이 작품은 그랜트 번호 EPS-0903795 국립 과학 재단 (National Science Foundation), NIH NIDCR R01 - DE019355 (MJY PI)​​, 그랜트 8P20 GM103444 (YM PI)에 의해 수여 아래 정부 지원에 의해 지원되었다.

알긴산 히드로 겔의 3 차원 Bioprinting에 대한 젤라틴 함유 기판 1. 준비 <ol><li> 고 함량의 감소와 연관된 가능성을 피하기 위해 Pataky 등 11에 의해 기술 된 칼슘 / 젤라틴 기재 방법에 따라 칼슘 / 젤라틴 기판을 준비한다. 칼슘 / 젤라틴 기판 방법은 아래에 나열되어 있습니다. <ol><li> 증류수에 염화칼슘에 탈수 (1.5 중량 %), 염화나트륨 (0.9 중량 %), 및 돼지 젤라틴 (2 중량 %)을 합하여 100 mM의 젤라틴 용액을 만들기 위해 2 분 동안 끓인다. </li></ol></li><li> 젤 O에 냉장고에 평평한 표면에, 100mm 표준 배양 접시에 젤라틴 / 칼슘 용액 5 ㎖를 붓고 심지어 표면에 코팅하기 위해 주변의 솔루션을 소용돌이, 장소 / N은 ​​(GEL 할 수 있도록 최소한 8 사용하기 전에 시간). </li><li> 젤라틴 / CaCl2를 용액에 산화 티탄 (0.3 중량 %)를 추가하고, 기판 표면의 불투명도를 증가. 10 분 동안 교반한다. AUT그것을 살균 30 분 동안 액체 사이클에 젤라틴 / 이산화 티탄 용액을 oclave. <ol><li> 이전에 조제한 젤라틴 판의 표면에 젤라틴 / 이산화 티탄 용액 3 ㎖를 추가한다. 이 고르게 표면에 분산되어 있는지 확인하기 위해 혼합물을 소용돌이. 4 ° C 냉장고 O에 젤을 허용 / N (사용하기 전에 적어도 8 시간 겔 할 수 있습니다). 기판 3 일 이내에 사용해야합니다. </li></ol></li></ol> 2. 알긴산 산화 <ol><li> 후술 Bouhadir 동부 등 30에 의해 부분적으로 산화 알긴산 방법 다음 소듐 알지네이트 bioink 산화. <ol><li> 5 % 산화 알지네이트 용액을 증류수 100ml에 알긴산 나트륨 1g을 용해. 5 %의 산화 용액을 제조, 요오드 산 나트륨 수용액 (0.25 M, 0.25 밀리몰), 산화제를 추가한다. 실온에서 19 시간 동안 교반한다. REA을 종료 24 시간 후, 용액에 40 ml의 에틸렌 글리콜을 추가ction의. </li><li> 용액에 염화나트륨 2.5 g을 용해. 산화 된 알기 네이트를 침전 (1 비율 2) 에틸 알코올 과량을 추가. 침전물을 수집하기 위해 1,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기 및 증류수을 다시 녹인다. 에탄올 세척을 반복합니다. </li><li> 동결 건조는 사용 전까지 -20 ° C에서 산화 알긴산 펠릿 저장합니다. </li></ol></li><li> 나트륨의 비율을 측정함으로써, 산화의 정도를 확인 에틸렌 글리콜에 의해 종료되기 전에 소비 요오. <ol><li> 요오드화 칼륨 용액 (V / w 20 %, pH가 7.0 인산 나트륨 완충액)과 thyodene 용액 (V / w, 10 %, pH가 7.0 인산 나트륨 완충액)을 준비한다. 실온에서 산화 알긴산과 두 개의 솔루션을 섞는다. </li><li> 서서히 요오드화 칼륨과 theodyne 용액을 반응 혼합물에 알긴산 나트륨과 요오드 용액을 드롭. 분광 광도계로 426 nm에서 혼합물의 흡광도를 측정한다. 이 도달하면최대, V 1과 알긴산 나트륨과 요오드 용액의 부피 이용을 기록한다. </li><li> 반응은 <img alt="식 (1)" fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" /> . 