은 단백질, 펩타이드 및 다른 표면과 아미노산 사이의 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구 역할을 할 수 있습니다.

단백질과 무기 미네랄 간의 상호 작용은 특유의 특성을 가진 복합 재료의 구성을 이끈다. 이것은 높은 기계적 강도 또는 고유 광학 특성을 갖는 물질을 포함한다. 예를 들어 1, 2, 미네랄 하이드 록시 아파타이트와 단백질 콜라겐의 조합은 서로 다른 기능을위한 연질 또는 경질의 뼈를 생성한다. 3 짧은 펩티드는 높은 특이성과 무기 물질을 바인딩 할 수 있습니다. 도 4를 참조하면, 이러한 펩티드 5, 6 특이성이 결정 9는 나노 물질의 제조, 8, 7, 새로운 자기 및 전자 재료를 설계 성장에 사용 된 (10)와 합성 나노 입자. 11 그러므로 우리가 개선 된 흡착 특성을 가진 새로운 복합 재료를 설계 할 수 펩타이드 또는 단백질과 무기 물질 사이의 상호 작용을 기본 메커니즘을 이해. 면역 반응과 임플란트의 계면이 단백질에 의해 매개되기 때문에 또한, 더 나은 무기 물질과 단백질의 상호 작용을 이해하는 것이 임플란트를 설계 할 수있는 능력이 향상됩니다. 무기 표면과 상호 작용하는 단백질을 포함하는 또 다른 중요한 영역 방오 재료의 제조이다. 12, 13, 14, 15은 생 오손 생물이 표면에 부착 한 바람직하지 않은 방법이다. 그것은 우리의 삶에 많은 부정적인 의미를 가지고있다. 예를 들어, 의료 기기에 대한 세균의 생물 연료는 병원 획득 감염으로 이어집니다. 보트와 대형 선박에 해양 생물의 생 오손은 증가<html> 연료의 소비. 12, 16, 17, 18 단일 분자 힘 분광법 (SMFS)는 원자 현미경을 사용하여, 직접, 아미노산 또는 펩티드와 기판 사이의 상호 작용을 측정 할 수있다. 이러한 파아지 디스플레이, 27 (28) 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 다른 방법 석영 크리스탈 마이크로 저울 (QCM) (29) 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 29, 30, 31, 32,심판 &quot;&gt; (33) 측정 대량의 무기 표면에 펩타이드와 단백질의 상호 작용. 34, 35, 36 그러면 이러한 방법에 의해 얻어진 결과는 분자 또는 응집체의 앙상블에 관한 것을 의미한다. SMFS에서 하나 또는 소수의 분자는 AFM 팁에 고정되고, 원하는 기판과의 상호 작용을 측정한다. 이 방법은 표면으로부터 단백질을 당겨 단백질 접힘 학습하도록 확장 될 수있다. 또한, 세포와 단백질과 그 리간드에 대한 항체의 결합 상호 작용을 측정하는데 사용될 수있다. 37, 38, 39, 40이 논문은 실라 화학 제를 사용하여 AFM 팁에 펩티드 또는 아미노산 중 하나를 부착하는 방법을 상세히 설명한다. 또한, 종이는 힘의 측정을 수행하는 방법 및 분석 방법을 설명결과.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride (Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) AFM cantilevers with silicon tips</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltriethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used for peptide deprotection</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip Fmoc deprotection</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide&amp;nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)</td><td></td><td>Used as the covalent flexible linker&amp;nbsp; (MW = 5,000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, England)</td><td></td><td>Used as a coupling reagent.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformamide)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Ethanol (Anhydrous)</td><td>Gadot (Netanya, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Trifluoro acetic acid (TFA)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>GL Biochem (Shanghai, China).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine and Tyrosine&amp;nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Germany)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; substrate preparation</td></tr><tr><td>Mica substrates</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)</td><td></td><td>9.9 mm diameter</td></tr></tbody></table>

insights into the interactions of amino acids and peptides with inorganic materials using single-molecule force spectroscopy

단백질이나 펩티드 및 무기 물질 사이의 상호 작용은 몇 가지 흥미로운 프로세스로 이어집니다. 예를 들어, 미네랄 단백질을 결합하는 독특한 성질을 갖는 복합 재료의 형성을 이끈다. 또한,의 생물 연료의 바람직하지 못한 프로세스는 표면에 생체 분자를 주로 단백질의 흡착에 의해 개시된다. 유기층은 박테리아 접착층이고 이들 표면과 상호 작용할 수있다. 유기 - 무기 계면에서의 상호 작용을 지배하는 근본적인 힘을 이해하는 것은 연구의 많은 지역을위한 것이 중요하고, 광학 기계 및 생명 의학 애플리케이션을위한 새로운 재료의 설계가 발생할 수 있습니다. 이 논문은 펩타이드 또는 아미노산 및 잘 정의 된 무기 표면 중 하나 사이의 접착력을 측정하기 위해 AFM을 이용하는 단일 분자 힘 분광 기법을 보여준다. 이 기술은 AFM에 생체 분자를 부착하기위한 프로토콜을 포함원자력 현미경에 의해 공유가요 성 링커 및 단일 분자 힘 스펙트럼 측정을 통한 팁. 또한, 이러한 측정 분석이 포함된다.

