Name: bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
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저자는 기꺼이 공간과 해군 전쟁 시스템 센터 태평양 (SSC PACIFIC) 계약 번호 N6601-13-C-2027에서 국방 위협 감소기구 (DTRA)에 의해 자금을 인정합니다. 이 자료의 공개는 본 연구 결과 나 결론 정부의 승인을 구성하지 않습니다.

1. 하이드로 겔 Bioink 제형 및 준비 <ol><li> 조직 특이 적 생화학 적 정보를 제공하기 이전에 상술 간 조직 특이 ECM 솔루션 다이제스트 준비하기 위해. 20 주 : 일반적으로, ECM 다이제스트 채용 최종 히드로 겔 bioink 용적의 40 %를 포함 할 것이다. ECM 다이제스트 솔루션의 수백 밀리리터가 준비 분주하고, 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 동결 할 수 있습니다. </li><li> 광개시제, 2- 히드 록시 -4 &#39;녹이고 하이드로 겔 제형에 앞서 - 0.1 %로 (2- 히드 록시에 톡시) -2- methylpropiophenone 물하여 W / V. 주 : 50-100 ml의 범위에서 볼륨이 미리 제조 될 수 있고, 몇 달 동안 4 ℃에서 차광 저장된다. </li><li> bioinks 하이드로 겔을 형성하기 위해, 우선 수분 광개시제 용액에 히알루 론산 (HA) 하이드로 겔 키트에서 기재 성분을 용해. <ol><li> 물 페이지에 별도로 HA 티올과 티올 젤라틴을 녹여hotoinitiator 솔루션 (단계 1.2) w / v 용액 2 %를 확인합니다. </li><li> 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)의 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 키트에 가교제를 용해. </li><li> 8 % w / V 수용액을 만들어 물 개시제 용액 (단계 1.2)에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8 아암 알킨 (10 kDa의 MW)을 녹인다. </li></ol></li><li> 추가 사용자가 가능하지만 일반적으로 다음과 같은 방식을 사용하여 하이드로 겔을 형성한다. <ol><li> 일반이 아닌 조직으로 2 %는 HA를 티올 4 부, 4 부 2 % 티올 젤라틴, 1 부 가교제 1, 1 부 가교제 2 8 부 조직의 ECM 솔루션 2 부 간세포 배양 배지 (HCM) (10 부품 물을 결합 - 특정 하이드로 겔). 주 : 추가 변성 HA 또는 젤라틴보다 원활 bioink 돌출을 첨가 할 수있다. 이것은 후술한다. </li></ol></li><li> 사용 전에 혼합 10 초 (10 명 중 속도 10) 고에 생성 된 혼합물을 소용돌이. &lt;/ 리&gt; <li> 하이드로 겔 bioink의 사용 <ol><li> 압출 또는 bioprinting 테스트에 대한 주사기 또는 프린터 카트리지 내로 혼합물을 전송하고, 37 ° C에서 30 분 (1 단계 가교)에 대해 자발적으로 가교 할 수있다. </li><li> 유변학 적 측정 들어 35mm 페트리 접시에 혼합물을 전송하고 30 분 동안 가교 결합 할 수있다. 참고 : 혼합물을 즉시 티올 - 아크릴 레이트 결합 형성을 통해 가교 시작하여 점도가 증가하기 시작합니다. 혼합물을 전송하는 동안 주사기 또는 피펫의 막힘을 방지하기 위해 10 분 내에 주사기 카트리지 또는 타겟 위치로 전송한다. </li><li> 이차 가교 (2 단계)가 요구되는 경우, 티올 알킨 중합 반응을 개시하는 단계를 자외선 (365 nm의, 18 W / cm 2) 1 가교 겔을 조사. 주 : 조사 시간은 물질의 표면적에 의존한다. 