We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. 세포 배양 (24 ~ 48 시간 형질 전환 이전) <ol><li> 종래 형질 전환 종자에 24-48 시간은 96 웰 플레이트의 수에 기초 HEK293T 세포, 충분한 양의 형질 감염된다. 참고 : 일관성있는 형질의 경우, 충분한 밀도 판 세포는 빠르게 분열을 선호하는, 아직 형질의 번에 두 개 이상의 70-90%의 포화 상태에있을 수 없습니다. </li><li> 각 96 웰 플레이트 (저장 및 멀티 채널 피펫의 사용을 설명하기 위해 잘 당 75,000 세포 및 플레이트 당 120 우물) 9 × 10 6 세포를 필요로한다. HEK293 세포 (일반적으로 ~ 20 시간)의 배가 시간을 계산하고, 세포의 적절한 수는 트랜시 적어도 9 × 106 세포를 수득 시드. 새로운 플레이트를 다시 시드 나머지 세포 ~ 10 %, ~ 90 % 컨 플루 언시로 성장 145mm 원형 배양 플레이트는 통상적으로 3 96- 웰 형질에 충분하다. </li></ol> 형질 2. 준비 이전 _content &quot;&gt; 참고 :이 시약의 준비 시간이 소요될 수 있기 때문에 단계 2.0-2.2의 버퍼와 플라스미드 DNA의 준비는 이전에 형질 전환에 일을 수행해야한다. <ol><li> 3&#39;LIFE 분석과 호환되는 인간의 3&#39;UTR 클론 공개 플라스미드 저장소 (30)를 통해 사용할 수 있습니다. 수동 또는 액체 핸들링 로봇 DNA 플라스미드를 정제. 형질 등급 알칼리 용해 미니 준비 96 웰 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 잘에 ~ 100 NG / μL 당 정제 된 벡터를 재현 탁. 참고 : 플라스미드 농도가 아래 40 NG / μL를 떨어지면 부족 루시 페라 제 신호가 발생합니다. </li><li> pLIFE-miRNA의 그림 1B (24)의 파이프 라인을 사용하여 30 또는 복제를 벡터 얻습니다. 각각의 miRNA와 빈 제어 플라스미드 500 NG / μL의 농도로 재현 탁 벡터. </li><li> nucleofection 버퍼 조건의 민감성으로 인해, 다음을 확인(세포 플라스미드를 포함) 형질 물질의 총 부피는 96 웰 형질 플레이트의 각 웰에 전체 액체의 10 %를 초과하지 않는다. 이를 달성하기 위해, 적어도 500 NG / μL의 농도로 pLIFE-miRNA의 플라스미드 스톡을 농축시킨다. </li><li> 배 반딧불이 루시퍼 라제 시약 완충액 (표 1), 및 최대 6 개월 동안 저장 될 수 1X 레 닐라 루시퍼 라제 시약 완충액 (표 2)를 준비한다. 참고 : 반딧불 루시 페라 제 버퍼에 DTT는 단일 사용 씩 -20 ℃로 솔루션에 저장 될해야합니다. </li></ol> 3. 형질 직전에 다음 항목을 준비합니다 <ol><li> PBS를 포함하는 형질 전환 버퍼, 1.5 % HEPES, pH가 7.0을 준비합니다. 이 형질 전환 효율이 눈에 띄게 감소없이 4 ° C에서 최대 1 달 동안 저장 될 수 있지만,이 신선한 준비합니다. 버퍼와 플라스미드 DNA 볼륨을 공식화에서, SU 각 96 웰 플레이트 (120) 반응을 가정fficiently 피펫 및 액체 저수지 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 손실 된 볼륨의 오류를 차지한다. 나누어지는 잘 형질 버퍼 당 18 μL (/ 96 웰 플레이트 (120) 우물 = 플레이트 당 2.16 ㎖), 따로 설정합니다. 주 : 세포 - 전기 장치가 세포를 형질하는 데 사용되는 버퍼 조건에 매우 민감하다. 준비 버퍼가 장비의 일관된 성능을 보장 정확도. 