Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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저자는 도움이 대화를 교수 토마스 라이너, Jacob 박사 호튼 박사 서지 Lyaschenko 감사합니다.

설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다. J591에 DFO-NCS 1. 활용 <ol><li> 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에서, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PH 7.4), 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4) 중 어느 하나를 1ml의 J591 2-5 ㎎ / ㎖의 용액을 제조 하였다. </li><li> 5 내지 10㎜ (3.8-7.6 ㎎ / ㎖)의 농도로 DMSO에 건조 DFO-NCS 녹인다. 초음파 처리 또는 소용돌이 완전히 용해를 용이하게하기 위해 충분히 용액. </li><li> 작은 분량 씩 0.1 M 나 2의 (&lt;10 μL) CO 3를 추가하여 8.8-9.0로 J591 용액의 pH를 조정합니다. </li><li> 항체 용액은 pH에서 올바른되면 관능 킬레이트 3-4 배 몰 과량 대응 DFO-NCS 용액의 볼륨. <ol><li> 시험을위한PLE, 2 ㎎ / ㎖ J591 항체 액 1 ㎖ (13.3 nmol의 J591)에 10 mM의 (7.6 ㎎ / ㎖) DFO-NCS 용액 (40.4 nmol의 DFO-NCS)의 4 ~ 5 μl를 추가합니다. 최종 수성 반응 혼합물에서 DMSO의 양은 2 % V / V를 초과하지 않아야한다. </li></ol></li><li> 350 rpm에서 교반 가열 블록에 37 ° C에서 30 분 동안 반응물을 인큐베이션. </li><li> 37 ° C에서 1 시간 후, 용리액으로서 0.5 M HEPES 완충액 (pH 7.4)을 사용하여 50,000 분자량 컷 - 오프로 미리 충전 일회용 탈염 크기 배제 컬럼을 사용하여 생성 된 면역 접합체를 정제. 이 단계는 완료 J591-DFO 구조의 2 ml의 솔루션을 얻을 것입니다. </li><li> 비스 - UV 분광 광도계에 구축 J591-DFO의 농도를 측정한다. </li><li> 구조물의 높은 농도가 요구되는 경우, 50,000 분자량 컷 - 오프로 원심 필터 유닛을 이용 J591-DFO 용액을 농축시킨다. </li><li> 어둠 속에서 -20 ° C에서 완성 된 J591-DFO의 면역 접합체의 솔루션을 저장합니다. </ol> 89 ZR 2. 방사성 표지 J591-DFO 주의 : 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하거나 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다 방사능 연구자와 다른 작업을 수행하기 전에. 가능한 모든 단계는 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해주의해야한다. 참고 : 적절한 방사 화학 노트 유지의 관심에서, 샘플에서 방사능의 양을 투여 교정기를 사용하여 측정하고 이전에 기록되어야한다 아래의 프로토콜의 단계 2.2-2.13 후. 이 방사 화학적 수율 및 특정 활동의 정확한 결정에 도움이 될 것입니다. <ol><li> 0.5 M HEPES 버퍼, 산도 7.5의 200 μL에 J591-DFO의 0.5 ~ 2.0 mg의 용액을 준비합니다. </li><li> 의 볼륨을 피펫 &lt;2 ml의 플라스틱 스크류 캡 microcentrifuge 관에 1.0-6.0 mCi의 (37-222 MBq의)에 해당하는 (일반적으로 1.0 M 옥살산 공급) SUP&gt; 89 ZR 4+ 원액. 1.0 M 옥살산을 사용하여 총 300 μL이 용액의 양을 조정한다. </li><li> 1.0 M 나 2 CO 3를 사용하여 6.8-7.5로 89 ZR 4+ 용액의 pH를 조정합니다. 원하는 산도를 달성하기 위해베이스의 분량을 작은 (&lt;10 μL)를 추가 이후 89 ZR 4+ 솔루션 CO 3 1.0 M 나 2의 250 μl를 추가하여 시작합니다. </li><li> 2.1 단계에서 제조 된 J591-DFO 용액의 pH 조정 89 ZR 4+ 솔루션의 원하는 금액을 추가합니다. </li><li> 이 6.8-7.5의 목적하는 범위 내에 있도록 방사성 표지 된 반응 혼합물의 pH를 확인한다. </li><li> 350 rpm에서 교반 가열 블록에 실온에서 60 분 동안의 방사선 반응을 품어. </li><li> 인큐베이션 60 분 후, 측정 RAD무선-TLC를 이용하여 반응 수율을 iolabeling. <ol><li> 이를 위해, 실리카를 함침 TLC 스트립 방사성 표지 반응 혼합물을 1 μCi를 스팟. 