박테리아를 사용한 3D 바이오 프린팅은 새로 개발된 기술입니다. 이 프로토콜은 박테리아로 인쇄된 엔지니어링 된 생물막 3D를 쉽게 구성 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴한 가정용 3D 프린터를 사용하여 3D 인쇄 생물필름을 생산하는 기능입니다.
3D 프린터의 가능한 한 가지 적용은 새로운 항균 요법을 개발하는 데 사용할 수 있는 재현 가능한 모델 생물막을 만드는 것입니다. 당사의 3D 프린팅 접근 방식은 alginate 기반 바이오잉크와 호환되는 모든 유형의 박테리아에 적용할 수 있습니다. 바이오잉크와 인쇄 기판의 제조는 상당히 표준적인 절차이며, 3D 프린팅 공정, 특히 Z축의 교정은 몇 가지 연습이 필요한 중요한 단계입니다.
설정된 액세스 높이를 보정하면 3D 프린터의 해상도에 영향을 미치며 개인적인 경험에 크게 의존합니다. 이 절차에는 수동 조정이 필요하며 서면 형식으로 설명하기가 어렵습니다. 200 마이크로리터 파이펫 팁을 실리콘 튜브 길이에 연결하고 파이펫 팁을 원래 압출기를 대체할 수 있도록 3D 프린터의 압출기 헤드에 장착합니다.
다음으로, 루리아-베르타니 국물에 용해된 1%의 1%의 1%의 400 밀리리터에 5마리의 어금니 칼슘 염화물 용액의 4밀리리터를 추가하고 적절한 항생제와 유도기로 보충합니다. 그런 다음 LB 한천 용액의 20 밀리리터를 각 150mm에서 15mm 페트리 접시에 분배합니다. 실온에서 30분간 건조하고 뚜껑이 반쯤 열려 있습니다.
3% 알자네이트 나트륨 용액을 준비하고 끓는 점에 3번 가열하여 용액을 살균합니다. 그런 다음 멸균 용액을 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 바이오잉크의 세균 성분을 제조하기 위해, 항생제를 함유한 LB 배지의 50밀리리터에서 구성 GFP 발현을 위해 플라스미드를 운반하는 대장균 균을 성장시다.
하룻밤 사이에 250 RPM과 섭씨 37도에서 문화를 흔들어 주세요. 문화의 하룻밤 성장 후, 3에서 5 분 동안 박테리아를 펠릿, 220 시간 중력 다음 상체를 제거. LB 배지의 10 밀리리터에서 박테리아 펠릿을 다시 중단하고, 3%의 알기네이트 나트륨의 10 밀리리터를 추가합니다.
3D 프린터를 컴퓨터에 연결하고 3D 프린팅 소프트웨어를 엽니다. X, Y 및 Z 축의 홈 버튼을 클릭하여 인쇄 헤드를 홈 위치로 이동합니다. 각 인쇄에 대해 준비된 인쇄 기판을 인쇄 베드의 특정 위치에 놓습니다.
인쇄 헤드를 수동 제어하에 22밀리미터 이상의 높이로 올리므로 이동 중에 페트리 접시가장자리와 충돌하지 않습니다. 인쇄 헤드를 플레이트 위에 놓고 파이펫 팁이 인쇄 표면에 닿을 때까지 아래로 이동합니다. 이 Z축 위치를 인쇄 표면의 높이인 Z1로 할당합니다.
그런 다음 인쇄 헤드를 들어 올리고 수동으로 플레이트 영역 외부로 이동합니다. 인쇄 헤드와 플레이트 표면 사이의 작업 거리가 Z2로 정의되면 인쇄 표면의 높이와 인쇄 시 인쇄 시 Z 값으로 인쇄 프로그램에 작업 거리를 입력합니다. 원하는 모양을 인쇄하기 위한 명령이 포함된 미리 프로그래밍된 G 코드 파일을 로드합니다.
각 명령줄에서 인쇄 헤드의 위치는 X, Y 및 Z 축에서 변경될 수 있습니다. 인쇄 표면의 높이와 작업 거리로 모든 인쇄 단계에서 Z 값을 입력해야 합니다. 액체 바이오잉크를 주사기에 적재하고 3D 바이오 프린터의 주사기 펌프에 장착합니다.