구체적으로는 그 버퍼가 마이크로 원심 튜브, 96 웰 플레이트, 저수지와 전극 판에 폭로 방치 시간을 최소화함으로써, 버퍼의 증발을 방지하기 위해 분석을 수행 할 때 여분의주의를 기울여야한다. </li><li> 예약 다음과 같은 컨트롤을위한 네 개의 우물, 아니 pLIFE-3&#39;UTR (루시 페라 제 분석의 배경을 측정하기), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (음의 목표 제어), miRNA의 # 1에 대한 긍정적 인 제어, miRNA의 번호에 대한 양성 대조군 2. 참고 :이 벡터는 30 공개적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이전에 검증 대상양성 대조군으로 사용할 수있다. </li><li> 따뜻한 미디어, 37 ° C의 트립신 (0.25 %). </li><li> DMEM은 10 % FBS, 1 % 펜 / 스트렙토 보충 된 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 200 μL를 추가 한 다음 형질 사용할 37 ° C의 배양기에 두었다. </li><li> 지원 소프트웨어 다음 모든 세포의 전기 장치의 전원을 켭니다. HEK293T 세포와 PBS / HEPES 완충 용 펄스 코드 FF120를 사용합니다. </li></ol> 플라스미드 DNA와 세포 혼합물 4. ​​준비 참고 : 다음 프로토콜은 두 가지의 miRNAs (miRNA- # 1 miRNA- # 2)가 화면에 대해 하나의 실험에서 세 96 웰 플레이트를 형질 가정합니다. 각 플레이트는 pLIFE-3&#39;UTR 플라스미드 동일한 96- 웰 플레이트에 대응되며, pLIFE-miRNA의 공백 pLIFE-miRNA- # 1 또는 pLIFE-miRNA- # 2로 3 회 처리한다. <ol><li> 각각의 miRNA에 대한 pLIFE-miRNA의 + 형질 버퍼의 3 주식을 준비합니다. 이 주식은 각각의 전체 부피의 50 % (10 μL)를 차지한다물론, 120 우물을 곱한. 따라서, 각각의 주가는 1.08 ml의 버퍼 + 120 μL 플라스미드 DNA (pLIFE-miRNA의)를 포함해야합니다. </li><li> 미디어를 용출 PBS로 부드럽게 세척하고, 37 ℃에서 5 분 ~ 5 ml의 0.25 % 트립신으로 처리하여 145mm 배양 접시에서 세포를 제거합니다. 5 분 동안 300 XG에 동일한 미디어 부피, 펠렛 세포를 트립신 중화. </li><li> 5 ~ 10 ml의 미디어 (셀 밀도와 세포 카운터의 정확한 범위에 따라) ~에 트립신 / 미디어, 그리고에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 95 % 가능한 기계의 정확한 범위 내에서&gt; 세포가 있는지 확인합니다. 참고 : 부정확 한 세포 수는 매우 높은 세포 농도 (&gt; 6.0 배 (10) 6 / ㎖)에서 발생할 수 있습니다. 세포의 비율 및 / 또는 형질 전환 효율을 감소 : 형질 너무 많은 세포 플라스미드를 대폭 줄임으로써 타겟팅 된 miRNA의 효율을 감소시킬 수있다. </li><li> 세 나누어 각 튜브 함유 9 × 106 세포, 세포 r에 대응한 96 웰 플레이트의 형질 전환을위한 equired. 3 분 동안 300 XG에 세포를 스핀. </li><li> 용지를 제거합니다. 초과 용지는 형질 전환 효율에 영향을 미칠 수있는 펠릿의 최소한의 방해와 가능한 한 많은 매체를 제거해야합니다. </li><li> 1.2 ml의 형질 전환 버퍼 / miRNA의 플라스미드 혼합물, 따로 설정에 재현 탁 세포. </li><li> 다음은 형질 버퍼에 pLIFE-3&#39;UTR 플라스미드의 세부 부유 단계를 반복합니다. 