도 1은 선단부 수정 방법을 나타낸다. 첫 번째 단계에서, 플라즈마 처리는, 질화 실리콘 팁의 표면을 변화시킨다. 끝은 OH 그룹을 제공합니다. 이러한 그룹은 실란과 반응한다. 이 단계의 마지막에, 팁의 표면 자유 -NH 2 그룹에 포함된다. 이러한 유리 아민은 FMOC -PEG-NHS, 공유 링커와 반응 할 것이다. 페그 링커 FMOC 그룹 pipyridine, 탈 보호 시약을 제거한다. 마지막으로, 검토 된 아미노산 또는 펩티드 분자는 결합 시약 HBTU를 사용하여 PEG의 유리 아민 그룹을 통해 결합된다. 수정 된 AFM 팁과 표면 (도 2)와 아미노산 또는 펩티드의 상호 작용을 조사 할 수있다. 페그 분자는 끝에서 펩타이드 나 아미노산을 분리하고 자유롭게 동양에 있습니다. 전형적인 힘 measu포스 - 거리 곡선에서 별 개로 결과 (그림 3). 이 곡선은 표면으로부터 팁 단일 분자 접착 이벤트 분리 특징점을 갖는다. 첫 번째 피크가 특정 부착 이벤트 지칭 팁과 표면과 상기 제 2 피크 사이의 비특이적 인 상호 작용을 나타낸다. 수백 FD 곡선으로부터 그 힘에 비해 접착 이벤트의 수를 플롯하여 히스토그램을 구축하는 것이 가능하다. 이 히스토그램에 가우스 착용감을 적용하면 가장 가능성 힘 (MPF)를 결정합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54975/54975fig1.jpg" /> 그림 1 : 팁 수정 절차. AFM 팁의 화학적 변형의 도식 표현. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54975/54975fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 2 : 실험 장치를 SMF에. 아미노산 또는 펩티드 및 원하는 표면 사이의 상호 작용을 측정하기위한 단일 분자 힘 분광법 설정의 개략도. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54975/54975fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54975/54975fig3.jpg" /> 그림 3 : 힘 - 거리 곡선. 이산화 티탄 표면으로부터 운모 표면, 및 (B) 아미노산 페닐알라닌에서 (A) 펩티드 Gln의 프로 - 알라 글리신 -Ser-빼앗아, 인수-티르 파열 전형적인 단일 분자 FD 곡선. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54975/54975fig3large.jpg" target="_blank">cli를하시기 바랍니다</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 (CK). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54975/54975fig4.jpg" /> 그림 4 : 히스토그램은 가장 가능성 포스 (MPF)를 플롯과 그래프는 힘 대 음모 로딩 속도. 운모의 (B (3.1 ± 0.6 윈 / s (N = 7 8)의 로딩 속도) (A) 펩티드 Gln의 프로 - 알라 글리신 -Ser-빼앗아, 인수-티르의 파열 력 값의 전형적인 히스토그램 ) 이산화 티탄의 아미노산 페닐알라닌 (4.2 ± 0.7 윈 / s (로딩 속도에서 N = 79)). 가장 가능성 포스 (MPF) 값은 가우시안 피트 (검은 선)에 근거하여 계산 하였다. (C) 상기 펩티드 Gln의 프로 - 알라 글리신 -Ser-빼앗아, 인수-티르 및 (D) 아미노산 페닐알라닌 파단 부대 로딩 속도 의존성. 운동 파라미터는 겉보기로드 (R)의 대수 대 힘의 선형 플롯으로부터 외삽먹었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54975/54975fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

8.0K 조회수.  The Hebrew University of Jerusalem.  여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다. 

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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

연구

생체공학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

생화학

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

공학

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

화학

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the lack of high throughput capabilities, the application of these techniques is limited in biophysics. Ensemble force spectroscopy (EFS) has demonstrated high throughput in the investigation of a massive set of molecular structures by converting mechanochemical studies of individual molecules into those of molecular ensembles. In this protocol, the DNA secondary structures (i-motifs) were unfolded in the shear flow between the rotor and stator of a homogenizer tip at shear rates up to 77796/s. The effects of flow rates and molecular sizes on the shear forces experienced by the i-motif were demonstrated. The EFS technique also revealed the binding affinity between DNA i-motifs and ligands. Furthermore, we have demonstrated a click chemistry reaction that can be actuated by shear force (i.e., mechano-click chemistry). These results establish the effectiveness of using shear force to control the conformation of molecular structures.

Ensemble force spectroscopy (EFS) is a robust technique for mechanical unfolding and real-time sensing of an ensemble set of biomolecular structures in biophysical and biosensing fields.

전단력에 의한 앙상블 힘 분광법

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

A Fourier Transform Infrared Spectroscopy Technique to Study Peptide Self-Assembly

To prepare a self-assembly solution, dissolve 1 milligram of the lyophilized peptide powder in a mixture of 20% acetonitrile and 10-millimolar HEPES in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Then, vortex the assembly solution and leave the sample to assemble at room temperature.
When the peptide assembly reaches maturation, dry 8 to 10 microliters of the assembly solution as a thin film on the attenuated total reflection diamond crystal, and monitor the disappearance of a large and broad water peak from 1,640 to 1,630 inverse centimeters as the dry film forms.
Acquire background and infrared spectra from 1,500 to 1,800 inverse centimeters, averaging 50 scans with a 2-inverse centimeter resolution, subtracting the background scans prior to each sample scan.
The infrared signature for beta-sheet assembly should be observed as a sharp peak between 1,625 and 1,635 inverse centimeters.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

요약

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마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

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원자 힘 분광학에 의해 단일 분자 접착 조사

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AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

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