저자는 DHMRI CLAS 동물 관리 직원의 강력한 지원을 인정하고 싶습니다, 시설 관리자 씨 다니엘 페랄타와 참석 수의사, 박사 Glicerio 이그나시오, DVM MRCVS.

모든 동물 절차 프로토콜 14-017 아래, 노스 캐롤라이나 연구 캠퍼스 (NCRC)에있는 데이비드 H. 머독 연구소 IACUC 승인하고, 당뇨병과 prediabetes / 인슐린 저항성 및 치료제의 효능의 비인간 영장류 모델의 특성을 개선하기 위해 인슐린 감수성 및 신진 대사 기능. 1. 동물 선택 및 학습 준비 <ol><li> 매달 음식 섭취 및 체중에 기초하여 레코드를 선택 다이어트 및 중량 안정 동물. 참고 : 자신의 음식 섭취가 안정 될 때까지 식욕에 최근 하락을 전시 한 동물을 특징으로 할 수 없습니다. <ol><li> 성숙한 동물 (&gt; 5-6 년), 본문 개월 연속 간의 가중치 먼저 원숭이 검사와 무게에 극적인 변화를 대사 상태를 변경 이외의 다른 원인을 배제하지 않고 10 % 이상 차이가 동물을 선택하지 마십시오. </li></ol></li><li> 포도당, 인슐린 및 C-pepti에 대한드 분석은 단백질 분해 효소 억제제 (아프로 티닌 및 DPP4I)와 K 2 EDTA 샘플 수집 튜브를 준비합니다. 참고 : DPP4I + 아프로 티닌 칵테일 프로테아제 억제의 폭 넓은 스펙트럼을 제공하는이 추가적인 분석 (글루카곤, GLP-1)에 요구한다. 추가적인 분석이 수집되지 않는 경우, 혈액 튜브 시료 채취의 일관성을 유지하기 위해 동일한 방법으로 제조한다. 이 방법에 대한 유효성이 확인되지 분석을위한 샘플은 제조업체의 권장 사항에 따라 개별적으로 수집되어야한다. <ol><li> DPP4I 10 ml의 아프로 티닌, 동결 건조하여 100 mg을 혼합하여 프로테아제 억제제 칵테일을 준비합니다. 수집 된 혈액의 모든 밀리리터 각 혈액 튜브에 아프로 티닌 + DPP4I 혼합물의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 가능한 컬렉션 없더군요 각 튜브에 단백질 분해 효소 억제제 칵테일의 추가 10 μl를 추가합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 처리 된 혈액 튜브를 저장합니다. procedu 동안 젖은 얼음에 튜브를 유지다시 4 ℃에서 스핀. </li><li> 표준 혈청 화학 분석을 기준으로 혈액 샘플을 수집하는 혈청 분리기 튜브를 사용한다. 전체 혈구 수 (CBC)의 경우, 프로테아제 억제제없이 표준 K 2 EDTA를 사용합니다. 혈액 샘플 후 나누어지는 플라즈마 및 혈청에 사용 크리오 바이알 (cryovial)는 스핀 다운되었습니다. </li><li> 동물 식별, 날짜, 절차, 평가시기 및 샘플 볼륨 적절하게 혈액 튜브와 크리오 바이알 (cryovial) 레이블. 적절한 분석을위한 플라즈마의 분석 (들)와 크리오 바이알 (cryovial) 레이블. </li></ol></li><li> 생리 식염수 250 ml의 가방에 ml의 헤파린 1,000 USP 단위의 0.15 ml를 주입하여 헤파린 식염수 세척을 준비합니다. 0.06 mg의 헤파린 / ㎖의 용액을 얻었다. 샘플 사이에 세척을위한 식염수 잠금 장치에이 용액 60 ml의 - (40)을 그립니다. 