이 96 웰 플레이트에서 발생하는 것처럼, 항상 판을 덮어 버퍼의 증발을 방지하기 위해주의를 기울입니다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 형질 버퍼 μL 32.4 이동 ([형질 전환 당] 9 μl를 * 3 판] * 1.2 [피펫 오류를 설명합니다). </li><li> 각 웰에 3.6 μL 미니 수험 공부를 pLIFE-3&#39;UTR 플라스미드 (~ 100 NG / μL)를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 피펫 96- 웰 플레이트와 형질 커버의 각 웰에이 혼합물을 10 μL. </li></ol></li></ol><ol><li> 저수지에 첫 번째 셀 / 버퍼 / pLIFE-miRNA의 플라스미드 혼합물의 1.2 mL로 이동합니다. 잘 섞는다. </li><li> 이미 10 μL 형질 버퍼 / pLIFE-3&#39;UTR을 포함하는 제 96 웰 접시에 트랜 스펙 션 혼합물의 10 μL를 추가한다. 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다. 참고 : 버퍼에있는 세포의 평등 서스펜션도 확인하고 큐벳을 통해 전류의 철저한 통로 형질 전환 효율을 극대화합니다. </li><li> 셀 전기 천공 장치에서 96- 웰 플레이트 형질 놓고 형질을 개시. </li><li> 형질 전환이 완료되면, 96 웰 형질 플레이트의 각 웰에 96 웰 배양 플레이트에서 예열 매체의 100 μl를 넣고 잘 섞는다. 96 웰 배양 플레이트에 각 우물에서 100 μl를 이동합니다. </li><li> 세포는 w의 양측에 응집하는 경향이있는 바와 같이, 웰의 중앙에 수직으로 위치 된 피펫 배양 접시에 세포를 섞는다엘 적절하게 혼합되지 않는. </li><li> 나머지 두 판에 대한 5.1-5.5를 반복합니다. </li><li> 청소 96- 웰 플레이트 형질 <ol><li> 96- 웰 플레이트를 형질 전환 실험 간의 핵산 위에 캐리 없도록 70 % EtOH로 세척하여 재활용 할 수있다. 완전히 전극 부재에 과량의 EtOH를 닦고 (하부 측)와 배양 후드에서 완전히 건조시킨 형질 전환 플레이트를 허용함으로써 각 웰을 채우기 위해 분 무병을 사용하여 두 개의 70 % EtOH로 세척을 수행한다. 참고 : 우리가 더 플라스미드 DNA와 70 % EtOH로 하나의 세척, 및 제 형질 다음, HEK293T 세포로 각각의 플라스미드 pmaxGFP 2 μg의와 12 우물을 형질로 이월 DNA 오염에 대한 테스트했습니다. 이 극히 높은 플라스미드 농도, 매우 밝은 리포터 및 단일 워시, 복제 형질 12 중 어느 하나의 관측 형광이 없었다. </li></ol></li><li> 이중 lucif 다음 37 ℃에서 48 ~ 72 시간 동안 배양 세포,분석을 지 웁니다. </li></ol> 6. 세포 루시 페라 제 분석을위한 해물 준비 <ol><li> 4 부 물, 저수지 패시브 용해 완충액 1 배 부분 용해 완충액을 희석. 26 μL가 / 잘 ~ 20 여분의 볼륨을 추가하는 저수지의 손실을 고려하여 계산한다. 주 : -20 ºC 버퍼에 저장되며, 피펫의 정확도를 향상시킬 실온 접근하는 배 버퍼를 허용하는 종래 따라서, 매우 점성 일 수있다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 트랜 스펙 션 효율을 각 웰을 분석한다. 효율적으로 형질하지 않은 우물에 불일치 (&gt; 90 %의 형질 전환 효율을) 참고 또는 혼잡 또는 미디어 고갈을 나타내는 RFP의 낮은 수준을 표현하고 있습니다. 분석에서이 우물을 제거합니다. </li><li> 완전 세포 분리의 원인이되는 너무 빨리 용출 않도록 조심하면서 세포에서 용지를 제거합니다. 참고 : 남은 용지가 experime에서 값에 해물과 원인 변동을 희석한다국세청. </li><li> 20 ~ 30 분 ~에 대한 낮은 / 중간 속도로 판 쉐이커 / 로커에 각 웰, 장소에 용해 버퍼의 26 μl를 추가합니다. , 루시 페라 제 버퍼를 준비 루미 (들)을 씻어 총리, 불투명 측정 판에 해물을 전송하려면이 시간을 사용합니다. </li></ol> 7. 