일반적으로 재료의 평방 센티미터는 1- 필요이 UV 전력에서 UV 노출이 초. </li></ol></li></ol> 2. 프린터 호환성 테스트 <ol><li> 표준 주사기와 작은 게이지 바늘 팁 (20 ~ 30 게이지)를 사용하여 간단한 압출 검사와 실험실 벤치에 bioprinting 장치, 테스트 압출 특성과의 통합 테스트에 앞서. <ol><li> 거의 또는 전혀 범프 하이드로 겔의 원활 압출 필라멘트를 달성하기 위해 표준 주사기를 통해 bioink을 누릅니다. 선이나 간단한 패턴으로 돌출하는 것은 성공을 결정하기에 충분하다. </li></ol></li><li> bioprinter 통합의 경우, 프린터 카트리지로 피펫 팅에 의해 준비를 bioink로드와 bioink 30 분 카트리지 내에서 자발적으로 1 단계 가교를받을 수 있습니다. 참고 bioink의 볼륨이 특정 어플리케이션에 따라 사용자에 의해 결정되어야한다. 프린터 카트리지는 유사하거나 bioprinter 장치와 호환되는 주사기 할 수있다. </li><li> 압출 호환성 평가bioink를 사용하여 간단한 패턴을 인쇄하여 bioprinting합니다. 예를 들어, 평행 한 라인으로 구성된 7 × 7mm 패턴을 출력한다. 압력 (예컨대, 20 kPa의 공기압)을 적용하는 동안 약 300mm / 분의 속도로 XY 평면에서의 헤드 이동한다. 다양한 크기의 프린트 헤드의 노즐 직경이 사용될 수 있지만, 400 ~ 500 μM 직경 개구부 원추형 노즐은 250-350 μm의 범위에서 회전 타원체 인쇄에 최적 참고. <ol><li> 압출 재료가 울퉁불퉁하거나 불규칙한 경우 2.4 단계 참조하거나 1 단계 가교 물질을 부드럽게 PEGDA의 양을 줄일 수 있습니다. 제대로 준비 bioink 제형은 원하는 패턴 또는 구조의 정확한 증착을 가능하게 매끄럽게 돌출. 장치의 각 유형에 대해 극적으로 같은 특정 인쇄 매개 변수로서 32 설명 사용 bioprinting 절차를 구체적으로 인쇄를 구성하는 조직을 위해 집에서 디자인 된 사용자 지정 3 차원 bioprinting 장치를 다양하고 testin 필요합니다. 참고사용자가 g. </li></ol></li><li> 압출 특성을 개선 bioinks에 수정되지 않은 HA 및 젤라틴을 보충하기 위해 (1.5 ㎎ / ㎖, 30 ㎎ / ㎖, 각각). </li></ol> 주 간를 구축과 Bioprinting 3. 검증 <ol><li> 세포 구성 요소 (33)로 드롭 방법을 매달아 3-D 일차 전지 간 타원체를 준비 참고 Bioprinting도 하이드로 겔 bioinks 현탁 개별 세포 타원체없이 수행 대신 할 수있다. 타원체가 세포 - 세포 상호 작용을 가속 기능을 구성하기 위해 여기에서 사용된다. 사용 타원체 또는 셀의 수는 특정 애플리케이션에 따라 사용자에 의해 결정되어야한다. 이러한 단계는 멸균 물품을 사용하여 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. <ol><li> 간세포의 기저 미디어 (HBM) 및 멸균 필터링에 HCM 보충 구성 요소 키트의 해동 내용을 추가하여 HCM을 준비합니다. <ol><li> 보충 구성 요소 유엔를 해동액체 참깨. </li><li> 황산 젠타 마이신 / 암포 테리 신 B, 0.5 ㎖;, 하이드로 코르티손 21- 헤 미숙시 네이트, 0.5 ml의 인슐린 0.5 ㎖; 10 ㎖, 소 혈청 알부민 [지방산 무료] 0.5 mL를 보충 성분 (아스코르브 산을 추가 인간 재조합 표피 성장 인자 0.5 ㎖를 상기 용액 (500)에 HBM), 0.5 ml의 전사. </li><li> 병 탑 필터 유닛 또는 주사기 팁 필터를 사용하여 0.45 ㎛의 0.22 ㎛의 필터를 통해 멸균 필터. </li></ol></li><li> 각각의 세포 유형은 제조업 자의 지시에 따라 해동 후 혈구 계산에 의해 차 인간 간세포, 쿠퍼 세포 및 성상 세포의 세포 밀도를 결정한다. </li><li> 원추형 튜브에서 37 ° C로 가온 한 HCM 배지에서 세포 수에 의해 80:10:10의 비율로 차 인간 간세포, 쿠퍼 세포 및 성상 세포 수확기. 