반응 요오드 산 나트륨의 양은 <img alt="식 1.5" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" /></li><li> 나트륨의 양은 요오드 섭취를 결정하기 위해 원래의 농도에서 반응과 요오드 산 나트륨의 양을 뺀다. 이전의 공식을 사용하여, 아르 긴산의 최종 산화 정도를 결정한다. </li></ol></li></ol> 3. 알긴산 펩타이드 활용 <ol><li> 세포 부착 및 확산을 촉진하기 위해 아래에 설명 로리 등 (31)에 의해 RGD-알긴산 활용 방법을 수행하여 이전에 제조 된 산화 알긴산에 노출 된 아르기닌 - 글리신 - 아스 파르 테이트 시퀀스 (펩타이드)와 복합체 리간드. </li><li> 수성 carbod를 사용하여G 4 RGDSPto 접합체 (31)와 iimide 화학. </li><li> 0.1 M 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 5 % 산화 알긴산 1g을 용해 (MES) 완충액 (pH는 4 = 1- 에틸 - (디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드 (EDC, 0.54 밀리몰)를 첨가하고, N- 히드 록시 2에서 NHS, 0.27 밀리몰) : 1 비율 아미드 중간체를 형성한다. </li><li> 터미널 아민 통해 알기 네이트 중합체의 백본에 0.28 밀리몰 펩타이드, 커플 링을 추가합니다. RT O / N에서 저어. </li><li> 용액에 2.5 g의 염화나트륨을 첨가하여 커플 링 반응을 정지. 산화 된 알기 네이트를 침전 (1 비율 2) 에틸 알코올 과량을 추가. 침전물을 수집하기 위해 5 분 동안 4,000 XG에서 혼합물을 원심 분리기. 세포 배양 후드에서 미디어 대기음 증류수에 침전을 재용. 에탄올 세척을 반복합니다. </li><li> 이 완전히 건조 될 때까지 (흰색 가루 물질로 나타납니다) 침전물을 건조 동결하고 나중에 C 냉장고 °에서 -20 저장사용합니다. </li></ol> 4. 인간 지방 조직의 기질 세포 (hADSC의) 세포 배양 <ol><li> 배양 인간 지방 조직의 간질 세포 (hADSC의) 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 %의 글루타민, 및 1 % antimycin 15 ml의 낮은 글루코스 DMEM 덮여 세포 배양 플라스크 (T75 플라스크) 처리 75cm에서. 그들은 포화 상태 (80~90%)에 도달 할 때까지 매 2 일 세포 배양 후드에서, 미디어를 변경합니다. </li><li> 합류 후에 세포 배양 후드 T75 플라스크를 전송하고 hADSC 이제 트립신 효소 절단 방법을 사용하여 정지. <ol><li> 후드, 셀 오프 세포 배양 배지를 모두 대기음. 칼슘과 마그네슘 (DPBS ++)와 둘 베코 인산염 완충 식염수 5 ㎖로 씻어. 세포 떨어져 DPBS ++를 대기음. </li><li> 후드에있는 동안, 1 ml의 트립신 4 ml의 DPBS ++를 혼합하여 트립신과 DPBS ++의 솔루션을합니다. 각 플라스크 오디오 솔루션을 5 mL를 필요이온 그래서 합류 플라스크의 수에 해당하는 부피를. 각 플라스크에 트립신 / DPBS ++ 5 mL를 추가하고 2 분 동안 인큐베이터에 넣어. </li><li> 2 분 후, 플라스크를 제거하고 가볍게 바닥에서 세포를 풀어 그들의 측면을 누릅니다. 세포가 일시 중단됩니다 확인하기 위해 현미경으로 각 플라스크 봐. 다시 세포 배양 후드에서 플라스크를 배치하고, 각 플라스크에 적당한 세포 배양액 3 ㎖를 추가한다. 이 트립신 반응을 종료합니다. </li><li> 각 플라스크에서 세포 함유 미디어를 전송하고 50 ML 원뿔에 넣어. 5 분 동안 1,000 XG에서 그들을 원심 분리기. 