각각 주입 전후 덱 스트로스 주입 포트 플러싱 별도의 주사기 내로 추가 1 mL 및 5 mL를 그린다. </li></ol> 2.동물 진정 및 준비 <ol><li> 동물의 케이지에서 절차 전에 더 이상 14 시간, 그리고 이하 18 시간 음식을 제거합니다. 참고 : 동물 혈당 값의 모든 식후 변화를 방지하기 위해 절차를 금식하는 것이 중요하다. 또한 마취 동안 역류 및 위 내용물의 흡인을 피하기 위해주의한다. </li><li> 전신 마취로 근육 주어진 케타민과 IVGTT 절차의 기간 동안 진정 동물, 10 ㎎ / ㎏에서. 절차를 수행하는 동안, 필요에 따라 30 분, 또는 - (20)의 간격으로 - (10 ㎎ / ㎏ 5) 추가 케타민을 관리 할 수 ​​있습니다. <ol><li> 진정 동물을 달아. 가열 과정 테이블에 옆으로 누운 위치에 동물을 배치합니다. </li><li> 동물 마취의 안정적인 비행기에 확인하기 위해 임상 매개 변수마다 15 ~ 20 분을 모니터링합니다. 맥박 산소 측정기와 - (200 BPM 100) 및 SPO 2 (&gt; 92 %) 심장 박동을 측정합니다. (- 50 호흡 / 분 20) w 호흡을 측정<html> 스톱워치 i 번째, 시각적 또는 십오초 이상 손으로 호흡을 계산하고 네 곱하여. 측정 온도 (&gt; 97 ° F) 직장. 잇몸과 입술 (습기, 핑크) 주위 점막의 색을 모니터합니다. </li></ol></li><li> 이 정맥 사이트를 준비합니다. 카테터가 삽입됩니다 관심의 영역에서 머리를 손질하고, 교류 클로르헥시딘의 스크럽 70 % 알코올로 전체 지역을 소독하기 위해 머리 가위를 사용합니다. <ol><li> 좌우 두부 또는 복재 정맥의 영역에 하나의 도관을 배치하고 삼방 스톱 콕 (mg의 헤파린 / ㎖ 0.06) 헤파린 염수 플러시에 첨부. 이 샘플링 혈액 무승부 사이트입니다. </li><li> 다른 다리의 두 번째 카테터를 배치하거나 두부 또는 복재 정맥의 영역에서 팔과 포트를 연결합니다. 덱 스트로스 주입이 사이트를 사용합니다. 이전 포도당 주입에 캐 뉼러의 특허를 유지하기 위해, 작은 헤파린 생리 식염수 1 ml의 높이를 사용합니다. </li></ol></li></ol>e_title &quot;&gt; 3. IVGTT 절차 참고 : IVGTT 절차는 8 혈액 그리기 샘플링 시간 포인트 (표 1)로 구성되어 있습니다. <ol><li> 기준 샘플을 채취하고, 공복 혈당치를 측정하는 휴대용 혈당 측정기를 사용한다. 동물의 전반적인 상태를 평가하기 위하여 CBC 표준 화학 분석을 위해 혈청 시료뿐만 아니라 전체 혈액 샘플을 얻었다. 제조자의 지시 8,9 당 원숭이 사용하기 위해 검증 키트를 사용하여 기준 샘플로부터 포도당 및 인슐린 수준을 분석하기 위해 혈장 샘플을 수집한다. 참고 : 이전에 정맥의 죽은 공간에 잔류 혈액 또는 헤파린을 제거하기 위해 혈액 수집에 대한 모든 샘플을 복용 정맥에서 가져온 0.5 ML의 사전 무승부를하는 것이 중요합니다. </li><li> 기준 샘플을 획득 한 후, 덱 스트로스 주입 포트에 30 초 이상 50 % 덱스 트 로즈 (250 ㎎ / ㎏)의 투여 량을 주입. 