주 : 사용되는 매체의 용적이 전체 세포 수에 대한 애플리케이션 특정 달려 번째 의해 결정되어야E 사용. </li><li> 20 ℃에서 520 × g으로 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 남기고 상층 액을 흡인. </li><li> 40 ㎕의 배지 당 1,000 세포를 포함하는 세포 현탁액을 수득 HCM 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 타원체의 수는 생산되는에 전체 볼륨이 달려있다. </li><li> 96 웰 형식 매달려 드롭 판에 세포 현탁액을 전송합니다. 다세포 스페 로이드가 형성되는 과정을 3 일 동안 5 % CO 2에서, HCM의 각 웰에 약 1,000 세포의 총 첨가하고 37 ℃에서 유지한다. </li><li> 피펫을 사용하여 매달려 드롭 판에서 간 회전 타원체를 수집합니다. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 전송합니다. </li></ol></li><li> 간 특정 하이드로 겔 bioink에 Bioprint 간 타원체 <ol><li> 가교제로서 PEGDA 8 % 8 % 8 아암 PEG의 알킨을 이용하는 단계 1과 간 ECM 함유 하이드로 겔 bioink의 제형을 준비한다. resu에서의 기능이 조합을 사용하여기본 간 조직에 전단 탄성 계수에 가까운 하이드로 겔에 lting. </li><li> 타원체들이 단계 3.1.7에 넣고있는 원추형 튜브의 바닥에 정착하자. 이것은 구형의 크기 및 밀도에 기초하지만, 일반적으로 1 ~ 2 분 이내에 발생 달라진다. 주의 깊게 흡입에 의해 또는 피펫 모든 용지를 제거합니다. </li><li> 타원체를 함유하는 원뿔형 튜브에 새로 제조 된 하이드로 겔 bioink 용액을 원하는 부피로 이동. 일반적으로, 적절한 양의 10 %를 인쇄 할 수있는 3 차원 구조체의 체적에 비해 -25 % 크다. 조심스럽게 하이드로 겔 bioink 용액에 회전 타원체를 재현 탁 아래로 피펫합니다. 피펫 또는 혈청 학적 피펫을 사용하여 bioprinter 카트리지에 전송합니다. </li><li> bioprinter 카트리지 내부의 용액을 30 분 동안 최초의 가교 단계 (티올 레이트 화 반응)을 겪게 할 수있다. 주 : 구형의 크기에 따라 카트리지가 느리게 회전 될 필요가있다거나 내용물을 혼합 할 필요가있다멸균 주걱 1 단계 가교 동안 bioink에 걸쳐 분산 회전 타원체를 유지합니다. 이 일시 중단 된 세포 대신 회전 타원체 준비 bioinks에 대한 필요성 이하이다. 주의 : 단계 1의 가교 후, 사용자는 몇 시간 동안의 동작 윈도우를 갖는다. 그러나, 세포 생존을 향상시키기 위해 신속 bioprinting 처리를 행하는 것을 추천합니다. </li><li> 단 하나의 가교 후, 주 간 타원체 (또는 다른 세포)를 함유하는 하이드로 겔, 원하는 구조를 생성하기 위해 bioprinting 장치를 사용한다. 주 :이 기술은 구조물의 다양한 biofabricating위한 시스템을 제공한다. 구조가 인쇄되는 이러한 전체 부피, 세포 또는 타원체 인쇄 된 구조 형상의 수, 기판 등의 파라미터는 사용자의 목적에 따라 크게 좌우된다. </li><li> 원하는 구성으로 증착 한 후, 공동 안정화 보조 가교 결합 메카니즘을 개시 2-4 초 동안 UV 광을 관리원하는 수준으로 nstructs 및 증가 강성. 주 : PEG-알킨의 농도, 따라서 전체적인 최종 가교 밀도는 주로 최종 구조체의 강성을 제어한다. </li><li> 다층 구조물을 생성하기 위하여 단계 3.2.4 및 3.2.5을 반복한다. </li></ol></li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

