This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

여기에 설명 된 모든 실험은 네덜란드 법률 및 규정 (RU 12 월 2013-205)에 따라 Radboud 대학 네이 메헨에서 동물 실험에 대한 지역위원회의 승인을했다. 1. 세포 외 기질 젤 명소 <ol><li> 분리하기 전에 다음 단계를 일일를 수행합니다 <ol><li> 적어도 1.5 시간 동안 4 ℃에서 분취 외 매트릭스 젤 (100 μL)를 해동. 둘 베코의 수정 이글의 중간에 1:10 희석; 4500 밀리그램 / L 글루코스, 4mM의 L- 글루타민 및 110 ㎎ / ㎖ 나트륨 피루 베이트 (DMEM)와. 항상 4 ℃에서 세포 외 기질 젤을 유지합니다. 참고 : 갑작스러운 온도 변화가 고르지 코팅 및 결정 형성에 발생합니다. </li><li> 15 분 동안 얼음에 희석 외 매트릭스 겔 용액을 유지. </li><li> 10 분 동안 20 μL 마이크로 피펫을 사전 진정. </li><li> 100mm 페트리 접시에 8 잘 챔버 슬라이드를 넣고 10 분 동안 차가운 표면 (예 : 냉동 팩)에 접시를 전송합니다.</li><li> 각 웰에 10 ㎕의 세포 외 기질 겔 방울을 넣어 예비 냉각 마이크로 피펫을 사용한다. 적어도 다른 7 분 (그림 1A)의 차가운 표면에 페트리 접시를 유지합니다. </li><li> 완전히 남아있는 세포 외 기질 젤 (그림 1B)를 제거하고, 밤새 37 ℃에서 우물을 건조. </li></ol></li></ol> 2. 해부 머리의 근육 (턱, Digastric 및 상안검 거근 벨리 Palatini) <ol><li> 해부하기 전에, 인산염 완충 식염수 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)로 보충 (PBS)의 50 ㎖를 준비합니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> CO 2 / O 2 일 젊은 성인 쥐 (9 주)의 안락사 후, 머리를 목을 벨과 머리에서 피부를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에 머리를 전송은 50 ㎖ 튜브에 2 % P / S 보충. </li><li> (1 아가미 아치에서 파생) 턱 근육 <ol><li> 실리콘 패드에 한면을 위로 머리를 놓고 피하 N으로 해결eedles (그림 2A). </li><li> 이하선과 안면 신경 (그림 2A)를 확인합니다. 글 랜드를 덮고 깊은 근막을 노출. 근막을 잘라 해부 가위를 사용하여 선을 제거합니다. 외이도를 확인합니다. stylomastoid 난원에서 안면 신경을 추적 조심스럽게 메스 블레이드 번호 15, 시간적 광대뼈, 및 구강 가지를 제거합니다. </li><li> 근막을 제거하여 턱 근육의 표면 머리를 무료로 제공됩니다. 턱 근육의 표면과 깊은 모두 머리를 식별합니다. 상악의 광대뼈 과정에서 삽입의 두께 건의 건막 때까지 표면 머리를 추적합니다. </li><li> 직선 집게와 광대뼈 과정에서 그 기원에서 건을 분리합니다. 메스 블레이드 제 15 호 또는 해부 가위 조심스럽게 인생을 (그림 2B)로 잘라. </li><li> 그 각도로 삽입 및 T의 열등한 반까지 턱의 표면 머리를 해부하다그는 메스 블레이드 제 15 호 (그림 2C)과 하악의 골지의 표면 측 방향의. 이제 완전히 근육을 제거합니다. </li></ol></li><li> (2 차 아가미 아치에서 파생) digastric 근육의 후방 배 <ol><li> 실리콘 패드 앙와위에서 머리를 놓고 피하 주사 바늘 (그림 3A)이 수정. </li><li> 설하과 턱밑 샘을 모두 덮는 피하 지방을 제거합니다. 