그런 다음 압출 속도를 시간당 0.3 밀리리터로 설정합니다. 인쇄 버튼을 클릭하여 생체 잉크를 인쇄 기판에 인쇄합니다. 인쇄가 시작될 때까지 주사기 펌프를 시작하고 인쇄 헤드가 인쇄 표면과 접촉하기 전에 기다립니다.
인쇄 하는 동안, 완전히 소프트웨어에 의해 인쇄 머리 움직임을 제어 합니다. 인쇄 헤드가 인쇄의 마지막 지점에 도착하자마자 주사기 펌프를 멈추고, 그렇지 않으면 과도한 바이오잉크가 인쇄 기판에 떨어지고 인쇄 해상도를 줄입니다. 3D 구조의 시공의 경우 인쇄 헤드의 모든 움직임이 G 코드 편집기에서 제어됩니다.
두 번째 레이어의 인쇄 높이를 높이 높이를 높이려면 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력하고 코드의 Z 값을 0.2 밀리미터 증가시다. 그 후 더 높은 층으로 이동할 때 Z 값을 0.1 밀리미터 증가시면 됩니다. 컬리 섬유와 같은 생물막 성분의 생산을 허용하기 위해 3~6일 동안 실온에서 인쇄된 샘플을 배양한다.
그런 다음 형광 스캐너에 접시를 놓고 플레이트를 이미지화합니다. 알자산 매트릭스를 용해하려면 pH 7에서 0.5 개의 어금니질 나트륨 구연산용액의 20 밀리리터를 인쇄 된 기판에 추가하십시오. 30 rpm에서 흔들면서 실온에서 플레이트를 2 시간 동안 배양하십시오.
그런 다음 액체를 버리고 플레이트를 다시 이미지화하여 구연산 치료 전후의 플레이트 이미지와 비교합니다. 3D 바이오 프린터는 다양한 2차원 및 3차원 모양으로 하이드로겔을 캡슐화하는 박테리아를 생성할 수 있습니다. 이러한 인쇄된 형상은 생물막의 형성이 성공적이었는지 또는 알기네이트 매트릭스가 구연산염 용액을 사용하여 완전히 용해되었는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다.
유도할 수 없는 컬리 생산 플라스미드가 없는 바이오잉크의 경우, 인쇄된 패턴은 구연산 나트륨 처리 후 완전히 용해되어 생물막 컬리 네트워크가 형성되지 않았음을 나타냅니다. 유도성 컬리 생산 플라스미드를 함유한 박테리아는 구연산 나트륨 치료 후 용해되지 않았으며, 인쇄된 박테리아가 박테리아의 인쇄 패턴을 안정화할 수 있을 만큼 광범위하게 컬리 네트워크를 형성할 수 있었다는 것을 나타낸다. 다층 구조를 구성하기 위해 G 코드 편집기를 제어하여 추가 레이어를 인쇄할 수 있습니다.
샘플에서 인쇄된 레이어의 수를 늘리면 인쇄된 구조의 너비와 높이가 점진적으로 증가했습니다. 대장균을 유도하여 컬리 단백질을 유도하도록 설계되었을 때 다층 구조로 인쇄된 구연산 나트륨 치료는 샘플을 용해시키지 않았고, 비컬리 생성 E.coli를 함유한 다층 구조는 용해되었다. 3D 프린팅 절차의 가장 중요한 부분은 Z축의 보정과 인쇄를 시작하고 주사기 펌프를 시작하는 조정입니다.
이 공정을 위해 개발된 바이오잉크는 인성이 낮기 때문에 상당히 부드럽습니다. 기계적 안정성을 제공하고 개선하기 위해 바이오 잉크에 추가 수정이 이루어질 수 있습니다. 이 3D 프린팅 기법은 우수한 기계적 특성을 가진 생물막의 생산을 가능하게 하며, 이는 생물모방 물질을 제조할 수 있습니다.
이 박테리아를 취급할 때, 장갑과 같은 적당한 보호를 착용하십시오.