듀얼 루시 페라 제 분석 참고 : 여러 개의 판이 한 루미에 순차적으로 측정되는 경우, 즉시 각 판을 사용하기 전에 pH를 조절 한 다음이 시약을 추가, ATP와 기판을 제외한 모든 것을 버퍼 마스터 믹스를 만들 수 있습니다. ATP 및 기질은 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다; 이들 시약은 상기 버퍼에있는 시간의 양에 일관성이 여러 플레이트의 일관성을 개선한다. <ol><li> 루시퍼 1X 버퍼 준비 (표 1) : <ol><li> 기판 민감한 빛을 수있는 바와 같이, 알루미늄 호일로 개똥 벌레와 레 닐라 버퍼를 포함하는 두 개의 튜브 (일반적으로 50분의 15 ml의 원심 분리기 튜브)를 감싸. </li><li>1X 반딧불 루시 페라 제 버퍼를 준비합니다. 최종 1 배 농도로 5 ML의 H 2 0, EGTA 마지막으로 추가, 각각의 다섯 배 반딧불 루시 페라 제 시약의 1 ML을 추가합니다. <ol><li> 반딧불 버퍼 1X 10 ml의 0.025 g의 ATP를 추가합니다. 수회 반전 섞는다. 항상 얼음에 ATP를 유지합니다. ATP이 저하되므로, 하나 이상의 플레이트를 순차적으로 측정하는 경우, 버퍼는 각 추가 플레이트에 대해이 단계에서 새로운 시작을해야합니다. </li><li> 버퍼의 pH를 기반으로 노란 색으로 변경해야합니다 (100) 딱정벌레 루시페린 (기판) (표 1)의 100 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 1X 레 닐라 루시퍼 버퍼 재구성 : 96 웰 플레이트, 나누어지는 1 10 ㎖ 당 &quot;레 닐라는 버퍼&quot;. <ol><li> BSA 100 ㎕ (44 ㎎ / ㎖ 주식을)를 추가합니다. </li><li> 하나 이상의 판, 10 mL의 분액에 별도의 마스터 믹스를 선별합니다. </li><li> 버퍼링 코 엘렌 테라의 100 μl를 추가합니다 (이전에 분주하고 100 배의 진한에 저장됩니다.) </li></ol></li> &lt;리&gt; 수산화 나트륨과 염산을 사용하여 5.0 1X 레 닐라 버퍼 다음, 반딧불 8.0 버퍼 1X의 산도를 조정합니다. 주 : 각 버퍼의 활동 및 반딧불 루시퍼 라제 활성을 종결 레 닐라 버퍼의 능력은 산도에 크게 의존한다. 일관성있는 결과에 대해이 단계에서 매우 정확. </li><li> 루미 프라이밍를 수용 10.5 mL를 (1 96- 웰 플레이트에 대응) 각각의 버퍼의 양을 준비한다. </li></ol></li><li> 불투명 한 흰색 번호판에 해물을 전송 :이 시점에서 세포가 20 분 ~에 대한 용해 버퍼에 있​​어야합니다. 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 25 μl를 타고, 세포의 덩어리를 분쇄하고 해물을 균질화 아래 철저까지 피펫해야 할. </li><li> 루미를 준비합니다. 루미의 전원을 켜고 &quot;이 주사와 DLR&quot;라는 DLR 폴더에있는 프로토콜을 선택합니다. 다른 포맷은 데이터 분석 파이프 라인 (아래)와 호환되지 않습니다. <ol><li> T로 우물을 선택ested (모든 우물이 기본값입니다). </li><li> (설명을 29 참조) 10 초 측정 시간 5 초 설정을 &#39;측정하기 전에 지연&#39;을 확장합니다. </li><li> 모세관 세척 단계 : 물 3 배, EtOH로 배, 물 배, 마른 배. 백 버퍼 튜브에 한 번 폐기물로 국무 버퍼, 다음 주요 두 번째 혼합 보장합니다. 오른쪽 모세관에 레 닐라 다음 왼쪽 모세관에 처음과 주요 반딧불 버퍼를 주입한다. </li></ol></li><li> 루시퍼 라제 분석을 시작합니다. 