50 mM의 DTPA (PH 5.5)의 전개 용매를 사용하여 TLC를 실행, 나누어지는 건조 할 수 있도록 허용하고, 무선 TLC 스캐너를 사용하여 TLC 스트립을 분석 할 수 있습니다. 89 ZR을 4+ 원점에 나타납니다 J591-DFO 구조에 결합 (R &lt;ZR 89 무료 4+ 양이온 DTPA에 의해 킬레이트 화되고 용매 앞 (R F를 용출 반면 0.1),&gt; 0.9) F. </li><li> , radiochromatogram 통합 곡선 아래의 총 면적으로 0.0-0.1 f를 R에서 곡선 아래의 영역을 분할하고, 100을 곱해서 반응하여 표지 수율을 계산한다. </li></ol></li><li> 방사성 표지 수율이 충분 (전형적으로&gt; mCi의 2 / MG의 이론적 비활성) 인 경우의 50 mM DTPA, pH가 5.5의 5 μL 반응물을 켄칭. </li><li> 그 결과 면역 접합체의 USI를 정화NG 5 ㎎ / ㎖ 겐티 론산 5 ㎎ / ㎖ 겐티 산 또는 0.25 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)을 0.9 % 멸균 식염수 중의 용리액을 사용하여 50,000 분자량 컷 - 오프와 함께 미리 포장 된 일회용 크기 배제 탈염 칼럼 . 이 단계는 완료 89 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate의 2 ml의 솔루션을 얻을 것입니다. </li><li> 단계 2.7에 기재된 바와 같이 정제 한 후, 무선 - TLC를 이용하여 89-DFO ZR-J591의 방사 화학적 순도를 확인한다. </li><li> 처음에 정제 (89) ZR-DFO-J591 radioimmunoconjugate 절연 된 방사능의 양에 의해 항체 용액에 첨가 활동량을 나누어 전체적인 반응하여 표지 수율을 계산한다. </li><li> 방사성 표지 반응에서 DFO-J591의 초기 질량 (89)에 의해 정제 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate 절연 활동량 나누어 최종 특이 적 활성을 계산한다. </li><li> 높은 농도의 원하는 경우, 번째 주력전자 89 50,000 분자량 컷 - 오프와 원심 필터 유닛을 사용하여 ZR-DFO-J591 솔루션입니다. 주 : 최종 정제 공정에서 사용 겐티 산 인해 방사선 분해에 항체의 열화를 최소화하기 위해 사용되는 무선 - 보호제 46 동안 4 ℃에서 최대 48 시간 동안 89 ZR-DFO-J591의 radioimmunoconjugate의 저장. 가능하며, 사용하지 않는 것이 좋습니다. radioimmunoconjugate이 저장 될 것이라면, 하이포 클로 라이트 - 매개 방사선 분해의 위험을 최소화하기 위해 저장 버퍼로서 5 ㎎ / ㎖ 겐티 산 0.25 M 아세트산 나트륨 (PH 5.5)를 사용한다. (47) </li></ol> 89 ZR-DFO-J591과 생체 PET 영상 3. 주의 : 프로토콜 섹션 2에서와 같이, 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 모든 possib제작 단계는 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해주의해야한다. <ol><li> 수컷 무 흉선 누드 마우스 피하 5 × 106 된 LNCaP 전립선 암세포 이식 및 이들 (3~4주 접종 후) 3 이종 100-150mm로 증가 할 수있다. 44 </li><li> 0.9 % 멸균 식염수, 1.0 mCi의 / ml의 농도로 89 ZR-DFO-J591 radioimmunoconjugate의 희석. </li><li> 89 ZR-DFO-J591 용액 (200 μCi를 7.4 MBq의) 200 ㎕를 주입한다. 이종 이식 베어링 마우스의 측면 꼬리 정맥에 48 </li><li> 촬상 원하는 시점에서 (예를 들어, 12, 24, 48, 72, 96, 또는 120 열연 후 분사), 2 % 이소 플루 란 마취 마우스 : 산소 가스 혼합물. </li><li> 작은 동물 PET 스캐너의 침대에 마우스를 놓고 1 % isoflurane을 사용하여 스캔하는 동안 마취를 유지 : 산소 가스 혼합물을. 스캐너 침대에 동물을 배치하기 전에, 토​​우 - 핀치 방법 및 출원을 이용하여 마취를 검증마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 Y 안연고. 49 </li><li> 350-700 keV의 에너지의 창 6 나노초의 일치 타이밍 윈도우를 사용하여 4000 만 일치 이벤트 최소 정적 스캔을 통해 마우스 PET 데이터를 획득. 50 </li><li> 이미지의 인수를 완료 한 후, 무인 마우스를 벗어나지 않아이 의식을 회복 할 때까지 다른 마우스와 케이지로 변경하지 마십시오. </li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