다음으로, 표면 근막 및 해부 가위를 사용하여 땀샘을 제거합니다. digastric 근육 (전방 및 후방 배)을 노출. </li><li> 직선 집게와 후방 배의 앞쪽 힘줄을 잡고 잘라하고, 고막 수포 (그림 3B)에서 그 기원까지 조심스럽게 해부. 반대편에서 같은 작업을 수행합니다. </li></ol></li><li> (4 아가미 아치에서 파생) 상안검 거근 벨리의 palatini 근육 <ol><li> digastric 근육의 후방 배의 절개 후, 옆으로 당겨, stylohyoid 근육을 지역화, 조심스럽게 (그림 4A)를 제거합니다. </li><li> 고막 수포 (그림 4A)에 삽입 눈꺼풀 올림 근 벨리의 palatini의 건 지역화. 조심스럽게 해부하고 양쪽에 잘라. </li><li> 기관과 그 뒤에 실행 식도를 찾습니다. 식도를 들어 올리고 인두, 후두와 부드러운 미각을 노출. </li><li> 눈꺼풀 올림 근 벨리의 palatini 삽입 부드러운 미각의 영역을 현지화하고 느슨한 (그림 4B)을 잘라. 참고 : 직접 절개 한 후, 조심스럽게 스테레오 현미경으로 각 근육에서 건과 결합 조직을 제거합니다. 에탄올 70 %에 신속하게 모든 표본 잠수함, 그리고 얼음처럼 차가운 PBS로 전송 15 ML 튜브에 2 % P / S를 보충. </li></ol></li></ol> 위성 세포의 분리 (3) <ol><li> 근육의 3 그룹의 SC 격리를위한 다음과 같은 준비 단계를 수행합니다 : <ol><li>DMEM에 0.1 % 프로 나아 7.5 ml의를 준비합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 솔루션을 필터링합니다. 분리하기 전에 10 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 용액을 미리 가온. </li><li> 준비 10 % 말 혈청 (HS), 1 %의 P / S가 보충 된 DMEM 35 ml의. 또한 미리 따뜻한 37 ℃ 수욕. </li><li> 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 % HS, 1 % P / S, 1 % 닭 배아 추출액 (CEE)가 보충 된 DMEM으로 구성되어 15 ml의 배지를 준비한다. 수욕에서 37 ° C에서 미리 따뜻한. </li><li> 프리 코트 여섯 플라스틱 피펫을 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 함께 HS (10 mL) 및 건조. </li></ol></li><li> 배양 후드에서, 6 웰 플레이트의 각 웰에 근육을 전송. 해부 가위를 사용하여, 약 2mm의 작은 조각에 근육을 잘라. 조직을 너무 많이 말하다하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 각 웰에 0.1 % 프로 나제​​ 용액 2.5 mL를 추가하고 60 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 조심스럽게 20, 40, 60 분 후 판을 흔들. 참고 : 정확한 duratio을배양 n은 동물의 나이와 변형 등의 요인에 따라 달라집니다. </li><li> 현미경으로 모니터링합니다. 근육 조각을 확인하고 섬유 번들이 느슨해 모양 (그림 5)를 얻을 때 효소 소화를 중지합니다. </li><li> DMEM 2.5 ml의 10 % 및 1 % HS의 P / S가 보충 된 추가. 5 분 동안 400 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기에 튜브를 전송합니다. 경사에 의해 상층 액을 버린다. </li><li> 10 % HS와 1 % P / S 보충을 5 ml의 DMEM을 추가합니다. 