이 방법은 비인간 영장류 및 인간과 같은 관련 종으로부터 소수의 섬으로부터 산소 소비를 정량화하여 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게 합니다. 이 기술은 소수의 기본 섬으로 수행될 수 있으며, 기술적 복제를 증가시키고, 여러 조건의 테스트를 허용하며, 분석의 엄격함과 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 이 기술은 미토콘드리아 건강을 평가, 종종 당뇨병에서 손상되고 성공적인 축전 이식의 중요한 예측인 아슬레 기능 및 인슐린 분비의 주요 결산.
섬이 전송 후 우물의 중앙에 국한되어 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 그렇게 하지 않으면 일관되지 않은 산소 소비 측정이 발생합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 일하는 학부 생 발레리 리치아르디(Valerie Ricciardi)가 될 것입니다.
분석 전날, 세포 및 조직 접착제 200 마이크로리터를 0.1 의 연체 나트륨 중탄산염 용액의 2.8 밀리리터에 추가하고 96 개의 잘 스페로이드 마이크로 플레이트의 각 우물의 바닥에 결과 용액의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫 팁에서 기포가 제거되었는지 확인합니다. 모든 우물이 적재되면 플레이트를 섭씨 37도비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.
1시간 후, 멸균 환경 내에서 플레이트에서 세포 접착제 용액을 흡착하고 37도 의 400 마이크로리터로 각각 2회 세척합니다. 그런 다음 우물이 30~40분 동안 공기를 건조한 후 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있도록 플레이트를 덮습니다. 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 멸균 환경에서 센서 카트리지 패키지를 열고 내용물을 제거합니다.
센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트의 각 우물을 멸균 수의 200 마이크로리터로 채웁니다. 모든 우물이 적재되면 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 내리고 조립된 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 하룻밤 사이에 37°C의 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 분석 당일, 센서 카트리지 뚜껑을 제거하고 유틸리티 플레이트의 우물에서 물을 데수수있습니다.
각 웰에 200 밀리리터의 미리 조립된 교정기를 추가하고 센서 카트리지 뚜껑을 교체합니다. 그런 다음 센서 카트리지를 인큐베이터에 약 1시간 동안 다시 배치합니다. 이적을 위해 섬을 준비하려면, 손으로 약 100 % 순도에 조립 된 매체를 포함하는 60 15 밀리미터 세포 배양 접시로 섬을 선택합니다.
모든 섬이 수집되면, 조립된 배지175마이크로리터를 제조된 스페로이드 마이크로플레이트의 각 우물을 적재하고, 15마이크로리터로 설정된 P20 파이펫을 사용하여 세포 배양 접시로부터 15마이크로리터의 배지15개 섬으로 흡인한다. 섬섬을 스페로이드 마이크로 플레이트에 시드하려면 파이펫 팁을 우물 바닥으로 낮추고 팁을 거의 들어 올리고 약 5 마이크로리터의 중간 을 천천히 분배합니다. 섬섬을 우물에 적재하려면 섬이 파이펫 끝에 정착한 후 소량의 매체로 웰 센터 의 바닥 바로 위에 부드럽게 놓습니다.
모든 섬이 파이펫 팁을 남겼는지 확인하고, 때때로 현미경의 밑에 스페로이드 마이크로 플레이트를 확인하여 섬이 접시 의 바닥에 씨를 뿌리고 우물의 측면에 붙어 있지 않다는 것을 확인합니다. 모든 섬이 옮겨지면 마이크로플레이트를 섭씨 37도비이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 분석 절차를 시작하기 전에 센서 카트리지의 포트 A를 45 마이크로리터로 로드하고, 포트 B는 갓 준비된 10 마이크로몰라 FCCP 22마이크로리터를, 포트 C는 25마이크로몰라 로테네 AA를 새로 준비했다. 다음으로, 세포외 플럭스 분석기 분석기를 30분 기준선 호흡 기간, 42분 올리고마이신 측정 기간, 30분 FCCP 기간 및 30분 로테네 AA 기간에 대해 프로그래밍한다.
그런 다음 센서를 보정하고 마이크로 플레이트를 삽입하기 위해 화면의 지침에 따라 분석서를 실행합니다. 분석 판으로 섬 전달의 경우, 15개의 섬이 도시된 바와 같이 15개의 마이크로리터에서 흡량해야 한다. 이 기술은 각 마이크로 플레이트의 하단 중앙에 섬섬을 일관되게 배치하여 정확한 산소 소비 측정을 가능하게 합니다.
개별 우물의 산소 소비를 보여주는 이 대표적인 실험에서는, 우물은 산소 소비의 아주 낮은 기준수준 및 FCCP에 대한 반응의 거의 또는 전혀 결과로 제대로 로드되지 않았습니다. 이 실험에서, 우물의 대부분은 약물에 중요한 기준선 호흡 및 반응을 입증했습니다. 그러나, 두 개의 우물로테네론에 아무 응답도 전시, 약물이 제대로 우물로 출시 되지 않은 제안.
이 우물은 추가 분석에서 제외되었습니다. 여기서, 우물이 섬으로 제대로 로드되고 약물을 올바르게 주입한 성공적인 분석결과의 결과를 관찰할 수 있다. 분석 작업을 수행하기 전날 시약및 플레이트를 준비하여 섬이 고립되거나 수신된 직후에 사용할 수 있도록 하는 것이 유익하다.
분석에 이어, 섬은 단백질 또는 DNA 추출을 위해 회수되어 산소 소비 데이터를 정상화하거나 미토콘드리아 DNA 함량을 정량화할 수 있다. 일차 영장류 섬의 작은 숫자에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 기능은 단일 생물학적 복제에서 다중 약물 및 기타 조작의 테스트를 허용합니다. 1 차 영장류 섬으로 일하는 개인은 이러한 조직과 적절하고 안전한 취급에 훈련을해야합니다.
특히, 적절한 개인 보호 장비의 사용과 이러한 샘플의 적절한 폐기.
