뉴런을 구획화하는 데 사용되는 미세 유체 장치는 신경 과학의 표준 도구가되어 연구자가 소마타, 축축기, 원점 및 시냅스를 포함한 뉴런의 세포 극전 지역을 신체적, 화학적으로 조작할 수 있게 합니다. 이러한 구획화된 배양 장치는 개발 중에 축축이 시냅스를 형성하는 방법, 축축기 손상 에 따라 시냅스가 리모델링 및 개혁하는 방법, 병리학적 조건이 알츠하이머병과 같은 질병에 트랜스 synaptically 전파할 수 있는 방법과 같은 신경 과학 분야의 수많은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 배양 원랫 뉴런을 구획화하기 위해 미리 조립된 플라스틱 멀티컴파트칩의 사용을 설명합니다.
이러한 칩을 사용 하 여의 주요 장점은 그들은 사용 하기 쉬운 및 매우 재현 가능한 방법을 제공 하는 뉴런을 구획. 또 다른 장점은 이러한 칩이 이전 실리콘 기반 구획화 장치보다 뉴런과 격리 된 축축의 건강하고 장기적인 성장을 생성하고 고해상도 현미경 검사법과 동등하게 호환된다는 것입니다. 인간 줄기 세포를 포함한 다른 모델 시스템은 또한 미리 조립된 구획화 칩 내에서 배양될 수 있다.
먼저 멸균 된 멀티 컴파트먼트 칩을 페트리 접시에 넣습니다. 칩의 왼쪽 상단에 있는 웰에 프리코딩 솔루션 100마이크로리터를 추가하고 메인 채널을 통해 인접한 우물로 흐를 수 있도록 합니다. 다음으로, 프리코딩 용액의 100 마이크로리터로 칩의 왼쪽 하부 우물을 채웁니다.
이번에는 5분간 기다려 솔루션이 마이크로 홈을 통과할 수 있도록 합니다. 이제 프리코딩 솔루션의 마이크로리터 100을 오른쪽 상단에 추가하고 메인 채널을 통해 인접한 우물로 흐를 수 있습니다. 90초 후, 프리코딩 용액의 100 마이크로리터로 오른쪽 아래를 잘 채우고 칩을 10분 동안 배양합니다.
조심스럽게 메인 채널에서 파이펫 팁을 각도와 각 우물에서 솔루션을 흡인. 그런 다음 즉시 150 마이크로리터의 PBS를 왼쪽 상단에 넣고 1분 반 정도 기다립니다. 다음으로, 150마이크로리터의 PBS를 하부 왼쪽 우물에 추가하고 5분간 기다려야 액체가 마이크로 홈을 통과할 수 있도록 합니다.
그런 다음 150 마이크로리터의 PBS를 오른쪽 상단 및 오른쪽 오른쪽 우물에 추가합니다. 10 분 후, 다시 PBS를 흡인하고 두 번째 세척 단계를 반복합니다. 두 번째 세척에 이어 채널 개구부에서 피펫 팁을 앵글링하여 이전과 마찬가지로 우물에서 PBS를 흡인하십시오.
그런 다음 밀 폴리-D-Lysine 용액당 0.5 믹스의 100 마이크로리터를 칩의 왼쪽 상단에 추가합니다. 1분 반 정도 기다린 다음 폴리 D-Lysine 용액의 100 마이크로리터로 왼쪽 아래를 잘 채웁니다. 칩의 오른쪽 절반에이 프로세스를 반복합니다.
페트리 접시를 닫습니다. 그런 다음 칩을 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 배치합니다. 인큐베이션 후 이전에 설명한 대로 PBS로 칩을 두 번 헹구는 다.
다음으로 장치에서 PBS를 흡인합니다. 즉시, 칩의 왼쪽 상단에 있는 우물에 세포 배양 매체의 100 마이크로리터를 추가합니다. 1분 반 후, 왼쪽 아래쪽에 미디어를 추가합니다.
5분 정도 기다려서 미디어가 마이크로 홈을 통과한 다음 칩 의 오른쪽에 있는 충진 과정을 반복할 수 있습니다. 확립된 프로토콜에 따라 해리된 쥐 해마 뉴런의 세포 현탁액을 준비한다. 칩의 각 웰에 미디어의 대부분을 제거하지만 가득 채널을 떠나.
다음으로, 즉시 셀 서스펜션의 5마이크로리터를 오른쪽 상부에 적재하고, 오른쪽 하단에 셀 서스펜션의 또 다른 5마이크로리터를 잘 적재한다. 셀을 로드할 때 파이펫 끝을 주 채널쪽으로 가리킵니다. 세포를 로드한 후 칩을 현미경 단계로 옮기고 뉴런이 주 채널에 있는지 확인합니다.
세포가 부착할 때까지 5분을 기다린 후, 뉴런 배양 배지의 약 150마이크로리터를 각각 우측 웰각각에 추가합니다. 그런 다음 각 상부 및 하부 왼쪽 우물에 150 마이크로리터의 미디어를 추가합니다. 페트리 접시를 덮고 칩을 가습 트레이에 5%의 이산화탄소, 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓습니다.