인간 또는 시험 관내 스크리닝 응용 프로그램에 대한 최종 사용, 3 차원 조직 구조를 biofabricate 할 때 고려해야 할 중요한 몇 가지 구성 요소가 있습니다. biofabrication 장치 자체는 최종 구조에 도달하기위한 일반적인 방법을 결정하는 동안 적절한 세포 성분을 이용하는 것은 최종 잠재적 기능을 결정한다. 이 이중 역할을 역할로 세 번째 구성 요소, 바이오 물질은 똑같이 중요하다. 특히, 생체...

최근, 다양한 기술이이를 제조 또는 biofabricate 모색하여 기능 기관 및 조직의 대체 소스에 대한 필요성을 해결이 가능하게되었다. Bioprinting는이 기술의 가장 유망한 중 하나로 떠오르고있다. Bioprinting은 3 차원 패턴 가능한 기관 형상 또는 조직과 같은 구조를 구축하거나 사용할 수있는 생물학적 부품 로봇 첨가제 제조의 형태로 생각 될 수있다. 대부분의 경우 1 bioprinting 3 (3 차원을 채용 -D)함으로써 recapitulating 정확한 위치로 세포 및 생체 물질을 증착하기 위해 컴퓨터에 의해 지시되는 인쇄 장치 생리 아키텍처 해부학을 흉내 낸.이 이러한 장치 세포 집합체의 형태를 취할 수있는 &quot;bioink&quot;를 인쇄 하이드로 캡슐화 세포 점성 유체, 또는 셀 시드 미세 전달체뿐만 아니라 무 세포 PLA 기계적 구조 또는 행위를 제공하는 무 세포 중합체ceholders. 3,4- bioprinting 처리 후는, 결과 구조는 기능적 조직 또는 기관 구조로 성숙하고 의도 된 최종 애플리케이션에 사용될 수있다. -5,6- 현재까지 완전한 완전히 기능 인간 크기 기관이 인쇄되지 않은, 하지만이 연구 개발 bioprinting의 주요 장기 목표가 남아있다. (2) 그러나, &quot;organoid&quot;티슈 구조물은 병리 모델링, 약물 개발 및 독성 검사를 포함하여 응용 프로그램으로 구현되는 소규모. 연구자 bioprinting 기술을 적용 발생한 주요 장애물 중 하나는 매우 적은 재료 bioprinting의 명시적인 목적으로 개발 된 것이있다. 효과적으로 bioprinting에서 성공하기 위해, 생체 재료 (4) 기본 요구 사항을 충족해야합니다. 바이오 물질이 증착을 허용하도록 1) 적절한 기계적 특성을 가질 필요가 (이것은 겔 또는 I와 같은 노즐을 통해 압출 될액적으로서 nkjet) 증착 후의 3 차원 구조의 구성 요소로 그 형상을 유지하기 위해, 2) 기능, 3)이 종래의 특성에 대한 사용자 제어 및 4) 셀 친절한 지원 환경에서 모든 기능 bioprinting 절차의 단계. 7 역사적으로, 작업을 bioprinting는 종종 대신 bioprinting 및 후속 후 인쇄 응용 프로그램에 필요한 특성을 가지고 생체 재료의 설계, 자신의 호환성을 고려하지 않고 bioprinting 장치에서 기존의 전통적인 생체 재료를 사용하기 위해 노력하고 있습니다. bioinks의 다양한 증착 및 제조 하드웨어와 더 나은 인터페이스에 최근에 개발되었다. 그들은 일반적으로 어느 전구체로서 충분한 기계적 특성, 또는 경우 노즐을 막히게 할 수있는 인쇄 또는 압출 공정에 망가가 중합 하이드로 유체 솔루션이 존재하기 때문에 표준 겔 시스템은 심각한 문제를 제기. 우리 팀뿐만 아니라 인접로rs는 하이드로 겔 기판에 세포 회전 타원체 인쇄, 마이크로 캐 필러 튜브에서 5,8 세포와 하이드로 겔 필라멘트 압출, 동적 가교 특성을 가진 9-11 압출 히알루 론산 (HA) - 금 나노 입자 하이드로 겔을 포함하여 이러한 bioprinting 문제를 해결하기 위해 다양한 하이드로 겔 제형을 살펴 보았다 광중합을 사용하여 하이드로 겔 강도의 12 시간 제어, 17 HA 및 젤라틴, 13 피브리노겐 - 트롬빈 계 가교제, 14, 15의 이온 교환 알긴산 콜라겐 겔 (16) 메타 크릴 레이트 최근 급격한 중합 자외선 (UV) -initiated 가교 이러한 예는 효과적으로 bioprinted에 의해 수 생성 물질의 가능성을 보여줍니다. 그러나, 하드웨어의 통합에 추가하여, 성공적 가능한 기능적 3-D 조직 구조를 생성하기 위해, 생체 물질은 세포 유지를 지원하는 생화학 적 및 기계적 신호를 포함해야생존과 기능. 이러한 추가 요인, 생화학 적 및 기계적 프로필, bioprinted 조직 구조의 성공적인 기능에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 두 세포 및 원시 세포 외 기질 (ECM)는 이러한 성장 인자 및 다른 세포에 다른 사이토킨 신호 분자로서 폭넓게 제시 할 책임이있다. 이들 신호의 결합 조직의 조직에서 다르지만, 세포 및 조직의 행동을 조절하는 매우 강력한 영향력 수있다. (18) 탐색 된 다른 기관으로부터 조직 특이 ECM 부품을 채용하고, 하이드로 겔 또는 하이드로 겔의 일부로서 구현 성공. 19-21, 주어진 조직 decellularizing을 분쇄하고, 용해 구성되는이 방법, 임의의 조직으로부터 조직 - 특이 적 생화학 적 신호를 생성하기 위해 3-D 하이드로 겔 구조에 혼입 될 수있는 이용 될 수있다. (22) 또한,그것이 널리 체내 조직을 강성의 넓은 범위를 차지하는 것이 설명되어있다. 