조직을 균질화 위 아래로 10 ml의 플라스틱 피펫 (분쇄)에 적어도 20 번 솔루션을 피펫. </li><li> 4 분 동안 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 10 % HS와 1 % P / S 보충을 5 ml의 DMEM을 추가합니다. 피펫 다시 조직 조각까지 10 ml의 플라스틱 피펫과 피펫을 통해 쉽게 전달합니다. </li><li> 4 분 200 XG에서 튜브를 원심 분리기와 15 ML 튜브에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 피50 ㎖ 튜브에 세포 스트레이너 (40 μm의) UT 및 필터 상에 해리 된 세포를 포함하는 상등액을 전송. 최대 세포 복구를 위해 1 ML의 DMEM 씻으시오. </li><li> 10 분 동안 1,000 XG에서 튜브를 원심 분리기와 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 300 ㎕의 배양 배지에 펠렛을 재현 탁하고에서 혈구 세포를 카운트. </li></ol> 세포 외 기질 젤 명소에 위성 세포의 분화 (4) <ol><li> 배지 10 ㎕를 1.5 × 103 세포를 얻기 위해 세포 현탁액을 희석. </li><li> 테이프로 챔버 슬라이드 커버를 안전하고 개체 유리의 바닥면에 검은 색 마커 지점을 표시합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 세포 외 기질 겔 스팟 상에 10 ㎕의 세포 현탁액의 방울을 넣어. 세포 현탁액의 방울을 그 자리에 정확하게 배치되었는지를 현미경으로 확인한다. 37 ℃에서 6 시간 동안 품어. </li><li> 주의LY는 배양 배지 (20 % FBS가 보충 된 DMEM, 10 % HS, 1 % P / S 및 1 % CEE) 400 μL를 추가하고, 37 ℃에서 사흘 동안 배양한다. 참고 :이 시점에서, 갓 격리 SC는 대규모 외상 (효소 다이제스트 및 거친 분쇄)을 실시하고 복구 할 필요가있다. 3 일 (37) 동안 셀들을 방해하지 않도록, 배양 배지는 실험의 유형에 따라 변경 될 수있다. 세포 외 기질 겔 스팟 분화 검정 용 높은 세포 밀도 (1.5~2.5 × 10 20분의 3 μL) 시드 될 수있다. 배양액 (DMEM은 20 % FBS, 10 % HS, 1 % P / S, 1 % 닭 배아 추출물로 보충) 매 세 번째 날 대체 될 수있다. </li><li> 확장 및 전달이 요구되는 경우 또는, 다음 단계를 수행합니다 : <ol><li> 적어도 1.5 시간 동안 4 ℃에서 분취 외 매트릭스 젤 (500 μL)를 해동. DMEM에서 1:10 희석과 포인트 1.1.1의 권장 사항을 따르십시오. </li><li> 4에서 10 분 동안 10 ml의 피펫을 사전 진정# 176; C. </li><li> 10 분 동안 차가운 표면 (예 : 냉동 팩)에 세 T75 플라스크를 전송합니다. </li><li> 각 플라스크에 1 ml의 세포 외 기질 젤을 넣어 미리 냉장 피펫을 사용합니다. 표면이 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 적어도 다른 7 분 (그림 1A)의 차가운 표면에 플라스크를 유지합니다. </li><li> 완전히 10 ㎖ 피펫 나머지 외 매트릭스 겔을 제거하고, 1 시간 동안 37 ° C에서 건조 웰. </li><li> 계산 한 후, 배양 배지를 미리 코팅 된 T75 플라스크에 종자 (20 % FBS, 10 % HS, 1 % P / S, 1 % 닭 배아 추출물이 보충 된 DMEM) 10ml에 갓 절연 SC와 재현 탁. </li><li> 삼일 후, 80 %의 합류 때까지 매체 (모든 셋째 날)를 변경하는 것은 도달한다. 계대를 들어, PBS로 T75 플라스크를 세 번 씻는다. 다음 1 ml의 0.25 %를 트립신 용액을 첨가하고 37 ℃에서 세 분 동안 품어. 배지 9 용액에 재현 탁은 (DMEM은 10 % HS, 1 % P / S, 20 %의 FBS로 보충1 % 닭 배아 추출액)과 5 분 동안 200 XG 원심 분리기. 상층 액을 버린다. 계산 한 후, 배양 배지 중 1000 μL를 1 × 106 세포를 재현 탁하고, 세포를 동결. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