건설, 방사성 표지, 및 이미징의 ZR-89-DFO labled radioimmunoconjugates이 다소 간단한 절차가 일반적이지만,이 프로세스의 각 단계에서 마음에 몇 가지 주요 고려 사항을 유지하는 것이 중요하다. 예를 들어, 아마도 절차 공액 단계 동안 우려 원인은 공액 반응 동안 항체의 집합이다. 이 문제는 대개 DFO-NCS 스톡 용액의 첨가 후 접합 반응의 불량한 혼합하는 제품이다.이 경우, DFO-NCS의 비균질 분포가...

인해 현저한 감도, 친화력 및 선택성으로, 항체는 긴 암 세포에 방사선 동위 원소의 전달을 위해 유망 벡터를 고려되었다. 그러나, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상에의 응용들은 표지 용 적당한 양전자 방출 동위 원소의 부족에 의해 방해되어왔다. radioimmunoconjugates의 설계에서 가장 중요한 고려 사항 중 1-3 하나의 물리적 붕괴 매칭되는 하프 항체의 생체 내 약물 동태에 방사성 동위 원소의 생활. 보다 구체적으로, 항체는 종종 비교적 긴 멀티 일 생물학적 반감기를 가지므로 비교 물리적 반감기의 방사성 동위 원소로 표지되어야한다. PET 영상 응용 프로그램의 경우, 항체는 전통적으로 (64) 구리 (t 1/2 = 12.7 시간), (86) Y (t 1/2 = 14.7 시간), 또는 (124) I (t 1/2 = 4.18 D). (4) 방사성 동위 원소 표지왔다, 5 단, 각이러한 방사성 동위 원소 임상 영상에 대한 적합성을 방해 상당한 한계를 가지고있다. 86 Y 64 구리로 표지 radioimmunoconjugates 전임상 연구에서 유망한 입증하는 동안, 동위 원소는 인간의 이미지에 대한 효과가 너무 짧은 물리적 반감기를 가지고있다. (124) 나는 반면에,에 대한 거의 이상적인 물리적 반감기 항체 촬상 있지만 고가이고 상대적으로 낮은 해상도 이미지를 임상 적으로 이어질 차선 감쇠 특성을 갖는다. 또한, I-124 표지 radioimmunoconjugates는 생체 내 종양 대 배경 활성 비율을 낮출 수를 탈 할로겐 처리의 대상이 될 수있다. -6,7- 이 드라이브는 64 잘라 내기, (86) Y를 대체 할 수있는 양전자 방출 방사성 동위 원소를 발견하고, radioimmunoconjugates 124 전 89 ZR 표지 항체에 대한 연구의 급등을 자극했다. 8-12에게 T를89 ZR의 출현에 대한 그 이유는 간단하다 : 방사성 진단 PET의 radioimmunoconjugates에 사용하기 위해 가까운 이상적인 화학적 및 물리적 특성을 가지고 13 89 ZR은 89 Y (P, N)을 사용하여 사이클로트론에 89 ZR의 반응을 통해 생성된다. 시판되는 100 % 천연 풍부한 89 Y 타겟. 14,15 방사성은, 23 %의 양전자 수율을 갖는다 78.4 시간의 반감기로 붕괴 및 395.5 keV의 (도 1)의 비교적 낮은 에너지로 양전자를 방출한다. 그것은 89 13,16,17 ZR 또한 높은 에너지를 방출하는 것이 중요하고, 909 keV의 γ 선 99 % 효율. 방출이 방출 광자 511 keV의 에너지 적으로 방해하지 않는 반면, 전송, 처리, 선량에 대해서 고려를 필요 여분 않는다. 이 경고에도 불구하고, 이러한 부패의 특성은 궁극적으로 89 ZR이 더 유리한 시간을 가지고뿐만 아니라 의미구리 86 Y 64 이상 항체 이미징을위한 ALF 생활뿐만 아니라 더 높은 687, 975 케빈의 에너지뿐만 아니라의 100 ~ 150 keV의 내부 에너지와 광자의 번호와 양전자를 방출하는 124 I보다 높은 해상도의 이미지를 생성 할 수 있습니다 511 keV의 양전자 생성 된 광자. (13) 또한, 89 ZR은 방사성 옥소 대응보다 더 효과적으로 또한 종양, 처리 할 안전 생산 저렴하고 residualizes이다. 89의 Zr (18, 19) 하나의 잠재적 인 제한이없는 것입니다 isotopologue 치료, 예를 들면, Y (86) (PET) 90 대 Y (치료). 이것은 그들의 대응 치료 용 선량 정찰병으로 사용할 수있는 화학적으로 동일 대리 조영제의 구성을 배제한다. 그것은 말했다 조사는 89 ZR 표지 항체는 90 Y- 177 루 표지 면역 접합체에 대한 이미징 대리로 잠재력을 가지고 수행하는 것이 좋습니다.(20, 21) 화학적 인 관점에서, 그룹 IV 금속으로서, 89 ZR은 수용액 중의 양이온 +4로서 존재한다. ZR 4+ 이온은 높은, 비교적 큰 (유효 이온 반경 = 0.84 Å) 충전되고, &quot;하드&quot;양이온로 분류 될 수있다. 이와 같이, 여덟 하드 음이온 산소 도너 리간드 담까지 선호를 나타낸다. 