이와 같이 23 튜닝 능력 등 탄성률 E &#39;또는 전단 탄성률 G&#39;와 같은 생체 재료의 기계적 특성, 조직 공학에서 유용한 도구 . 전술 한 바와 같이, bioink 기계적 특성 제어 대상 기관 유형과 일치하는 다음 상기 탄성률 레벨이 달성 될 수있는 나중 지점에서 이차 가교에 의해 조작 할 수있는 연질 겔을 사용하여 압출 기반 biofabrication 허용한다. 예를 들어, 생체 재료는에서 작동하는이 organoids의 능력 증가, 이론 (24, 25)을, 네이티브 간처럼 23 ~ 10 kPa로의 강성을 일치 또는 기본 심장 조직처럼 10 ~ 15 kPa로의 강성에 맞게 사용자 정의 할 수 그 나라 티슈 대응 유사한 방식. 세포 표현형에 환경 강성의 영향은 특급있다특히 줄기 세포에 대하여, 최근 lored. 잉글 러 외는. 조직 탄성 기판의 그것과 일치하는 계통으로 중간 엽 줄기 세포 (MSC)를 구동에서 도움이 기판 탄성을 보였다. (25) 이러한 개념은 상기 근육으로 분화, 심장 기능, 간 표현형, 조혈 줄기 세포의 증식에 대한 탐구 한 및 줄기 세포 치료 가능성의 유지. 24,26-29 조정할 수있는 서로 다른 탄성률을 하이드로 겔은 조직 구조를 biofabricate 데 사용되는 생체 재료의 중요한 특징이다. (30) 여기에서는 압출 bioprinted 수있는 하이드로 겔 시스템을 공식화하기 위해 실험실에서 사용 다기능 방식을 나타내고, 특정의 조직 유형의 생화학 적 프로파일을 포함하고 2) 그 조직 유형의 탄성률을 모방) (1)에 정의 된 프로토콜을 설명 . 이러한 요구 사항을 해결함으로써, 우리는 페이지에 목표생체의 물리 화학적 및 생물학적 특성 요점을 되풀이 할 수있는 물질을 rovide 조직.도 31은 여기에 기술 된 모듈러 하이드로 복합 시스템은 압출의 bioinks을 수득 다중 가교 방식을 활용하고 안정화시키는 보조 가교 결합을 허용하고의 강성을 증가 최종 제품은 조직 유형의 범위와 일치한다. 생화학 커스터마이즈 조직 특이 ECM 성분을 사용하여 만족된다. 데모, 우리는 기능 간 organoid 구조를 bioprint이 하이드로 겔 시스템의 간 고유의 다양한 사용합니다. 기술 된 프로토콜은 사용자 3 차원 bioprinting 장치를 사용한다. 일반적으로,이 프로토콜은 대부분 압출 기반 프린터에 적용 할 수 있고, 특정 인쇄 파라미터는 장치의 각 유형에 대해 극적으로 변화하고, 사용자에 의해 검사를 필요로한다.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronic acid</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-4&amp;prime;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&amp;nbsp;kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Primary human hepatocytes</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Primary human liver stellate cells</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Primary human Kupffer cells</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Basal Media (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Media Supplement Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5&amp;nbsp;ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10&amp;nbsp;ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5&amp;nbsp;ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5&amp;nbsp;ml; insulin, 0.5&amp;nbsp;ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5&amp;nbsp;ml; transferring, 0.5&amp;nbsp;ml)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Other manufacturers are ok.</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Other manufacturers are ok.</td></tr><tr><td>Fresh porcine cadaver tissue</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freezer mill</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td></tr><tr><td>Hanging drop cell culture plate</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