각각의 판을 읽을 ~ 48 분 소요됩니다. 완료 후 먼저 파일을 저장 한 다음 세척 단계를 반복하고 루미을 차단. 참고 : 루미 프로그램이 충돌 할 경우 여러 판 읽고 동일한에 저장된 데이터는 파일을 능가 할 수는 문제가 여러 개의 판으로 발생할 수 있습니다 그러나 읽습니다. 측정 사이의 모든 데이터를 저장하고 저장이 가능하기 전에 프로그램이 충돌하는 경우 스크린 샷을해야합니다. <ol><li> 이전 버퍼를 교체새와 새 판을 시작하기 전에 최소한 두 번 새로운 버퍼와 주요해야되고. </li></ol></li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 에서 사용할 수 - 그리고 &quot;다판 분석 3&#39;LIFE&quot;- 엑셀 테이블 &quot;하나의 플레이트 분석 3&#39;LIFE&quot;활용 <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com을</a> . 스프레드 시트 - &quot;하나의 플레이트 분석 3&#39;LIFE&quot;에 부정적인 조건, miRNA의 # 1, 및 miRNA의 # 2에 해당하는 위치에 루미 출력 파일에서 반딧불과 레 닐라 루시퍼 라제 측정을위한 원시 데이터를 복사합니다. </li><li> 스프레드 시트가 자동으로 반딧불 / 레 닐라 비율을 계산하고 적절한 음성 대조군에 각각의 miRNA의 정상화, 각각의 접시에 걸쳐 억압 값을 정상화됩니다. 참고 :이 스프레드 시트가 자동으로 크게 억압 우물을​​ 강조, 낮은 루시 페라 제 신호에 우물을 식별하고 repressi의 조치를 제공 할 것입니다전체 판에서에. 통계 분석의 자세한 설명은 (24)을 참조하십시오. <ol><li> 각 시험의 miRNA에 대한 # 1을 복제에 대응하는 위치에 - &quot;다판 분석 3&#39;LIFE&quot;스프레드 시트에 해당하는 세포로, &quot;정상화 RI 색인&quot;상자에서 값을 복사합니다. 다른 일에 수행 한 모든 생물 복제에 대해 반복합니다. </li></ol></li><li> 원하는 경우, 각각 열 B와 D의 유전자 이름과 대상 예측 상태를 삽입합니다. <ol><li> 스프레드 시트가 자동으로 모든 판의 평균을 계산하도록 허용합니다. 열지도로 96 웰 형식 (그림 2)의 데이터를 관찰한다. 파일은 또한리스트 형식의 데이터 (도 2)를 배치한다. 주 : 억압 지수 추정 miRNA의 타겟을 식별하는 데 사용되는 계수이다. 다른 파라미터는 엄격 개인 선호도에 기초하여, 사용할 수있다. 평균적으로 우리는 0의 억압 지수 아래의 가능성이 안타를 고려한다.8 T 테스트 (P - 값 &lt;0.05)로 통계적으로 유의. 그림에 나타낸 바와 같이 이러한 기준에 따라 3 잠재적 인 목표는 빨간색으로 강조 표시됩니다. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+structure+of+the+let-7+miRNA+interacting+with+the+site+LCS1+of+lin-41+mRNA+from+Caenorhabditis+elegans.">NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).</li><li>Shin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+microRNA+targeting+code:+functional+sites+with+centered+pairing.">Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing.</a> Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).