쉽게 ZR-89 radioimmunoconjugates 표지에 사용되는 가장 일반적인 킬레이트가 desferrioxamine이다 (DFO), 세 그룹 히드 담지 시데로 포어 유래 비 환식 킬레이트. 리간드 안정적 생물학적 관련성의 pH 레벨에서 RT로 신속하고 깨끗하게 ZR 4+ 양이온을 조정하고, 생성 ZR-DFO 착체는 식염수, 혈청에서 여러 날에 걸쳐 안정적으로 유지하고, 전혈. 22 전산 연구가 강하게 시사 DFO는 금속 중심에 배위 세 neut되는 ZR 4+ hexacoordinate 복합체를 형성하도록RAL과 리간드의 세 음이온 산소 기증자뿐만 아니라 두 개의 외생 물 리간드 (그림 2). (23, 24) 89 ZR-DFO의 접합 발판을 사용 radioimmunoconjugates의 생체 내 행동은 일반적으로 우수한있다. 그러나 어떤 경우에는, 이미징 및 급성 생체 분포 연구는 89 ZR - 표지 된 항체를 주입 한 쥐의 뼈 높은 활동 수준, ZR 4+ 양이온은이어서 생체 내에서 킬레이트로부터 방출되고, 89 osteophilic가 mineralizes 제안 데이터를 밝혀냈다 뼈. 여덟 산소 도너가 문헌에 나타난 25 최근, 신규 ZR 89 4+ 킬레이트 제의 개발에 대한 조사의 수는 특히, 현재, 그럼에도 24,26,27. DFO 리간드는 가장 널리 사용되는 킬 레이터 89 넓은 여백에 의해 radioimmunoconjugates을 ZR은 표지. 다른 다양한바이오 콘쥬 게이션 전략 bioorthogonal 클릭 화학, 항체의 시스테인 구축 티올 반응 DFO의 반응, 에스테르 베어링 DFO는 항체에 라이신 구축 활성화의 반응을 포함하여, 항체 DFO를 연결하는 데 사용되어왔다. 4,28- 30 쉽게 가장 일반적인 방법은, 그러나, 22 견고이 시판 관능 킬레이트. DFO, DFO-NCS의 이소 티오 시아 네이트 - 함유 유도체의 사용을 (도 2)이었다 안정적의 리신으로 안정한 공유 결합 티오 우레아 결합을 형성했다 항체 (그림 3). 지난 몇 년 동안, 89 ZR-DFO - 표지 radioimmunoconjugates 다양한는 문헌에보고되어있다. 전임상 연구는 CD105-대상으로 T로 세툭시 맙, 베바 시주 맙과 트라 스투 주맙 난해한 항체로 더 잘 알려진 이르기까지 항체를 특징으로, 특히 풍부한되었습니다RC105 및 5A10을 FPSA를가 타겟팅. 30-36 최근 89 ZR-DFO 표지 된 항체를 사용하여 초기 단계의 임상 시험 소수 문헌에 등장했다. 89 ZR-DFO-cmAb의 U36, 89 ZR-DFO-ibritumomab의 tiuxetan, 89 ZR-DFO - 트라 스투 주맙. 21,32,37 또한, 89와 다른 임상 시험의 범위를 사용 특히, 네덜란드 그룹이 발행 한 시험 ZR 표지 radioimmunoconjugates 전립선 암 이미징 PSMA 타겟팅 89 ZR-DFO-J591과 유방암 이미징 HER2-대상으로 89 ZR-DFO - 트라 스투 주맙을 사용하여 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 여기에 조사를 포함하여, 현재 진행되고있다. 23, 방사성 표지 된 항체는 가장 일반적인 ZR (89) 표지 된 방사성 의약품을 유지하면서 또 30, 방사성도 점점 펩티드, 단백질, 및 나노 물질을 포함하는 다른 벡터들과 함께 사용되어왔다. 38-43 </sup&gt; 이 89 ZR-DFO 라벨링 방법의 모듈화는 엄청난 자산입니다. 바이오 마커 타겟팅 항체의 레퍼토리는 끊임없이 확장하고, 이러한 구조를 사용하여 생체 PET 영상에서 공연에 대한 관심은 빨리 성장하고있다. 결과적으로, 우리는 더 표준화 된 방법 및 프로토콜이 개발 분야 이익을 얻을 수 있다고 믿고있다. DFO-NCS의 활용 89 지르코늄의 방사선 물질에 대한 우수한 기록 실험 프로토콜이 이미 Vosjan에 의해 출판 된, 등. (22) 우리는이 작품에서 제공하는 시각적 데모 더 이러한 기술에 새로운 연구자에게 도움이 될 수 있다고 생각합니다. 손 프로토콜, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체에 DFO - 이소 티오 시아 네이트 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션, 89 (2) radiosynthesis 정제 ZR-DFO-단클론 항체 radioimmunoconjugate,및 (3)에서 암의 뮤린 모델에서 ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate 생체 내 PET 영상화. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