주 : 고용량 모델 (500 ㎎ / ㎏)을 사용할 수있다비록 용량은 길이 비교를 위해 절차를 통해 고정한다. <ol><li> 포트에 남아있는 포도당이 없다는 것을 확인하기 위해 헤파린 생리 식염수 5 mL를 주입 포트를 세척합니다. 주입의 끝은 T0입니다. 주입에서 잔류 포도당 이후의 혈액 샘플을 오염시킬 수 있으므로 기술자, 장갑을 교체해야합니다. </li></ol></li><li> 제 사후 주입 샘플 시각은 T5 분 T7 최소, T10 분 T15 분 T20 분 뒤에 덱 스트로스 주입의 끝에서, T3의 분으로하고, 마지막 샘플 시점은 T30의 분이다. 기준 샘플 분석 혈당 및 인슐린 수준을 각각 평가시기로부터 플라즈마를 수집한다 (단계 3.1 참조). <ol><li> 시점 T3의 분에서 다시 혈당을 검사 휴대용 혈당 측정기를 사용한다. 참고 :베이스 라인에서의 혈당 측정기 측정 값과 T3는 포도당의 주입을 확인하기 만하다. 시점 T3의 분에서의 혈당치는 ~ 100 밀리그램 / DL 높은 CO되어야기준선 공복 혈당 수준 mpared. </li></ol></li></ol> 4. 동물 복구 및 샘플 처리 <ol><li> 캐 뉼러를 제거하고 시간 소수점 분 T30 후 지혈 용 카테터 사이트에 압력을 적용합니다. 이 의식을 회복하고 앉아 때까지 동물을 모니터링합니다. 동물 한 번 제공 피드는 완전히 회복된다. </li><li> 즉시 얼음에 K 2 EDTA 튜브에 각각 전체 혈액 샘플을 배치합니다. 컬렉션을 10 분 동안 4 ℃에서 3000 rpm으로 원심 분리한다. 분석 할 때까지 -80 ° C에서 크리오 바이알 (cryovial), 동결 및 저장소로 나누어지는 플라즈마 샘플. <ol><li> 표준 혈청 화학 분석을위한 혈청 튜브에 혈액이없는 이하에서 20 분 및 RT에서 3000 rpm으로 원심 분리 전에없이 30 분 동안 실온에서 방치시키고. 컬렉션의 48 시간 내에 분석 할 때까지 혈청 샘플을 고정. 참고로서까지 CBC 분석을 위해 수집 냉장 전혈 시료컬렉션의 24 시간 내에 사예드. </li></ol></li></ol> 5. 데이터 처리 <ol><li> 플라즈마 인슐린과 혈당 곡선을 설정 한 후,베이스 (16), (17) 상기 글루코스 값의 자연 로그의 기울기로부터 글루코오스 제거율 K를 결정한다. 참고 : 건강한 NHP는 건강한 동물은 종종 30 분 이내에 기준 혈당 값으로 돌아갑니다으로, 종종 더 큰 2보다 더 잘 1 위의 포도당 통관 율 K를 가질 것으로 예상 할 수있다. 인슐린 생산이 내려 바와 같이, 포도당 통관 율 K가 1 이하로 떨어지는, 더 크게 떨어질 것이다. </li><li> T30 (16) (17)를 통해 시간 - 포인트 사이의 각 선분의 곡선 아래의 영역을 나타내는 사다리꼴의 면적의 합계의 합계로서 전체로서 AUC를 계산한다. 참고 : 전통적으로, 절차의 처음 10 분 AUC가 acut이 고려된다절차의 마지막 20 분에서 AUC 후반 인슐린 반응 (LIR)로 간주되는 동안 인슐린 반응 예는 (공기) 포도당. 동물이 더 dysmetabolic 해짐에 따라, 인슐린 AUC는 인슐린 무감각 증가에 대한 보상을 반영 증가 할 것이다. 현성 당뇨병 동물 트랜지션 그러나, AUC는 AIR 의해 캡쳐 급성 인슐린 위상 종종 처음에는 감소한다. </li></ol>