세포는 원뿔의 바닥에 작은 흰색 펠렛으로 표시해야한다. 다시 세포 배양 후드에 전송하고 미디어를 대기음. 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 현미경을 이용하여 혈구 세포를 카운트. 세포가 계산되고 나면, 미디어 배양 후드에서, 분취 량은 1.3 ~ 만 달러를 포함N 세포와 15 ML 원뿔로 전송. 원심 1,000 x g에서 5 분 동안 다시 세포를 함유하는 15 ml의 원추형. </li><li> 배양 후드에서, 각각의 플라스크에 ~ 350,000 세포의 농도를 첨가 여러 T-75 플라스크에 남아있는 세포를 시드. DMEM 매체의 15 ML을 추가하고 다시 합류 할 때까지 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 원심 분리기 사이클이 완료되면, 세포 배양 물에 15 ml의 원추형을 반환. 세포 펠렛으로부터 미디어 대기음, 종종 용액을 terteriating, bioink의 밀리리터 당 130 만개의 세포 농도로 수성 알지네이트 용액에 세포를 재현 탁하여 그렇게 bioink 걸쳐 세포의 분포가 균일하다. 멸균 프린터 호환 3 ML의 주사기로 세포 함유 솔루션을로드하고 멸균 22 G 플라스틱 팁에 나사. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinter 설정 <ol><li> bioprinter, 디스펜서 각 컴퓨터 및 recirculat를 켭니다물 목욕을 보내고. <ol><li> 수동으로 겔화 메커니즘에 재순환 수조 온도를 설정합니다. </li><li> 수동으로 상관 디스펜서 컴퓨터의 각 디스펜서에 대한 인쇄 매개 변수를 설정합니다. 0 backsteps 230 NL, 수에 분배 볼륨을 설정하고 분배 비율은 -sec 10μL 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 설계 소프트웨어와 컴퓨터의 USB 카메라의 디스플레이를보기위한 프로그램을 연다. <ol><li> 소프트웨어를 사용하여 수동으로 방울 사이에 2.4 mm의 간격이 5 × 5 점 배열에 대한 좌표를 입력합니다. </li><li> 로 인쇄 매개 변수를 설정 선단과 기판 표면 사이의 거리 = 0.1 mm; 높이 주사기가 증언 사이에 상승 = 20mm; 당 증착 시간은 1 초 =. </li><li> 프로그램을 저장하고 로봇을 보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 4 ° C 프린터 무대에 젤라틴 / 이산화 티탄이 함유 배양 접시를 놓습니다. 닫고 챔버 문을 잠급니다. </li><li> INI하기 위해 PLC를 사용하여자외선 광원 tialize, 90 초 동안 살균 챔버. </li><li> 살균이 완료되면, 챔버를 열고 hADSC의 건에 알긴산 현탁 1. 근접 함유 주사기를로드 챔버 도어를 잠글. </li><li> 팬 시스템을 켜 평형 내부 압력이 30 초를 기다려야 PLC를 사용합니다. </li><li> 컴퓨터에서 기하학적 경로 및 인쇄 매개 변수를 포함하는 프로그램을 실행합니다. </li><li> 인쇄 프로세스를 통해, 정확하고 균일 한 인쇄를 확인하기 위해 컴퓨터에 USB 카메라의 디스플레이를 본다. </li><li> 인쇄가 완료되면, 구조는 40 분 동안 겔 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 세포 생존 능력 평가 <ol><li> 영상의 시간이 될 때까지 인큐베이터에서 즉시 DMEM에서 후 인쇄 및 저장을 이미지화 될 수 없습니다 구조를 커버. </li><li> 