먼저 축산 구획의 왼쪽 아래 우물에서 20마이크로리터를 제거하고 체형 구획의 오른쪽 위쪽에 놓습니다. 각 채널 내에서 흐름을 2분 정도 기다립니다. 다음으로 축산 구획에서 50 마이크로리터의 미디어를 제거하고 이 매체에 밀리머 알렉사 플루오 488 히드라지드 1개 미끄러울 수 있는 마이크로리터를 추가합니다.
파이펫을 위아래로 사용하여 용액을 혼합한 다음 형광염염을 함유한 미디어를 축소 구획으로 되돌려 보냅니다. 이 시점에서 칩을 원하는 대로 현미경 및 이미지에 배치합니다. 칩 내에서 축 축 절제술을 수행하려면 먼저 축산 구획에서 미디어를 제거하여 파이펫 팁을 메인 채널입구에서 멀리 유지합니다.
제거된 미디어를 원심분리기 튜브에 보관하십시오. 다음으로, 축축구의 메인 채널 입구에 포부를 놓고 축축구를 완전히 흡인시킵니다. 1~2분 동안 이 지역을 계속 흡인합니다.
축 축 구획을 저장된 용지로 교체합니다. 현미경의 밑에 견본을 보고 액액이 구획에서 완전히 제거되고 축축이 절단되는지 확인하십시오. 그런 다음 칩을 덮고 인큐베이터에 반환합니다.
형광 면역 염색을 시작하려면 칩에서 대부분의 미디어를 제거하여 내부 구획을 수분을 공급하십시오. 즉시 축축및 체형 구획의 상단 우물에 고정 솔루션 100 마이크로리터를 추가합니다. 1분 후, 100마이크로리터의 고정 용액을 바닥 유정에 추가하고 실온에서 30분 동안 셀을 수정합니다.
우물에서 대부분의 용액을 제거하고 즉시 축산 및 체세포 구획의 각 상단 우물에 150 마이크로리터의 PBS를 추가합니다. PBS가 아래 우물로 흐르기까지 2분 정도 기다린 다음 PBS를 제거하고 이 같은 프로세스를 사용하여 우물을 두 번 더 헹구는 다. 마지막 헹구는 다음 칩의 우물에서 PBS의 대부분을 제거하고 즉시 축산 및 체형 구획의 각 상단 우물에 0.25 % 트리톤 x-100PBS의 150 마이크로 리터를 추가합니다.
15 분 동안 기다린 다음 우물에서 액체의 대부분을 제거하십시오. 즉시 축축및 체형 구획의 각 상단 우물에 150마이크로리터의 블로킹 솔루션을 추가합니다. 15 분 후, 우물에서 액체의 대부분을 제거하고 즉시, 축상 및 체세포 구획의 각 상단 우물에, 1 차 항체 용액의 100 마이크로 리터를 추가합니다.
칩을 덮어 증발을 최소화하고 실온에서 1시간 동안 1차 항체의 세포를 배양한다. 다음으로, 대부분의 용액을 제거하고 즉시 축축및 색소구의 각 상단 우물에 150 마이크로리터의 PBS를 추가하여 칩을 헹구십시오. 5분 후, 우물에서 PBS를 제거하고 헹구는 것을 두 번 더 반복합니다.
이제 우물에서 대부분의 액체를 제거하고 즉시 PBS에 100 마이크로 리터의 이차 항체를 축소 및 체세포 구획의 각 상단 우물에 추가하십시오. 칩을 덮어 증발을 최소화하고 실온에서 1시간 동안 칩을 배양합니다. 앞에서 설명한 바와 같이, 다음 PBS와 칩을 세 번 헹구고, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 칩을 마운트및 이미지화한다.
여기에 표시된 플라스틱 칩 및 PDMS 장치에서 자란 뉴런을 나란히 비교하는 것입니다. 신경 성장은 문화에서 최대 15 일까지 두 플랫폼 내에서 비교, 하지만 긴 문화 시대에, 플라스틱 칩 내에서 고립 된 축축, 덜 구타와 건강 한 나타납니다. 축 선 구획 내에서 축 하 를 더 시각화 하기 위해, 이러한 샘플또한 베타 tubulin III에 대 한 면역 스테인드 되었다, 이는 22 문화에서 플라스틱 칩 내에서 건강 한 축 하 성장을 보여줍니다.
24일 샘플로 염색하면 플라스틱 칩에서 재배된 뉴런이 흥분성 및 억제 시냅스 마커, vGlut1 및 vGat를 모두 표현합니다. 다음은 레트로 그레이드 라벨 mCherry 뉴런과 결합 된 두 시냅스 마커입니다. 축 사 부상 및 재생 연구에 대 한이 칩의 적합성을 입증 하기 위해, 역행 표시 된 뉴런 전에 그리고 24 축 하 후 시간 이미지 했다.
후퇴 전구와 축하를 재생하는 것은 모두 축축약 다음에서 분명합니다. 이러한 결과는 PDMS 기반 장치를 사용하여 게시된 데이터와 동일합니다. 클래식 멀티컴트칩은 3주 이상 지속가능한 장기 뉴런 배양을 제공하는 구획화 뉴런을 위한 사용하기 쉬운 옵션을 제공합니다.
이 절차를 시도하는 동안, 뉴런의 적절한 수를 씨앗과 당신의 인큐베이터가 문화 동안 잘 가습되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