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저자는 대사 질환 분야에서 활약하는 계약 연구 기관 (크라운 바이오 사이언스)와 제휴하고 있습니다.

IVGTT은 상기 분석에서 공복 혈당 및 인슐린 수준이 달성된다. 체중 5, 12, 13에 기초하여 단일 덱 스트로스 주입 글루코스 자극 인슐린 분비의 능력을 평가하고, 그 동물의 능력을 평가하는 허용 인슐린을 해제하고베이스 라인쪽으로 높은 혈당 수준을 반환합니다. 이는 정상적인 글루코스와 인슐린 수준, 건강 관리, 정상 혈당와 dysmetabolic 혈증 동물 또는 고혈당, 인슐린 저항성 당뇨병 동물?...

IVGTT 일상적 다른 대사 상태 5에서 7 인간의 β 세포 기능을 결정하기 위해 사용되는 편리한 기능적 분석이다. T2D 동물 모델에서, 잘에서 대사 질환 진행을 보여 동물을 특성화하기위한 도구로서 인식되고 dysmetabolic 고혈당 상태 8, 9 건강한. T2D의 가장 가까운 동물 모델은 붉은 털과 노몰 거스 원숭이가 주목할만한 예입니다있는 인간이 아닌 영장류 (NHPs)에서 증명된다. 이러한 동물은 자연스럽게 인간 10과 나이 및 빈도에 기여 비만과 같은 위험 인자 T2D을 개발한다. 또한,이 유사한 질병의 진행은하고 dysmetabolic 질환 11 진행됨에 따라 췌장 병리은 아밀로이드 침착을 표시합니다. 여기에서 우리는이 동물의 대사 상태의 우리의 식민지 특성화의 일환으로 NHPs에 IVGTT을 수행하는 우리의 표준 방법에보고한다. 이 방법은소비 다른, 더 많은 시간과 비용이 많이 드는 기술 2를 기준으로 수행하기 쉬운. IVGTT 신속하고 자주 동물의 많은 식민지를 특성화하는 데 유용합니다. 당화 혈색소 (당화 혈색소)의 수준을 고려하면, 동물의 다이어트 및 음식 섭취 이력뿐만 아니라 %의 근육량과 체지방은 IVGTT 일반적 현성 당뇨병 6 향해 동물의 대사 상태와 진행 특성화 충분 8. 당화 혈색소는 3 개월 이전 6 주 동안 혈당 측정의 신뢰성을 제공하는 적혈구의 수명 동안의 평균 혈당 수준을 나타낸다. IVGTT의 금식 기준선 혈액 샘플에서 측정했을 때,이 값은 절차 사이의 개월 동안의 혈당 조절에 창을 제공합니다. 동물이 그들의 마지막 IVGTT 때문에 당뇨병에 dysmetabolic에서 전환 한 경우, 이전 값보다 훨씬 더 높은 혈색소 값을 나타냅니다전환이 빨리 시작하는 것이 그들의 마지막 IVGTT 후, 반면, 가까운 이전 값으로 당화 혈색소 값은 최근 전환 된 것을 나타냅니다. 일반적으로, 붉은 털 원숭이에, 당화 혈색소가 6 %가 가난한 혈당 조절 10, 23 비정상으로 간주하고, 표시되어 더 이상 값. 혈당 수준은 전체 동물의 행동 및 일반적인 건강의 컨텍스트 내에서 해석되어야한다. 당뇨병 원숭이 - 전시 과식증, 갈증과 다뇨증 - 인간 등을들 수있다. 동물의 그룹 하우징은 dysmetabolic 당뇨병 원숭이에 필요한 이러한 지표와 개별 치료의 측정에 상당한 도전을 제공합니다. 우리는 단독 치료보다 개인화를 제공 할 수 있도록하기 위하여 동물을 선택할 것을 권장하고 쉽게 원숭이의 상태의 마커 행동 8 모니터링 될 수있다. 또한, 당뇨병 원숭이 체중 감소뿐만 아니라 증가 된 상승 된 지질 프로파일 (나타낼 것이다콜레스테롤, 중성 지방 혈증) 및 혈청 화학 방해 미네랄 대사. 이러한 장기에 손상이 대사 장애 / 당뇨병 발전의 합병증은 종종 있으며, 혈당, 지질, 미네랄 불균형 9, 11, 18의 공동 결정 할 수있다, 24로는, 간, 혈청 화학 신장 기능의 지표를 측정하는 것이 중요하다 . 이 방법을 사용하면 원숭이의 수명이 특정 가치가 위에, 역사적인 값은 여러 자주 특성화에서 생성 된. 이러한 글루코스 클램프 또는 등급 글루코스 주입 (GGI)와 같은 또 다른 과정은 완전 동물의 상태를 평가하는 데 필요한 경우 역사를 사용할 때, 초기 특성에 일반적이다. 3 개월마다의 주파수의 기준이 설정되고 나면 그러나, 반복 IVGTTs는 동물의 진행 상황을 추적하기 위해 일반적으로 충분하다. 동물이 전반에 걸쳐 여러 연구에 등록되어있는 경우에 특히 중요하다연도는 신진 대사 상태에 따라. 건강 한번에 동안 비교적 안정적으로 유지 될 수있는 반면, 동물의 대사 상태가 악화되면, 인슐린 내성 및 글루코스 불내성의 극적인 증가는 매우 급속하게 일어날 수있다. 혈색소 값 석 달 간격 예정된 절차와 동물의 건강 상태의 감소 또는 개선의 일부 보간 허용한다. 이러한 이유로,이 방법은 자연 수명에 걸쳐 여러 종의 연구에 사용되는 동물의 특성에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-15R Centrifuge</td><td></td><td></td><td>plasma: 4 &amp;#176;C at 3,000 rpm for 10 min</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R Centrifuge</td><td></td><td></td><td>serum: 22 &amp;#176;C at 3,000 rpm for 10 min</td></tr><tr><td>Thermo Scientific -86 &amp;#176;C Freezer, Forma 88000 Series</td><td></td><td>Model: 88500A</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose 50% (D50)</td><td>Webster</td><td>07-8008986</td><td>I.V. glucose infusate</td></tr><tr><td>3 ml Luer Lock