구조물의 생존율을 정량화하기 위해, 형광 기반 생존력 / 세포 독성 분석을 사용하여 염색공 초점 현미경을 사용하여 차의 이미지입니다. <ol><li> 키트 지시에 따라, 칼 세인 AM을 및에 티듐 호모 다이머 -1을 함유하는 염색 액을 준비한다. , 염색 액 10 ㎖을 에티 디움 호모 다이머-1의 20 μL와 칼 세인의 5 μl를 추가하려면 멸균 10 ㎖에 오전, 조직 배양 등급 둘 베코 인산염 완충 식염수 (+ 마그네슘 + 칼슘, DPBS ++). </li><li> 어둠 속에서 15 분 동안 염색 용액에 담가 bioprinted 구조. </li><li> 화상 일 0과 8에 공 초점 현미경 시스템을 사용하여 염색 된 구조는 300 ㎛의 깊이에 걸쳐 30 광학 슬라이스 Z 스택 파라미터를 이용하여, 각 bioprinted 구조체의 다수의 사진을 촬영하고, 직접 세포를 카운트. 세포가 노란색 표시 또는 빨간색 경우 녹색 그들로 살아 카운트, 그리고 만약 그들이 죽은 계산합니다. </li></ol></li><li> 구조체의 셀의 총 개수로 나눈 생균 수와 세포 생존 비율을 계산하게하고; 세포 생존 = 수살아있는 세포 (녹색 + 노란색) / 총 세포 수 (녹색 + 빨강 + 노랑) × 100 %. </li><li> 0 일에 세포 수로 나눈 8 일째의 세포 수와 같은 각각의 샘플에 대한 세포 증식의 양을 계산하게하고; 하루 8 / 살아있는 세포에 세포 증식이 = 라이브 세포 수는 일 0 X 100 %에 계산합니다. </li></ol> 7. RGD 펩타이드 활용 분석 <ol><li> 알긴산에 RGD 펩티드 결합의 성공을 분석, RGD 공역 알긴산 및 비공 알긴산과 비교. ( &#39;6 Diamidino -2- 페닐 인돌, 다이 하이드로 클로라이드 4)를 사용하여 (DAPI)와 팔로이 딘 얼룩을이, 이미지 인쇄 구조를 수행합니다. <ol><li> DPBS ++의 200 μL와 메탄올 원액의 5 μl를 희석하여 솔루션을 작업 phalloidins합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오. </li><li> (0.10509 G / L) / (350.3 g / 몰) = 3 × 10 -4 M = 0.0003 M = 0.300 밀리미터 = 300 μM : 방정식 다음 DAPI 얼룩의 300 μm의 주식 솔루션을 확인하십시오. 일을 확인E는 DAPI 원액을 희석 한 용액을 사용 : ++ DPBS 100 3 μM 용액을 얻었다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 완전히 4 % 파라 포름 알데히드에서 샘플 잠수함. 실온에서 1 시간 동안 품어. 이 솔루션은 5 분마다 세척 동안 앉아있게 DPBS ++로 3 회 세척 할 것. 그 과정에서 이상 젤을 내리고, 유리 슬라이드에 우물에서 젤 샘플을 전송합니다. 10 분 동안 0.1 % DPBS에서 트리톤 X-100 (0.1 g / 100 ㎖)에 ++ 겔 담가. 각각의 세척을 위해 5 분을 허용, DPBS ++로 3 회 세척 할 것. </li><li> 작동 용액에 침지시켜 그들을 팔로이 딘으로 인쇄 얼룩 구조. 호일로 덮고 4 시간 동안 품어. 팔로이 딘 얼룩을 제거하고 DPBS ++로 3 회 세척한다. 첫 번째 세척은 후자의 세척은 5 분마다 앉아야, 빠른해야합니다. </li><li> DAPI 작업 솔루션을 담금으로써 DAPI와 인쇄 구조를 얼룩. 호일로 덮고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 빨래각 세척을 허용 DPBS ++와 세 번, 5 분 동안 앉아있다. 공 초점 현미경 시스템에 샘플을 관찰하고 이미지입니다. </li></ol>

