이 방법은 순환 바이오마커와 환자 예후 사이의 관계와 같은 번역 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 입력 재료로 쉽고 신뢰할 수있는 방법론으로 순환 바이오 마커 패널의 발현을 평가 할 수있는 기회입니다. 이 기술의 의미는 환자의 의사 결정 및 치료 모니터링에 유용한 순환 바이오 마커를 식별 할 수 있기 때문에 암 환자의 치료로 확장.
또한,이 방법은 순환 바이오 마커 분석에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 질병의 분자 특성화를 위한 조직 바이오마커 발현 분석과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있다. 추출 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다.
먼저 플라즈마 샘플 400마이크로리터를 RNase 가 없는 2밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음 튜브에 400 마이크로리터의 데니어링 솔루션을 추가합니다. 1나노몰러 스파이크인의 마이크로리터 4개를 추가합니다.
용액을 혼합 한 후 800 마이크로 리터의 산 페놀 클로로폼을 추가하십시오. 60초 동안 용액을 소용돌이치며, 원심분리기는 최대 속도로 15분 동안 사용됩니다. 다음으로, 상부 수성 단계에 포함된 리자이트들을 깨끗한 튜브로 옮기고, 단계 간을 방해하지 않도록 주의한다.
복구된 수성 상의 부피를 측정하고 1/3 부피를 용액에 추가합니다. 그런 다음 필터 카트리지를 신선한 수집 튜브에 넣습니다. 에탄올-리세이트 혼합물의 최대 700마이크로리터를 필터 카트리지로 옮길 수 있습니다.
10, 000배 의 중력에서 30초 동안 필터 카트리지를 원심분리합니다. 다음으로, 흐름 의 총 볼륨을 측정합니다. 그런 다음, 에탄올 부피의 2/3을 여과에 넣고 잘 섞는다.
두 번째 필터 카트리지를 신선한 컬렉션 튜브에 넣습니다. 이어서, 최대 700마이크로리터의 카트리지로 옮기고, 원심분리기는 30초 동안 10, 000배 의 중력으로 유동을 폐기한다. 필터 카트리지에 700 마이크로리터의 마이크로리터를 추가하고 15초 동안 10, 000배 의 중력으로 수집 튜브로 원심분리기를 제공합니다.
흐름을 버리고 필터 카트리지를 동일한 튜브에 다시 넣습니다. 이 후 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 이동합니다. 그런 다음 예열된 용용 용액 100마이크로리터를 카트리지에 추가합니다.
필터 카트리지를 10, 000배 의 중력으로 30초 동안 원심분리하여 마이크로RNA를 복구합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 다각성 반응 혼합 칵테일을 준비합니다. 반응 플레이트의 각 웰에 샘플의 두 마이크로 리터를 전송합니다.
그런 다음 반응 칵테일의 마이크로 리터 3 개를 각 우물에 추가합니다. 소용돌이와 원심분리기는 접시를 짧게 분리하여 내용물아래로 회전합니다. 다음으로 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다.
원심분리기 튜브에서 리기션 반응 믹스 칵테일을 준비합니다. 다음으로 반응 플레이트의 각 웰에 칵테일 10 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음, 1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 반응 플레이트의 내용을 혼합한 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 혼합합니다.
그 후 반응 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다. 역전사 반응을 수행하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 원심분리기 튜브에서 반응 혼합을 준비한다. 그런 다음, 리깅 생성물을 포함하는 플레이트의 각 웰에 믹스15 마이크로리터를 추가합니다.
1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 플레이트의 내용기를 섞은 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 섞습니다. 다음으로 플레이트를 열 순환기에 배치하고 텍스트 프로토콜에 설명된 절차를 따릅니다. 그런 다음 miR-Amp 반응 믹스를 준비하고, 새로운 반응 플레이트의 각 웰에 45 마이크로리터를 첨가한다.
그 후 반응 플레이트의 각 웰에 RT 제품의 5마이크로리터를 추가합니다. 1, 900 rpm에서 1분 동안 셰이커에 접시를 섞은 다음 플레이트의 간단한 원심분리기를 섞습니다. 그런 다음 플레이트를 열 순환기에 넣고 텍스트 프로토콜 중 하나에 설명된 절차를 따릅니다.
첫째, 각 cDNA 샘플을 TE 버퍼로 희석시 희석시. 그런 다음 원심분리기 튜브에서 PCR 반응 믹스를 준비합니다. 볼륨의 10%를 초과하여 추가합니다.
반응 믹스의 19 마이크로리터를 플레이트의 각 웰에 옮기. 접시를 밀봉하고 원심분리기를 짧게 밀봉합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜의 표 2에 설명된 대로 RT-PCR 시스템에서 열 프로토콜을 수행합니다.
스파이크인 제어의 직렬 희석은 이 특정 케이스 시리즈의 모든 플라즈마 샘플에 첨가하는 가장 좋은 농도를 선택하기 위해 수행되었다. 이 프로토콜 덕분에 전체 케이스 시리즈에서 단일 바이오마커뿐만 아니라 모든 단일 환자에서 모든 바이오마커를 평가할 수 있었습니다. 본 프로토콜에서, 진행없는 생존, 전반적인 생존 및 객관적인 반응 비율과 관련하여 혈관 신생 관련 순환 miRNAs의 패널은 화학요법 요법으로 치료된 대장암 환자에서 분석되었다.
기준선과 제1 임상 평가 사이의 miRNA의 발현 수준을 비교하면, 하스-miR-155-5p의 증가가 관찰되었다. 이 증가는 짧은 PFS 및 OS와 연관되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 연기 후드 에서 페놀 클로로폼을 사용하여 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 순환 단백질 또는 코딩 RNA의 격리 및 분석과 같은 다른 방법은 순환 바이오 마커의 보다 철저한 패널의 평가와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.
개발 후, 이 기술은 액체 생검 분야의 연구원들이 암 환자의 순환 바이오마커의 발현을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 혈액 및 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 실험실 코트와 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