Syringe</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td></td><td>serial blood draws</td></tr><tr><td>5 ml Luer Lock Syringe</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td></td><td>heparinized saline flush</td></tr><tr><td>10 ml Luer Lock Syringe</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td></td><td>delivery of I.V. D50</td></tr><tr><td>Gauze sponges 2 x 2</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td>366.23000.4</td><td>Used Dry, w/ 70% Alcohol, and 2% Chlorohex Solution</td></tr><tr><td>4 ml serum separator tubes&amp;nbsp;</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>366.45000.4</td><td>blood collection tube for superchem panel</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA, 2 ml</td><td>VWR</td><td>95057-239</td><td>blood collection tubes</td></tr><tr><td>Aprotinin, 100 mg</td><td>Sigma</td><td>A1153-100MG</td><td>blood collection tube protease additive</td></tr><tr><td>22 G x 1&quot; Catheters</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td>193.75250.2</td><td>I.V. catheter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection Plug W/ Cap</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td>001.11500.2</td><td>%50 dextrose infusion port</td></tr><tr><td>Porus Tape, 1/2&quot; x 10 yd</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td>001.85000.2</td><td>maintain adherance of catheters and hep. Locks</td></tr><tr><td>Chlorhexidine Solution 2%</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td>193.08855.3</td><td>prep catheter site</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>VWR</td><td>71001-654</td><td>prep catheter site</td></tr><tr><td>tourniquet</td><td>Webster</td><td>07-8003432</td><td></td></tr><tr><td>3-way stopcock</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>366.28510.4</td><td>hep. lock</td></tr><tr><td>37&quot; extension set</td><td>Webster</td><td>07-8454200</td><td>hep. lock</td></tr><tr><td>Exel 50-60cc LL Syringes</td><td>Midwest Veterinary Suppy</td><td>001.12250.2</td><td>Heparinized saline flush</td></tr><tr><td>250 ml bag 0.9% saline</td><td>Webster</td><td>07-8365593</td><td>flush</td></tr><tr><td>1,000 U Heparin, 10 ml</td><td>Webster</td><td>07-883-4916</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Ketaset) 100&amp;nbsp;mg/ml</td><td>Fort Dodge</td><td>(AV ordered)</td><td></td></tr><tr><td>Precision Xtra glucose test strips 50/bx</td><td>Abbott (American Diabetes Wholesale)</td><td>9381599728K7</td><td>test baseline/T3 blood glucose levels</td></tr><tr><td>Masimo Rad 57</td><td>DRE</td><td>6052057V</td><td>pulse-oximeter</td></tr><tr><td>Pavia rectal thermometer</td><td>Patterson</td><td>07-8391335</td><td></td></tr><tr><td>Precision Xtra Glucometer</td><td>Abbott</td><td>9381599728K7</td><td>Handheld glucometer</td></tr></tbody></table>