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V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Bioprinting+of+Tissues+and+Organs.">3D Bioprinting of Tissues and Organs.</a> Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Alginate+as+Bioink+for+Bioprinting.">Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting.</a> Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).</li><li>Forty, R. A., Steinberg, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+Scaffolds+for+Tissue+Engineering:+Progress+and+Challenges.">Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges.</a> Global Cardiology Science, &amp; Practice. 3 (38), 316-342 (2013).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three&#8211;Dimensional+BioAssembly+Tool+for+Generating+Viable+Tissue-Engineered+Constructs.">Three&#8211;Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs.</a> Tissue Engineering. 10 (9&#8211;10), 1566-1576 (2004).</li><li>Ozbolat, I. T., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+&#8216;Multi-arm+Bioprinter&#8217;+for+Hybrid+Fabrication+of+Tissue+Engineering+Constructs.">Development of a &#8216;Multi-arm Bioprinter&#8217; for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs.</a> Robotics and Computer&#8211;Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).</li><li>Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Bioprinting+of+Vascularized,+Heterogeneous+Cell&#8211;Laden+Tissue+Constructs.+Adv+Mater.+X.">Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell&#8211;Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X.</a> Adv Mater. X, x-y (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

조직 공학의 주요 초점은 복원 유지, 또는 기본 조직 능을 향상시킬 수있는 생물학적 대체품을 개발하여 장기 이식 부족과 요구 사이의 갭을 ​​연결한다. 이것은 내부 geometr을 통해 복잡한 해부학 적으로 정확한 외부 형상, 정밀 제어와 비계의 직접 제작하게되었다. 입체 bioprinting은 층별 approac를 이용한 디지털 모델의 다양한 크기와 형태의 입체 구조를 생성하기 위해 사용되는 방법이다. 입체 ...