다른 branchiomeric 머리 근육에서 희주 전에 확장 및 계대없이 한 9 주령의 Wistar 쥐와 세포 외 기질 젤 명소에 직접 배양에서 분리 하였다. 분리 후, 세포를 계수하고, 동일한 셀 밀도로 시딩. 세 가지 다른 근육의 병렬 분리의 경우,이 방법은 약 4 시간이 걸립니다. 배양 오염을 방지하기 위해, 중요한 단계는 근육 절개 후 70 % 알코올에 신속한 세정이다. SC 분리 중에 작은 조각으로 근육 조직 (약 2mm)을 절단하지만,이 때문에 세포 손상의 소세포 수율 초래하므로 너무 닦지을 방지하는 것이 중요하다. 또한, 소화 효소의 지속 기간은 또한 손상되지 않도록주의하여 현미경으로 점검해야한다. 소화의 목적은 근섬유를 해리하는 것이다. 분리 된 세포의 90 % 이상이 Pax7을 표현하기 때문에, 더 이상의 정제 (도 6-8) 필요하지 않다.이 같은 퍼콜 (39, 40)에 코팅 요리 14,37,38에 사전 도금, 분류 등의 다른 방법의 추가 정제 단계를 피할 수, 직관 형 형광등 또는 자기 또는 셀은 41, 43 정렬. 분쇄하고 이것이 기계적으로 SC의 방출을 허용하는 조직편과 피펫 팁의 개구부 사이에 전단을 야기하는 것이 필수적이다. (직경 팁 내부 : 1mm) 10ml를 피펫으로 분쇄가 어려운 경우, (직경 팁 내부 : 2mm)을 5 ml 피펫 먼저 사용할 수 있습니다. 대안으로, 유리 파스퇴르 피펫 원하는 직경에서 절단 될 수 있고 사용될 수. 이 방법은 간단하고 효율적인 다른 근육 샘플들로부터 SC의 동시 분리를 허용한다. 용으로 SC 배양 플레이트는 젤라틴이나 콜라겐으로 코팅 될 수 있지만, 우리의 이전 연구는 세포 외 기질은 콜라겐 겔 (38)보다 전위 근육 조직의 유지를위한 훨씬 더 나은 것을 보여준다. 세포 외 기질의 겔 스팟밀리미터 크기 (10 μL / O 2mm 또는 20 μL / O 4mm)의 증식과 세포의 제한된 숫자와 희주의 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다. 분화 분석을 위해 약 8-20 배 적은 세포를 24 웰 플레이트 (O 15.6 ㎜)에 비해 필요하며, 적은 약 80-200 배는 35mm 페트리 접시 (Ø 35mm) 14,38 비교. 세포 외 기질 겔 고가이기 때문에,이 방법은 또한보다 비용 효율적이다. 또한, 챔버 슬라이드를 플라스틱 커버에 의해 대체 될 수는 더 비용 절감을 미끄러. 세포 외 기질 겔의 제조를위한 챔버 슬라이드 밤새 건조 필수적인 스폿. 세포 외 기질 겔 스팟 투명 같이, 조명을 위로하여 바닥면에 점을 표시 할 필요가있다. 챔버 슬라이드 쉬운 조작의 페트리 접시에 고정되어 있습니다. 또한 세포 배양 확장에 작은의 희주를 연구 할 수있는 가능성을 제공하는 필요가 없습니다근육 또는 작은 근육 샘플을 LER. 다르게는, PCR 또는 근육에 대한 예는 셀이 더 필요한 경우 전술 한 바와 같이, 갓 고립으로 SC 먼저 T75 플라스크로 확장 될 수있다 구성한다. SCS는이 프로토콜을 사용하는 분리 직후 유동 세포 계측법으로 추가의 정제에는 적합하지 않다 절연. 프로 나제와 소화 표면의 광범위한 소화 14 항원이 발생합니다. 