</li><li>Azzouzi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-96+directly+inhibits+gamma-globin+expression+in+human+erythropoiesis.">MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis.</a> PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-193b+Regulates+Mcl-1+in+Melanoma.">miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma.</a> Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).</li><li>Chi, S. 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S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+MicroRNAs+in+Conferring+Robustness+to+Biological+Processes.">Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes.</a> Cell. 149 (3), 515-524 (2012).</li><li>Pelaez, N., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+robustness+and+the+role+of+microRNAs:+a+network+perspective.">Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective.</a> Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).</li></ol>

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

3&#39;LIFE 분석은 높은 처리량에 3&#39;UTRs에 기능 miRNA의 목표를 식별합니다. 이 분석은 실험적으로 관심에 대한 자신의 miRNA 추정 대상의 다수를 식별 할 목적으로 연구에 유용하다. 3&#39;LIFE 분석은 분석이 miRNA의 타겟팅의 기능 측정, 자신있게 해결할 수있는 하나의 miRNA에 대한 3&#39;UTR :: 단일 기자의 이진 테스트를 제공한다는 점에서 3&#39;UTR 중심의 규제를 조회 할 수있는 강력한 방법이다 개별 유?...

이 방법의 전체 목표는 정확히 감지하고 높은 처리량에서 마이크로 RNA (miRNA의) 대상을 매핑하는 것이다. 의 miRNAs는 ~ 길이 22 뉴클레오티드 내인성 비 코딩 RNA를합니다. 전사 처리에 따라, 성숙의 miRNAs는 단백질 복합체에 포함되는 복잡한 (RISC)를 침묵 유도 된 RNA를했다. 각각의 miRNA는 번역 억압 또는 mRNA의 절단 1 중 하나의 결과로, 주로 메신저 RNA를의 &#39;비 번역 영역 (3&#39;UTRs) (의 mRNA를)에있는 요소를 대상으로 RISC를 안내합니다. U는 염기쌍을 동요하고있다 퇴화를 자연에서 여러 일치하지 않는 염기 쌍을 포함하는 지역을 불룩 : miRNA의 표준 왓슨 - 크릭 및 G에 기초하여 대상 사이트를 인식하고 있습니다. 대부분의 miRNAs는 크게 그들이 생물학적 역할의 다양한 범위를 재생할 인간 2,3에 식물에서 보존된다. 후생 동물에서의 miRNA는 세포의 운명 결정 4, 발달시기 (5) 등 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수있다 </sup&gt; 자주 조직 특이 적 발현 양상 6,7을 나타낸다. 의 miRNA misexpression 또한 표적 유전자의 기능만을 기준 셀의 동작에 상당한 영향을 미칠 수있는 비정상적인 유전자 조절, 발생할 수있다. 