조직 공학은, 유지, 복원 또는 기본 조직을 강화하고 기능 대체의 개발에 생물학 및 공학의 원리를 사용합니다. 조직 공학뿐만​​ 아니라 세포 기반 센서, 약물 / 독성 검사, 조직 또는 종양 모델 및 기타 과학 및 기술의 발전을 촉진 할 필요에 입체 생체 모방 형 구조를 생성하는 능력. 면밀히 세포 및 조직에서의 원시 세포 외 기질의 고도로 조직화 된 상호 작용을 모방해야하므로 조직 공학 구조물의 3 차원 조직의 제조 방법의 기본적인 구성 요소이다. 생분해 성 및 성형 가공 삼차원 지지체는 세포가 세포의 이차원 층을 형성하기 때문에 신규 이주 조직 구조를 생성하는 중요한 요인이 있지만 선호 입체에서 성장하는 능력이 부족하다. 지지체는 세포의 임시 토대가됩니다부착 및 증식, 그래서 제어 다공성 생분해 성, 그리고 충분한 기계적 integrit와 물질로 구성되어야한다. 지지체 물질은 세포 독성이거나 호스트로부터 부정적인 반응을 만들면 안됩니다. 하이드로 겔은 일반적으로 조직 공학 기술에 사용되어 왔으며, 그들의 친수성 ​​하이드로 겔은 structur 걸쳐 유체 및 가스 교환을 허용한다. 다른 하이드로 겔을 조합하여, 합성 하이드로 겔의 특성은 별개의 애플리케이션 요건을 충족시키는 수정 가능하다. 기존의 조직 공학 방법은 세포 후 FABRICATIO 파종되는 무 세포 다공성 희생 비계의 생성을 포함한다. 많은 기술들은 섬유 접합체, 주조 용매로서 사용하고, 용융 성형하지만, 조직 공학 응용을위한 최소한의 성공적인 것으로 입증되어왔다. 섬유 접합 방법은 섬유가 특정 형상으로 배열 될 수 있도록하지만, 이들은 프로 만 할 수있다매우 얇은 비계으로 줄. 용매 주조 방법은 다공성 구조를 생성하지만 큰 제조 막은 thic 만 3 mm였다. 따라서, 입체적인 구조물을 만드는 것은 이러한 기술을 이용하여 가능하지 않다. 용융 성형 기술은 삼차원 지지체의 제조에 성공 입증 있지만, 이러한 고온은 생물학적 물질 생산 사전 처리 중에 혼입 될 수없는 것이 요구된다. 지지체는 미리 정의 된 또는 가변 마이크로 및 3 차원 지지체를 제조하는 조직 공학의 요구 사항을 충족 할 수있는 능력에 제한이 후 제조 시드. 고체 지지체에 파종 기술과의 또 다른 주요 문제는 혈관과 가난한 기계의 부족이다. Bioprinting 이후 종래의 단점을 극복하는 비 독성, 생분해 성, 열 가역성 겔의 사용을 통해 입체적으로 확장되었다. 고체 프리폼 제조 t의 몇현재 사용중인 echniques 레이저를 이용한 bioprinting 및 잉크젯 인쇄입니다. 레이저를 이용한 bioprinting 기법 펄스 레이저 소스, 타겟 판과 입체감을 생성하는 수용 기판을 사용한다. 그러나,이 기술로 인해 낮은 스루풋, 낮은 세포 생존에 한정되고, 단지 광경 화성 프리폴리머는 가교 하이드로 겔을 형성하는데 사용될 수 있기 때문에, 제조 된 구조에만 한정 배열을 생성 할 수있다. 잉크젯 인쇄는 피코 리터의 잉크를 증착함으로써 기판 상에 디지털 화상 데이터를 재생 비접촉 방법으로 개발되었다. 그러나, 고해상도의 구조를 생성하지 않는 잉크젯 인쇄는, 경험 빠른 단백질 변성을 구성하고, 세포의 대부분은 증착 동안 용균. 현재, 새로운 첨가제 bioprinting 제조 방법이 개발되었다. 이러한 시스템에서 세포, 단백질, 성장 인자, 및 생체 모방 하이드로 겔은 일반적으로 매트릭스 메이터에 통합IALS 제조 공정 중에 동시에 밀접 고유의 미세 구조를 모방 한 입체 지지체 계 세포 함유 구조물을 생성하기 위해 컴퓨터 제어 액추에이터를 이용하여 증착. 세포 함유 하이드로 겔은 여러 세포 유형, 또는 균질 이루어진 이질적 일 수 bioink를 구성한다. 첨가제 제조 시스템 금고 bioink 드롭하여 놓기 X, Y, Z 방향으로 이동 가능한 컴퓨터 제어 또는 스테이지로 층별 일회용 주사기 팁 비아. 컴퓨터 소프트웨어를 통해, 인쇄 된 스캐 폴드의 구조가 용이하게 어플리케이션의 요구 사항에 따라 조작 될 수있다. 종래 기술과는 달리 입체 의료 기술 (자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영) 환자 별 구조를 생성, 디자인에 혼입 될 수있다. 작 제물은 더 높은 L로 제조되기 때문에 이러한 방법들은 또한 혈관 교체 제조 가능성을 허용OCAL 세포 밀도, 세포 - 세포 상호 작용을 허용하고 사후 주입 surviva의 가능성을 향상시킨다. 팔메 프린터 입체 이종 조직 구조 (도 1)를 생성하기 위해 프로그램 가능한 로봇 제조 방법을 사용하여 지정 구축 입체 멀티 디스펜서 시스템이다. 이 고유 조합의 복수의 재료의 사용은 이종 구조를 제조 할 수있다. bioprinter의 초기화는 당신이 bioprinted 구조의 인쇄 성을 최적화하기 위해 다양한 매개 변수를 설정할 수 있기 때문에 bioprinting에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. bioprinter은 사용자가 대화 형 터치 스크린 제어 패널을 통해 동작하는 프로그래머블 로직 컨트롤러 (PLC) (도 1)에 의해 제어되는 기동, 동작 및 종료 순서와 배치 식 공정을 포함한다. 