다른 로트 번호가 차등 아세포의 증식과 분화에 영향으로 세포 배양에 사용되는 말의 혈청 및 소 태아 혈청 먼저 제대로 분리하기 전에 특징으로해야합니다. 최근, 아가미 아치와 헤드 중배엽 (예 외안근) (24)로부터 유도 된 근육에 관심이 증가하고있다. 그것은 분명 머리와 다리 근육이 매우 다른 특성을 가지고 있음을 입증하고있다. 오래된 동물의 턱 근육이 다시 보인다사지 근육 (25), (26)과 비교하여 자신의 재생 능력을 주석 박. 외안근에서 SCS는 머리 근육에서 희주에 필적하는 강력한 증식과 분화 능력을 보유하고, 사지 근육으로 SC (24)보다 더 큰 생착 가능성을 보여줍니다. 섬유 형 분포 및 미오신 조성물은 근육 그룹 중에서 또한 종간 변한다. 인간의 첫 번째 아가미 아치에서 발생하는 근육은 심장 근육을 개발하기위한 전형적인 느리고 빠른 두 섬유 (서브 타입 인천 국제 공항과 IIX), 신생아 myosins 및 myosins가 포함되어 있습니다. 설치류에서 이러한 근육은 약 95 % 빠른 섬유 마이 오신 IIA 및 IIB) 44 ~ 46이 포함되어 있습니다. 조류 근육에 대한 연구는 서로 다른 근육 섬유 유형에서 희주는 분화 능력에 차이가 있음을 보여줍니다. 느린 섬유에서 희주의 두 섬유의 종류 47로 분화 할 수있는 동안 빠른 섬유에서 SCS는 만, 빠른 근육 섬유로 분화. 또한, 빠른 근육 희주의 비율섬유는 느린 근육 섬유 48, 49에 비해 낮다. 이것은 섬유 형 분포 안면 영역에서 근육에 대한 연구에서 고려되어야한다는 것을 나타낸다. 구개열 근육과 마찬가지로, 설치류의 LVP 빠른 섬유 (50)에게 거의 독점적으로 포함되어 있습니다. 그 때문에, LVP로부터 SCS는 구개열 분야의 전임상 연구를 위해 적합하다. 이 프로토콜은 branchiomeric 머리 근육 또는 다른 작은 근육 또는 작은 근육 샘플에서 파생 된 희주을 연구하는 새로운 가능성을 제공합니다. 이는 구개열로서뿐만 아니라 작은 근육에 영향을 미치는 다른 조건에 조건 악안면 영역에서 근육의 재생을 개선하기위한 새로운 치료법의 개발을 용이하게 할 것이다.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

약 1 : 500 ~ 1 : 1,000 신생아는 입술 및 / 또는 구개 (CLP)를 포함하는 틈을 전시; 따라서, 이것은 한 사람의 가장 흔한 선천성 기형이다. 부드러운 입천장의 근육은 음성, 연하, 그리고 흡입하는 동안 부드러운 미각의 기능을 위해 중요하다. 부드러운 미각의 갈라진 틈이있는 경우, 이러한 근육이 비정상적으로 구개 뼈의 뒤쪽 끝 부분에 삽입됩니다. 연구 개는 코를 통해 공기가 빠져 나가는 것을 방지 연설에서 위아래로 이동합니다. 미각의 갈라진 어린이는 구개 범인 두 기능 부전 2,3로 알려진 현상의 결과로이 제어 기능이 없습니다. 치료 프로토콜이 변수이지만, 부드러운 구개의 수술 수리 유아 (생후 6-36개월) 4에서 일어난다. 부드러운 미각의 이상 삽입 근육 수술 5-7 보정 할 수 있지만, 구개 범인 두 기능 부전은 30 %로 7 %에서 지속환자 2,3,8-10의. 위성 세포 SCS ()의 작용을 통해 재생하는 골격근의 기능은 잘 확립되어있다 (11, 12). 근육 손상시, SCS는 활성화 및 부상의 사이트로 이동한다. 그런 다음, 증식 분화, 새로운 근섬유 또는 수리 손상된 사람 (13)을 형성하기 위해 융합. 그들의 자손, 증식 근육 모세포가 추가로 근육 조직 결정 요인 1 (MyoD) (16)을 표현하면서 대기 SCS는, 전사 인자 Pax7 14, 15를 표현한다. 차별화 근육 아세포 17 (MyoG)를 오게 닌 표현하기 시작합니다. 근육 아세포 분화의 단자는 근섬유의 형성 및 미오신 중쇄 (MyHC) (16, 18)와 같은 근육 특이 단백질의 발현에 의해 표시된다. 