이와 같이, 신경 퇴행의 miRNAs는 8,9, 당뇨병, 암 (10) (11)을 포함하여 다양한 질환에 연결되어있다. 생물 정보학 및 습식 벤치 방법은 각각의 miRNA는 높은 처리량 또는 게놈 넓은 접근 방식이 잠재적 인 상호 작용이 큰 풀을 조사하는 데 필요한 것을 나타내는 별개의 mRNA 12-14 수천 수백을 대상으로 할 수 있음을 시사한다. 표적 유전자를 확인하는 것은 기계적으로 정의 miRNA의 기능의 중요한 요소이며, 그렇게 연구자 대규모 타겟을 계시 할 수 있어야한다. 몇몇 접근법은 생물 정보학적인 예측 알고리즘을 포함하여 miRNA의 타겟을 식별하기 위해 개발 된, 높은 처리량 시퀀싱의 mRNA를 표적으로하고, 기자가 분석을 기반으로. 이러한 접근 방식은 각각 고유의 강점과 약점을 가지고있다. miRNA의 타겟팅이 순서 특이성에 의해 인도되는 것을 감안할 때, 특히 뉴클레오티드의 miRNA의 2-6의 여러 알고리즘은 많은 생물의 게놈을 통해 miRNA의 목표를 예측하기 위해 개발되었다 (시드 지역을 지칭). 이 알고리즘은 검증의 miRNA 대상의 관찰베이스 페어링 모티브를 사용하여 훈련, 자주 등의 엄격한 씨 페어링, 현장 보존 및 / 또는 열역학적 안정성 15 매개 변수를 사용하고 있습니다. 이러한 필터는 단지 높은 신뢰 대상에 충분한 상보성을 가진 추정 대상의 다수를 구체화 반면, 최근 증거는 16-24 만연 시사 종 특이적이고 비정규의 miRNA 표적 부위를 제외 할 수있다. 더욱이,이 예측은 이러한 대안 폴리아 데 닐화와 같은 miRNA의 표적 부위를 제외 mRNA의 계정 처리 메커니즘을 고려하지 않는다25, RNA 편집 (26), RNA 메틸화 (27), 협력 바인딩. 따라서, 높은 위양성과 위음성 율은 많은 알고리즘 22,24,28보고되고있다. 이러한 알고리즘은 후속 실험 검증을 위해 후보 miRNA의 타겟을 식별하는 데 유용하지만, 이러한 높은 에러율 체계적인 miRNA의 타겟 검출을위한 생물 정보학적인 방법의 유효성을 제한한다. 체계적으로 특정 miRNA의 사이의 상호 작용 및 잠재적 대상 3&#39;UTRs에 대해 조사하기 위해 우리는 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24 기능 요소의 발광 식별라는 높은 처리량 분석을 개발했습니다. 상기 분석 수단의 상호 작용과 직접 이중 루시페라아제 리포터 시스템을 이용하여 miRNA의 쿼리 테스트 3&#39;UTR의 병진 억압. 이 시스템에서, 관심의 유전자의 3&#39;UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (fluc) 리포터 판독 프레임의 하류에 클로닝된다. 기자의 단점truct는 HEK293T 세포에서 쿼리의 miRNA에 동시 형질 감염된된다. miRNA의 타겟팅 테스트 fluc :: 3&#39;UTR 기자와 제 비특이적 레 닐라 루시퍼 라제 리포터의 상대적인 변화를 측정함으로써 결정된다. 중요한 것은, 루시 페라 제 분석은 기자의 병진 출력에 영향을 미치는 기능의 miRNA / mRNA의 상호 작용을 검출한다. 이는이 3&#39;UTR 기반 규제의 독립적 인 단백질 풍부 mRNA의 분해와 번역 억압의 차이뿐만 아니라, 변화를 무시, 이러한 RT-qPCR에 서양 말과 같은 miRNA의 규제를 감지하는 기존의 방법에 비해 큰 장점이다. 루시페라아제 분석법 널리 소모성 시약과 관련된 높은 비용에 의해 제한되기 때문에 상대적 단순성과 감도이면서 높은 처리량 스크린에서 그 사용 직접적인 miRNA의 대상을 확인하는 데에 이용되는, 공개 출처 3&#39;UTR 라이브러리의 부족, 부재 표준화 된 루시 페라 제 제자의ocols, 여러 데이터 세트에 걸쳐 기능 억압 비교에 어려움을 선도. 3&#39;LIFE 분석의 사용을 용이하게하기 위해, 우리는 정기적으로 업데이트 팽창 3&#39;UTR 라이브러리를 만들어 실험 설계 비상업적 형질 24 루시퍼 라제 시약 (29)의 이용의 간소화에 중점을 넣고,를 통해 사용할 수있다 공개 플라스미드 저장소 (30). 