생체의 오염을 방지하기 위해서논리 재료 bioprinter가 양으로 압력을 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 묶인 고효율 미립자 arrestance (HEPA)와 (PMMA) 챔버 공기 순환 시스템을 -filtered (도 1, B, C). 프린터 내부에는 내장 자외선 광원 (도 1, D)를 사용하여 멸균 할 수있다. bioprinter의 핵심 구성 요소는 재현성 10 마이크로 미터 (그림 1, E)의 정확도로 디스펜서 팁을 배치 할 수 있습니다 완전히 프로그램 위치 로봇입니다. 로터리 스크류를 사용하여 230 NL (그림 1, F)로 작은 볼륨을 입금 할 수있는 세 가지 디스펜서가 있습니다. 그들은 각각의 디스펜서에 대한 (그림 1, G)를 인쇄 매개 변수를 관리하는 별도의 컴퓨터를 사용하여 독립적으로 프로그래밍 할 수 있습니다. 회전 축 디스펜스 주사기 아래 팁 주사기 밖으로 이동 bioink 전동 스크류의 회전을 이용한다. 이 디스펜서는 pneumatical에 장착된다LY 제어 도구 네스트 (도 2A는, B), 로봇 제어 프로그램 (도 1, H) 하에서 Z 축 로보트 팔에 장착 된 디스펜서를 전환 할 수 있도록. XYZ 로봇 (그림 1, I)를 실행하는 컴퓨터 디자인 소프트웨어에서 인쇄 명령을받습니다. 각 프로그램은 분배 위치, 교정 루틴 및 디스펜서 변화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 각 디스펜서 물질을 증착 곳에 주로 XYZ로 구성되어 생성 된 구조의 디자인은 조정합니다. bioprinter는 XYZ이 시린지 선단의 좌표를 결정하는 두 개의 광학 광 센서 (도 2C)을 포함한다. 이 센서는 디스펜서 선단의 위치를​​ 계산하기 위해 다음을 사용하여 로봇에 좌표 정보를 보냅니다. ACCURA와의 거리를 측정하기 위해 30 × 100 마이크로 미터의 스폿 크기 633 nm의 적색 레이저 다이오드 빔을 투영 추가적인 변위 레이저 (도 2D)가 존재0.1 마이크로 미터의 CY. 빔이 고도로 집중되는 경우 로봇이 인쇄면의 Z 거리를 결정한다. 이 측정 및 Z의 선단의 광학 광 센서 측정은, 정확한 Z의 산출이 인쇄면에 대하여 팁 디스펜서를 배치하는 데 사용되는 좌표를 허용한다. 디스펜서 팁 Y 및 Z 센터를 찾는 X 축 배향 된 광학 광 센서를 통해 측 방향 및 수직으로 이동하고, 측 방향으로 Y 축 센서를 통해 X 축의 중심을 찾는. 표면이 분배 선단의 위치에 상대적인 위치를 결정할 CZ + = d만큼 도끼 + : 인쇄면은 XYZ 공간에서 평탄면에 대한 식을 사용하여 매핑된다. 프린터 단계 (그림 1, j)는 직경 80mm에 샘플 페트리 접시를 보유하고 설정 온도 (그림 1, K)를 유지하기 위해 재순환 수조를 사용합니다. 스테이지 온도는 -20의 범위로 설정하고 내에 안정적으로 유지 될 수있다. USB 카메라가 1 마운트Z 로봇 아암 상에 프린팅 공정 (도 1, L) 중에 분배 팁의 확대도를 제공한다. 프린팅 공정 (도 1, L) 중에 bioprinter의 완전한 뷰를 제공하는 챔버 내부의 상단을 향해 장착 번째 카메라가있다. 컴퓨터 지원 설계 드로잉 소프트웨어는 증착 패턴을 결정하고, 사용자가 점진적으로 이격 방울과 복잡한 구조 (도 3)를 생성하도록 허용한다. 세 가지 차원 경로를 수동으로 프린터와 호환되는 디자인 소프트웨어에 코딩 또는 별도의 컴퓨터 지원 설계 도면 소프트웨어 (그림 4, 표 1)에서 가져올 수 있습니다. 프린터 호환 소프트웨어 허용 같은 시린지 선단과 SUBST 사이 증착법 (단일 액적 증착 또는 연속적인 통로 증착) 경로의 입체 기하학, 증착 속도, 거리로 인쇄 파라미터 변동레이트 인쇄 표면, 개별 방울 및 높이를 증착하고 주사기를 가속화하는 시간은 방울의 증착 사이에 상승된다. 각 프로그램은 인쇄 중, 운영자의 개입없이, 무균 환경을 제공하기 위해 XYZ 분배 위치, 팁 교정 루틴 및 디스펜서 변화하는 프로토콜이 포함되어 있습니다. 로봇의 프로그램 가능한 논리 제어기 (PLC)를 설계 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터 명령어를 수신하고, 외부 컨트롤러의 이벤트의 타이밍 (예를 들면, 디스펜서)를 제어한다.이를 위해, PLC는 디스펜서를 제어하는 반복 기법을 사용 로봇 위치 결정 장치, 및 환경 요인. 회전 축, 액체 분배 시스템을 이용하여 입체적인 직접 기록 bioprinting보​​다 효율적 정확하고, 이전의 방법보다 쉬울에 셀을 증착하는 프로세스를 허용한다. 이 연구는 사용자 정의 내장 bioprinter는 CE를 생성 할 수 표시높은 세포 생존과 LL 함유 하이드로 겔 구축합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Positioning Robot (JR2000 XYZ)</td>
			<td>Janome&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Light Sensors:&#160;</td>
			<td>Keyensce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Displacement Laser: OD Mini</td>