최근 몇 가지 전략은 사지의 근육 19-23의 근육 재생을 향상시키기 위해 재생 의학에 사용되어왔다. 에 대한 구체적인 연구그것은 최근에 그들이 여러 측면 (24)의 다른 근육과 다를 것을 증명했기 때문에 branchiomeric 머리 근육도 중요하다. 사지 근육과는 대조적으로, 그것은 branchiomeric 머리 근육이 덜으로 SC (25)를 포함하는 느린 재생,보다 섬유 결합 조직이 다른 전사 인자를 발현 branchiomeric 머리 근육에서 SC와 증식, 또한 부상 (26) 이후에 형성하는 것이 제안되었다. 예를 들어, Tcf21, 안면 근육 형성 용 전사 인자 강하게 머리 근육 재생에 있지만 거의 사지의 근육 (25)를 재생 표시된다. CLP 환자의 부드러운 입천장의 근육은 일반적으로 작고 덜 정상 구개 근육 27,28에 비해 잘 구성되어 있습니다. 느리고 빠른 섬유는 모두 부드러운 구개 근육에 존재하지만 느린 섬유는 더 풍부하다. 대조적으로, 분열 근육도 빠르고 높은 섬유의 비율 및 감소 된 모세관 공급 포함일반 연구 개 근육 29-31 비교. 빠른 섬유는 수축에 의한 상해 31-33 더 많은 경향이있다. 첨부 가난한 모세관 공급도 섬유증 (34, 35)을 촉진 할 수있다. 이러한 모든 측면은 수술 갈라진 폐쇄 (36) 후 연구 개 근육의 가난한 재생에 기여할 수있다. 이러한 관점에서, 헤드 branchiomeric 근육으로 SC의 분리 및 특성화를위한 프로토콜은 중요하다. 이 branchiomeric 머리 근육의 SC 생물학을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다. 또한, 조직 공학을 기반으로 새로운 치료법은 CLP 및 두개 안면 영역을 손상시키지 다른 조건에서 수술 후 근육의 재생을 촉진하기 위해 개발 될 수있다. 일반적으로, SCS는 근육 조직 (14)의 분해 후에 얻어 질 수있다. 닦지 효소 소화 및 분쇄은 일반적으로 자신의 틈새 시장에서 희주를 해제해야합니다. SCS는 FR, 무지 14,37,38 접시에 미리 도금에 의해 정제 할 수있다actionation는 퍼콜 (39, 40)에, 직관 형 형광등 또는 자기 또는 셀은 41-43 정렬. 여기에서 우리는 젊은 성인 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리를 위해 새로운 경제 및 신속한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 이전 원고 (14) 및 특히 작은 조직 샘플에 대한 적응에 기초한다. 1 차, 2 차, 4 차 아가미 아치에서 발생하는 대표적인 근육에서 희주의 분리는 설명한다. 분리 후 위성 세포의 낮은 숫자는 분화를 연구 할 수 밀리미터 크기의 세포 외 기질 젤 관광 명소 배양. 이 방법은 확장으로 SC 및 계대에 대한 요구를 피한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

이 프로토콜을 이용하여, 턱 근육 (한쪽) 0.8-1 × 106 세포 digastric 근육 (후방 배) 1.5 X 105 세포를 수득하고, 거근 벨리 palatini 근육 수율 1.5 × 105 세포를 산출한다. 셀 수익률은 동물의 근육 유형, 변형, 나이에 따라 달라집니다. 세 근육 그룹 간 비교를 위하여, 갓 고립으로 SC는 동일한 셀 밀도 (1.5 × 10 10분의 3 μL) 시딩 하였다. 직접 분리 한 후 신선하게 분리 된 세포의 90 % 이상은 Pax7 (도 6)을 표현한다. 4 일, 7, 10 문화는 Pax7, MyoD, MyoG 및 MyHC의 면역 염색에 대한 항체로 염색했다. 