3&#39;LIFE 분석의 확장 성 bioinformatically 확인 된 유전자으로 화면을 바이어스없이 특정 miRNA의 타겟팅에 대한 큰 3&#39;UTR 라이브러리의 검사를 할 수 있습니다. 정규 예측과 상호 작용을 시험 이외에, 체계적인 접근법 비정규 및 / 또는 종 특이 적 상호 작용을 통해 구동되는 신규 대상의 식별을 허용한다. 중요한 단백질 생산에 타겟팅 된 miRNA의 효과는 일반적으로 적당한 병진 억압 15,31 &lt;발생하는 것으로 이해된다/ SUP&gt;, miRNA의 규제의 주요 역할, 단백질 출력 미세 조정 유전자 발현의 비정상적인 수준을 방지하고, 특정 프로그램 (32, 33)를 셀에 견고 함을 제공하는 것을 제안. 3&#39;LIFE 화면에 음의 miRNA / mRNA의 상호 작용의 본질적으로 다수의 결합 루시페라아제 분석의 민감도의 miRNA 유전자의 다수의 타겟팅의 미묘한 효과를 검출하고, 유전자 네트워크의 여러 구성 요소들의 식별을 허용하는 특정 miRNA의 (24)에 의해 조절된다. 여기에서 우리는 3&#39;LIFE 프로토콜을 설명하고 275 인간 3&#39;UTRs (그림 1)의 패널에 대해이 잘 특성화의 miRNAs 미르-10B 및하자-7C를 선별하여이 가능성의 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

3&#39;UTRs의 기능 요소의 발광 식별 (3&#39;LIFE는) 쿼리 3&#39;UTRs 수백의 배열 내의 특정의 miRNAs의 목표의 신속한 식별 할 수 있습니다. 대상은 식별 된 miRNA 타겟팅의 판독 기능을 제공 병진 출력을 측정함으로써 mRNA의 수준에서 결합 검출 듀얼 루시퍼 라제 분석에 기초한다. 3&#39;LIFE은 게놈 와이드 화면을 비 독점 버퍼 및 시약, 그리고 공개적으로 사용할 수 기자 라이브러리를 사용 가능하고 비용 효율적인. 3&#39;LIFE 표준 실험실 환경에서 수행 중 또는 액체 처리 로봇 및 기타 높은 처리량 장비를 사용하여 확장 할 수 있습니다. 우리는 인간의 96 웰 플레이트에 복제 3&#39;UTRs, 2 개의 시험의 miRNAs의 데이터 집합을 사용하는 방법을 설명, 렛 7C 미르-10B. 우리는 96 웰 형식 DNA 준비, 형질 전환, 세포 배양 및 루시퍼 라제 분석을 수행하고, 데이터를 툴을 제공하는 방법을 보여분석. 결론적으로 3&#39;LIFE 매우 재현 신속하고 체계적이며, 높은 신뢰성 목표를 식별합니다.

루미 출력 파일은 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 단백질 원료 측정이 포함되어 있습니다. 와 - Mangone 랩 웹 사이트 (에서 사용 가능한 &quot;3&#39;LIFE 다판 분석&quot;스프레드 시트 -이 원시 형식은 &quot;단판 분석 3&#39;LIFE&quot;와 호환 <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). 단판 분석 스프레드 자동 반딧불이 / 레 닐라 비율을 계산 적절한 음성 대조군 miRNA를 각각 정규화하?...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K 조회수.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

비디오: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

연구

생물학

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...