전술 한 과정이 올바르게 준수 할 때 하이드로 겔은 표적 조직 유형 특정 생화학 적 프로파일을 포함한다 (20) bioprinting 최종 탄성률 (34)을 통해 고도의 제어를 허용 및 조직 구조물은 가능한 기능 셀을 지원한다. 히드로 겔 지정 가장 모방 네이티브간에, 하이드로 겔 bioink이 간 ECM 솔루션과 성...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K 조회수.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다. 

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Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact bioprinting1-4 (extrusion, dip pen and soft lithography), contactless bioprinting5-7 (laser forward transfer, ink-jet deposition) and laser based techniques such as two photon photopolymerization8. It can be used for many applications such as tissue engineering9-13, biosensor microfabrication14-16 and as a tool to answer basic biological questions such as influences of co-culturing of different cell types17. Unlike common photolithographic or soft-lithographic methods, extrusion bioprinting has the advantage that it does not require a separate mask or stamp. Using CAD software, the design of the structure can quickly be changed and adjusted according to the requirements of the operator. This makes bioprinting more flexible than lithography-based approaches.
Here we demonstrate the printing of a sacrificial mold to create a multi-material 3D structure using an array of pillars within a hydrogel as an example. These pillars could represent hollow structures for a vascular network or the tubes within a nerve guide conduit. The material chosen for the sacrificial mold was poloxamer 407, a thermoresponsive polymer with excellent printing properties which is liquid at 4 &deg;C and a solid above its gelation temperature ~20 &deg;C for 24.5% w/v solutions18. This property allows the poloxamer-based sacrificial mold to be eluted on demand and has advantages over the slow dissolution of a solid material especially for narrow geometries. Poloxamer was printed on microscope glass slides to create the sacrificial mold. Agarose was pipetted into the mold and cooled until gelation. After elution of the poloxamer in ice cold water, the voids in the agarose mold were filled with alginate methacrylate spiked with FITC labeled fibrinogen. The filled voids were then cross-linked with UV and the construct was imaged with an epi-fluorescence microscope.