임의의 5 필드는 20X 대물 렌즈를 이용하여 배양 당 계수 하였다. 4 일 팍스 7 및 묘 D 모든 근육 그룹에서 발현된다 (도 6 및도 7 및도 8), 턱과 digastric 근육에서의 SatCs 그러나 자손 EXPRES 시작오게 닌 이전 눈꺼풀 올림 근 벨리의 palatini 근육 (그림 9)보다 노래. 10 일에, MyoG의 발현이 강하게 모든 그룹에서 (그림 9) 감소한다. 며칠 외 매트릭스 겔 스팟에 파종 후, 증식하는 세포를 융합 및 미오신 중쇄를 발현 멀티 myotubes 핵을 형성하기 시작한다. 작은 myotubes는 7 일 (그림 10)에서 명확하게 볼 수 있습니다. 10 일에, myotubes의 경련은 (비디오 1)을 관찰 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> 그림 1 :. 챔버 슬라이드에 세포 외 기질 젤 명소 (가) 쉬운 조작, 100mm 페트리 접시에 8 잘 챔버 슬라이드를 배치합니다. 피펫 10 μL 세포 외 기질 각 챔버에서 젤 차가운 표면 (7 분)에 넣어. (B)를 초과하는 세포 외 기질 G 후 회의소 슬라이드엘이 제거됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> 그림 2 :. 측면보기 동물의 턱 근육의 해부 (A) 머리. 귀 (E), 이하선 (P)과 안면 신경 (VII). (B) 턱 근육 (MS)와 시간적 근육 (t)의 표면 머리의 건의 건막 (테). 집게와의 삽입에서 건을 분리합니다. (C)는 조심스럽게 하악의 골지에서의 삽입 때까지 근육을 해부하다. E : 귀, P : 이하선, VII : 안면 신경, T : 임시 근육, MS : 턱 근육, 테의 표면 머리 : 건, 헌병 : 턱 근육의 깊은 머리. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> 그림 3 : digastric 근육의 후방 배의 해부 (.앙와위에서 동물의) 머리. 악하선 SG (), 턱 근육 (M), 안면 신경 (VII)과 흉쇄 근육 (SCM)를 로컬 라이즈. 턱밑 샘을 제거합니다. (B) digastric 근육 전방 (AD) 및 후방 배 (PD)를 로컬 라이즈. 직선 집게로, 후방 배의 앞쪽 힘줄을 잘라와 고막 수포 (타이)에서 그 기원까지 조심스럽게 해부. E : 귀 판관비 : 턱밑 샘, VII : 안면 신경, M : 턱 근육, SMC : 흉쇄 근육, 광고 : 전방 배 digastric 근육, PD : 후방 배 digastric 근육, 타이 : 고막 수포. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> 그림 4 :. 눈꺼풀 올림 근 벨리의 palatini 근육의 해부 () digastric 근육 (후방 배)의 절개 후 일반보기를. Stylohyoid 근육 (세인트)과 눈꺼풀 올림 근의 건벨리의 palatini은 지역화 할 수 있습니다. 뒤에 실행 기관 (T)과 식도 (들) 참고. 기관과 인두 (P)가 노출되어 식도를 해제 한 후 (B). 부드러운 입맛에 눈꺼풀 올림 근 벨리의 palatini의 삽입은 이제 볼 수 있습니다. 화살표는 양측 상안검 거근 벨리의 palatini의 근육 해부 부드러운 미각을 나타냅니다. E : 귀, ST : stylohyoid 근육, VII : 안면 신경, M : 턱 근육, 광고 : 전방 배 digastric 근육, PD : 후방 배 digastric 근육, T : 기관, 에스 : 식도, P : 인두, * 눈꺼풀 올림 근 벨리의 palatini 근육 . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> 도 5 : 프로 나제와 효소 분해 후 전에 근육 조직 (A)의 외관 및 (B). 근육 번들 효소 소화 한 후 느슨하게 한 것으로 나타났습니다합니다. 