항체의 탁월한 친화력, 특이도, 선택은 그들에게 종양을 대상으로 PET 방사성 의약품에 대한 매우 매력적인 벡터를 확인합니다. 으로 인해 여러 날 생물학적 반감기, 항체는 비교적 긴 물리적 붕괴 반감기 양전자 방출 방사성 핵종으로 표시해야합니다. 전통적으로, 양전자 방출 동위 원소 (124)는 I (t 1/2 = 4.18 D), (86) Y (t 1/2 = 14.7 시간), 64 구리 (t 1/2 = 12.7 시간)은 대한 항체를 라벨 사용되어왔다 PET 영상. 그러나 최근 필드는 항체 기반 PET 이미징 에이전트에 양전자 방출 방사성 89 ZR의 사용이 크게 증가를 목격 하였다. 그것이 물리적 반을 가지고 89 ZR은 면역 접합체와 PET 이미징에 대한 거의 이상적인 방사성 동위 원소 인 항체의 생체 내 약물 동태와 호환되며 상대적으로 낮은 에너지를 방출 - 생활 (t 1/2 = 78.4 시간)고해상도 이미지를 생성 RGY의 양전자. 또한, 항체는 노골적 시데로 포어 파생 킬레이트 desferrioxamine (DFO)를 사용하여 89 ZR으로 표시 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 전립선 특이 막 항원 표적 항체 J591은 예시 모델 시스템으로 사용한다 (1) 항체, (2) radiosynthesis 및 89 Zr-의 정제 - 이소 티오 시아 네이트 DFO 관능 킬레이트 바이오 콘쥬 게이션 암의 뮤린 모델 ZR-89-DFO 단클론 radioimmunoconjugate와-DFO 단클론 radioimmunoconjugate, 및 (3) 생체 내 PET 영상화.