A bioprinter was used to create patterned hydrogels based on a sacrificial mold. The poloxamer mold was backfilled with a second hydrogel and then eluted, leaving voids which were filled with a third hydrogel. This method uses fast elution and good printability of poloxamer to generate complex architectures from biopolymers.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Bioprinting is an emerging technology that has its origins in the rapid prototyping industry. The different printing processes can be divided into contact ...

연구

면역학 및 감염병학

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

생체공학

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto which cells are deposited. Because many biomaterial inks can be potentially cytotoxic to primary cells, it is necessary to determine the biocompatibility of these hydrogel composites prior to their utilization in costly 3D tissue engineering processes. Some 3D culture methods, including bioprinting, require that cells be embedded into a 3D matrix, making it difficult to extract and analyze the cells for changes in viability and biomarker expression without eliciting mechanical damage. This protocol describes as proof of concept, a method to assess the biocompatibility of a crystalline nanocellulose (CNC) embedded agarose composite, fabricated into a 24-well culture system, with mouse bone marrow-derived mast cells (BMMCs) using flow cytometric assays for cell viability and biomarker expression.
After 18 h of exposure to the CNC/agarose/D-mannitol matrix, BMMC viability was unaltered as measured by propidium iodide (PI) permeability. However, BMMCs cultured on the CNC/agarose/D-mannitol substrate appeared to slightly increase their expression of the high-affinity IgE receptor (Fc&#949;RI) and the stem cell factor receptor (Kit; CD117), although this does not appear to be dependent on the amount of CNC in the bioink composite. The viability of BMMCs was also assessed following a time course exposure to hydrogel scaffolds that were fabricated from a commercial biomaterial ink composed of fibrillar nanocellulose (FNC) and sodium alginate using a 3D extrusion bioprinter. Over a period of 6-48 h, the FNC/alginate substrates did not adversely affect the viability of the BMMCs as determined by flow cytometry and microtiter assays (XTT and lactate dehydrogenase). This protocol describes an efficient method to rapidly screen the biochemical compatibility of candidate biomaterial inks for their utility as 3D scaffolds for post-print seeding with mast cells.

This protocol highlights a method to rapidly assess the biocompatibility of a crystalline nanocellulose (CNC)/agarose composite hydrogel biomaterial ink with mouse bone marrow-derived mast cells in terms of cell viability and phenotypic expression of the cell surface receptors, Kit (CD117) and high-affinity IgE receptor (Fc&#949;RI).

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized matrix. This organization is challenging to replicate due to the heterogeneous environment of bone. Ceramic omnidirectional bioprinting in cell-suspensions (COBICS) is a microgel-based bioprinting technique that uniquely replicates the mineral and cellular structure of bone. COBICS prints complex, biologically relevant constructs without the need for sacrificial support materials or harsh postprocessing steps (e.g., radiation and high-temperature sintering), which are two of the biggest challenges in the additive manufacturing of bone mimetic constructs. This technique is enabled via the freeform extrusion of a novel calcium phosphate-based ink within a gelatin-based microgel suspension. The yield-stress properties of the suspension allow deposition and support the printed bone structure. UV crosslinking and nanoprecipitation then "lock" it in place. The ability to print nanostructured bone-mimetic ceramics within cell-laden biomaterials provides spatiotemporal control over macro- and micro-architecture and facilitates the real-time fabrication of complex bone constructs in clinical settings.

This protocol describes a 3D printing technique to fabricate bone-like structures by depositing a calcium phosphate ink in a gelatin-based granular support. Printed bone analogs are deposited in freeform, with flexibility for direct harvesting of the print or crosslinking within a living cell matrix for multiphasic constructs.

뼈 유사체 생성을 위한 세포 함유 현탁액의 세라믹 전방향 바이오프린팅

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...