도 6 : 7 팍스 면역 격리 끝에 외 매트릭스 겔인가 갓 절연 : SCS (약 6 시간 초기 티슈 소화 후).. 임의의 5 필드는 필드 당 210 세포의 평균 10X 대물 렌즈를 이용하여 계수 하였다. 세포의 약 90 %가 양성 조절제 7이다. DAPI : 파랑, Pax7 : 빨간색. 스케일 바, 100 μm의. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> 그림 7 :. 팍스 (7), MyoD 면역 4 일, 7, 10 문화는 Pax7에 대한 항체, 및 MyoD의 면역 염색으로 염색 하였다. (A - C) 및 (D - F) 4 일 대표 현미경 사진과 턱 근육에서 7 문화. (G와 H </stroNG&gt;) Pax7 + + MyoD 및 현미경 필드 당 핵의 수를 계수하고 핵의 총수 (DAPI)의 백분율로 표시 하였다. DAPI : 파랑, Pax7 : 빨강, 및 MyoD : 녹색. 저울 막대, 100 ㎛. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> 그림 8 :. 턱, digastric과 눈꺼풀 올림 근 벨리 팔라티노 근육에서 문화 단핵 세포에서 문화 Pax7 ± / MyoD ±의 분포 (A - C) 4 일, 7, 10 문화 Pax7에 대한 항체, 및 MyoD의 면역 염색으로 염색 하였다. 세포의 총 수는 핵의 총수 (DAPI)을 기반으로한다. (D) CEL ± Pax7 ± / MyoD의 데이터 정량화LS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> 그림 9 :. 오게 닌 면역 4 일, 7, 10 문화가 오게 닌에 대한 항체로 염색했다. (- D) 대표 4 일의 현미경 사진과 눈꺼풀 올림 근 벨리의 팔라티노 근육에서 7 문화. (E) + MyoG 현미경 필드 당 핵의 수를 계수하고 핵의 총수 (DAPI)의 백분율로 표시 하였다. MyoG + 세포 (F) 데이터 정량화. DAPI : 파랑, 오게 닌 : 녹색. 저울 막대, 100 ㎛. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">이 figur의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>전자. <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> 그림 10. 마이 오신 중쇄 면역 4 일, 7, 10 문화는 마이 오신 중쇄 (MyHC)에 대한 항체로 염색했다. 대표 하루 4, 7의 현미경 사진과 digastric (DIG) 근육에서 10 문화. 하루에 10 긴과 잘 조직 된 myotubes 분명 동안 7 일에, 작은 myotubes는 존재한다. 스케일 바, 200 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 비디오 1 :.. Myotube 꿈틀 꿈틀 myotubes 두 대표적인 분야로는 하루 digastric 근육에서 10 문화를 나타낸다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K 조회수.  Radboud University Medical Center.  이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다. 

비디오: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

절연 및 Endomyocardial Bioptic 샘플의 Arrhythmogenic 심장 근육 병 증 환자에서 심장 중간 엽 기질 세포의 특성

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...