characterization of metabolic status in nonhuman primates with the intravenous glucose tolerance test

정맥 내 글루코스 내성 시험 (IVGTT)은 글루코스 항상성의 특성에 중요한 역할을한다. 혈청 생화학 프로파일 모두 공급의 혈당치를 포함한 금식 상태, 혈색소, 인슐린 수치, 다이어트의 병력, 신체 조성 및 체중 상태, 정상 및 비정상 혈당 조절에 대한 평가와 함께 할 때 만들어 질 수있다 . IVGTT의 해석은 덱 스트로스 도전과 관련하여 시간이 지남에 포도당과 인슐린 수치의 변화 측정을 통해 이루어집니다. 고려해야 할 중요한 요소는 다음과 같습니다 T0 (포도당 주입의 끝), 처음 20 분에 빠른 포도당 통관의 기울기에서 파생 된 포도당 통관 율 K (T20에 T1), 시간과 관련하여 도달 피크 포도당과 인슐린 수준 포도당 기본으로 돌아가려면, 곡선 (AUC) 아래의 면적은.이 IVGTT 대책은 건강한 t에서 포도당 항상성 이동 등의 특성 변화를 보여줍니다OA 병에 걸린 대사 상태 5. 여기에서 우리는에서 인간 형 당뇨병 (T2D)의 가장 적절한 동물 모델과 IVGTT 이러한 동물의 임상 적 프로파일은 인간이 아닌 영장류 (히말라야와 시노 몰 거스 원숭이)의 특성을 설명하는 비만 dysmetabolic에 건강한 린, T2D와 상태 8, 10, 11.

도 1에 나타낸 결과는 30 분 IVGTT에 걸쳐 성숙 건강 및 당뇨병 사이 노몰 거스 원숭이에서 전형적인 포도당 및 인슐린 곡선 실증한다. 건강하고 고급 당뇨병 원숭이의 데이터는 신진 대사 특성의 범위의 양 극단에서 동물 사이의 명백한 차이점을 대비하기 위해 표시됩니다. 이 IVGTT 프로토콜은 비슷한 결과와 붉은 털 원숭이의 저자에 의해 성공적으로 사용되어?...

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Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

이 프로토콜의 목적은 인간이 아닌 영장류에서의 혈당 조절을 평가하고 dysmetabolic 건강한에서 대사 상태를 평가하기 위해 정맥 내 글루코스 내성 시험 (IVGTTs)를 수행하기위한 표준 방법을 제공하는 것이다.

정맥 당부 하 검사와 비인간 영장류의 대사 상태의 특성

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K 조회수.  Crown Bioscience.  이 프로토콜의 목적은 인간이 아닌 영장류에서의 혈당 조절을 평가하고 dysmetabolic 건강한에서 대사 상태를 평가하기 위해 정맥 내 글루코스 내성 시험 (IVGTTs)를 수행하기위한 표준 방법을 제공하는 것이다. 

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Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

의식 억제 마우스에 인슈린 과다 - euglycemic 클램프

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

연구

의학

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate the measurement of islet oxygen consumption using a 96-well microplate designed for the measurement of oxygen consumption in spheroids. In this assay, spheroid microplates are coated with a cell and tissue adhesive on the day prior to the assay. We utilize a small volume of adhesive solution to encourage islet adherence to only the bottom of the well. On the day of the assay, 15 islets are loaded directly into the base of each well using a technique that ensures optimal positioning of islets and accurate measurement of oxygen consumption. Various aspects of mitochondrial respiration are probed pharmacologically in non-human primate islets, including ATP-dependent respiration, maximal respiration, and proton leak. This method allows for consistent, reproducible results using only a small number of islets per well. It can theoretically be applied to any cultured spheroids of similar size.

This protocol demonstrates the accurate and reproducible measurement of oxygen consumption in non-human primate pancreatic islets. The islet loading techniques and coating of the microplate provide a framework for efficient measurement of respiration in other types of cultured spheroids.

비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

발생학

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

복 포도 당 내성 검사, 폐 기능 측정 및 폐의 고정 비만 및 장애인된 대사 폐 결과에 미치는 영향 연구

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

면역학 및 감염병학

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

높은 지방 다이어트를 먹이 쥐 경구 포도 당 내성 검사 (OGTT)과 인슐린 내성 검사 (ITT)를 사용 하 여 포도 당 대사 Vivo에서 의 연구

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

신체 구성 및 높은 지방 연 준 쥐에서 대사 배우면 분석

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Acclimation Prior to an Intraperitoneal Insulin Tolerance Test to Mitigate Stress-Induced Hyperglycemia in Conscious Mice

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that involves measurement of blood glucose levels over time following a single intraperitoneal injection of insulin. Given that it is performed in the conscious state and blood is often collected via a tail snip, it has the potential to elicit a stress response from animals due to anxiety associated with handling and blood collection. As such, a stress-induced rise in blood glucose can occur, making it difficult to detect and interpret the primary endpoint measure, namely an insulin-mediated reduction in blood glucose. This has been seen in many mouse strains, and is quite common in diabetic db/db mice, where glucose levels can increase, rather than decrease, after insulin administration. Here, we describe a method of acclimating mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test. We find that this lowers stress-induced hyperglycemia and results in data that more accurately reflects whole body insulin sensitivity.