			<td>SICK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Water Bath: Polystat</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-12122-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP</td>
			<td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td>
			<td>AD7013MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points</td>
			<td>Janome</td>
			<td></td>
			<td>Comes with purchase of Janome Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder</td>
			<td>RatioServ</td>
			<td></td>
			<td>Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer 3 cc Syringes:&#160;</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>122051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Dispenser Tips</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>Z520122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Dioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13462-67-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Mallinckrodt Baker, Inc</td>
			<td>9300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7790-28-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hADSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td>Store in vials in liquid nitrogen until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769&#160;</td>
			<td>10 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptides</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R37606</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability of bioprinted cellular constructs using a three dispenser cartesian printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

결과 bioprinter 정확하게 특정 입체 장소에서 세포를 함유 한 하이드로 겔 증착하고 일관 컴퓨터 지원 소프트웨어를 이용하여 입증 할 수있다. 이 소프트웨어는 각 방울의 위치를 확인하고 (그림 3,4) 분배에 대한 많은 매개 변수를 제어 할 수 있습니다. 적절하게 생체 물질을 증착하는 bioprinter의 반복은 조직 공학 응용 프로그램에서의 성공에 필수적입니다. 세포 ?...

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Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  Medical University of South Carolina. A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

연구

생체공학

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

일반 잉크젯 프린터를 사용하여 과도 세포막의 세공 만들기

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

심근 구조, 기능의 생체 양적 평가에서 관류 및 생존 능력은 심장 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하여

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &amp;#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

비 투명 공사장 공중 발판에 이미징 세포 생존 - 소설 니트 티타늄 임플란트의 예를 사용하여

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

운동 조건의 혈청을 이용한 인대 구조의 치료 : Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

오픈 소스, 저비용 바이오 잉크 및 식품 용융 압출 3D 프린터 설계

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...