이 프로토콜 항체 DFO-NCS의 공액의 첫 번째 단계는 일반적으로 매우 견고하고 신뢰할 수있다. 일반적으로, 정제, 킬레이트 변성 면역 접합체는&gt; 90 %의 수율로 얻을 수 있고, 초기의 접합 반응에서 DFO-NCS의 3 몰 당량을 사용하여 차수의 표지 약 1.0-1.5의 킬레이트 DFO의 수율 것이다 / 단클론 항체. 프로 시저의 89 ZR의 방사선 및 정제 단계는 마찬가지로 간단합니다. 위의 프로토콜에 설명 된 ?...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis<sup&gt; 89</sup&gt; ZR-DFO 표지 항체

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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17.1K 조회수.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

를 사용하여 금 나노 입자의 효율적인 방사성 표지를위한 최적화 된 프로토콜<sup&gt; (125)</sup&gt; I-표시 아 지드 보철 그룹

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

연구

화학

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

준비 및 평가<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

생체공학

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

Pretargeted Radioimmunotherapy 역 전자 수요 Diels 오리 나무 반응에 따라

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

세포 이동의 양전자 방출 단층 촬영 이미징: 세포 방사선 표지 방법

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

암 연구학

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup&gt; (64)</sup&gt; CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em&gt; 생체</em&gt; PET / CT에 의한 세포 트래 피킹

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

면역학 및 감염병학

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

고정화된항원에 대한 방사성 표지된 항체의 결합 친화도 (KD) 결정

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

의학

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

사전 표적 방사선 면역 요법: 종양에 치료용 방사성 핵종을 표적 전달하는 방법

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
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바이오 콘쥬 게이션과의 Radiosynthesis

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를 사용하여 금 나노 입자의 효율적인 방사성 표지를위한 최적화 된 프로토콜

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