Stress-induced elevations in glucose levels can confound interpretation of data derived from a conscious intraperitoneal insulin tolerance test in mice. In this article, we describe a method to acclimate the mice to handling, injections and blood sampling prior to performing the insulin tolerance test in order to limit stress-induced hyperglycemia.

The insulin tolerance test is commonly used in metabolic studies to assess whole body insulin sensitivity in rodents. It is a relatively simple test that ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

포도당 섭취량 측정 및 인슐린 자극에 대한 반응<em&gt; In Vitro</em&gt; 배양 된 사람의 주요 근육 세포

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

생물학

Using a Combination of Indirect Calorimetry, Infrared Thermography, and Blood Glucose Levels to Measure Brown Adipose Tissue Thermogenesis in Humans

In mammals, brown adipose tissue (BAT) is activated rapidly in response to cold in order to maintain body temperature. Although BAT has been studied greatly in small animals, it is difficult to measure the activity of BAT in humans. Therefore, little is known about the heat-generating capacity and physiological significance of BAT in humans, including the degree to which components of the diet can activate BAT. This is due to the limitations in the currently most used method to assess the activation of BAT-radiolabeled glucose (fluorodeoxyglucose or 18FDG) measured by positron emission tomography-computerized tomography (PET-CT).
This method is usually performed in fasted subjects, as feeding induces glucose uptake by the muscles, which can mask the glucose uptake into the BAT. This paper describes a detailed protocol for quantifying total-body human energy expenditure and substrate utilization from BAT thermogenesis by combining indirect calorimetry, infrared thermography, and blood glucose monitoring in carbohydrate-loaded adult males. To characterize the physiological significance of BAT, measures of the impact of BAT activity on human health are critical. We demonstrate a protocol to achieve this by combining carbohydrate loading and indirect calorimetry with measurements of supraclavicular changes in temperature. This novel approach will help to understand the physiology and pharmacology of BAT thermogenesis in humans.

Here, we present a protocol to quantify the physiological significance of the impact of brown adipose tissue (BAT) activity on human metabolism. This is achieved by combining carbohydrate loading and indirect calorimetry with measurements of supraclavicular changes in temperature. This novel approach can help develop a pharmacological target for BAT thermogenesis in humans.

간접 열량계, 적외선 체온 측정 및 혈당 수치의 조합을 사용하여 인간의 갈색 지방 조직 열 발생을 측정합니다.

In mammals, brown adipose tissue (BAT) is activated rapidly in response to cold in order to maintain body temperature. Although BAT has been studied ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract metabolic abnormalities. So far, different types of IF models with varying durations of fasting and feeding periods have been documented. However, interpreting the outcomes is challenging, as many of these models involve multifactorial contributions from both time- and calorie-restriction strategies. For example, the alternate day fasting model, often used as a rodent IF regimen, can result in underfeeding, suggesting that health benefits from this intervention are likely mediated via both caloric restriction and fasting-refeeding cycles. Recently, it has been successfully demonstrated that 2:1 IF, comprising 1 day of fasting followed by 2 days of feeding, can provide protection against diet-induced obesity and metabolic improvements without a reduction in overall caloric intake. Presented here is a protocol of this isocaloric 2:1 IF intervention in mice. Also described is a pair-feeding (PF) protocol required to examine a mouse model with altered eating behaviors, such as hyperphagia. Using the 2:1 IF regimen, it is demonstrated that isocaloric IF leads to reduced body weight gain, improved glucose homeostasis, and elevated energy expenditure. Thus, this regimen may be useful to investigate the health impacts of IF on various disease conditions.

The current article describes a detailed protocol for isocaloric 2:1 intermittent fasting to protect and treat against obesity and impaired glucose metabolism in wild-type and ob/ob mice.

쥐에서 등칼로리 2:1 간헐적 단식의 대사 효과의 평가

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...