The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.

세균 DNA의 추출 (1) <ol><li> PBS 용액의 조제 <ol><li> 1.65 g을 플라스크에 2 HPO 4 × 2H 2 O, 0.22 g의의 NaH 2 PO 4 × 2H 2 O 및 8.80 g의 NaCl 나 무게 1,000 ML의 최종 볼륨에 증류수로 채운다. 7.4 pH를 조정합니다. 최종 사용하기 위해 박테리아 방지 (0.22 μm의) 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> DNA의 추출 그람 음성균 <ol><li> 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것. </li><li> 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고 순도를 확인하고 문화 (49)에 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 단일 세균성 식민지를 선택하고 1 ml의 PBS 용액을 포함하는 멸균 2.0 ml의 반응 관에 1 μl의 단일 사용 접종 루프로 전송합니다. </li><li> thermomix이 현탁액을 품어10 분 동안 95 ° C에서 어. 부화 후, 실온으로 냉각 세균 추출물 (용해 된 DNA를 포함)을하자 하나 더 사용 (그림 1a)에 대한 -20 ° C에서 증폭 또는 저장소에 대해 직접 사용합니다. </li></ol></li><li> 의 DNA 추출 그람 양성 박테리아 <ol><li> 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것. 문화의 morphotype을 확인하기 위해 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고, 문화의 순도를 확인하기에 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 멸균 1 μL를 접종 루프를 단일 박테리아 콜로니를 선택하고, 2.0 ml의 반응 튜브 내의 500 ㎕의 PBS 용액을 중지. </li><li> 500 ㎕의 유리 구슬을 추가하고 5 분 동안, 최대 주파수 및 진폭 (50 Hz에서)에서 작동 진동 균질에 튜브를 전송합니다. 1.0 mm 직경의 유리 구슬을 사용하여박테리아의 세포벽을 파괴한다. </li><li> 95 ° C에서 10 분 동안이 튜브를 부화 상온이. 더 사용하기 위해 -20 ° C에서 PCR 반응 또는 저장소 추출물 직접 사용합니다. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA의 PCR <ol><li> 증폭 프라이머의 제조 <ol><li> 프라이머의 TPU1를 사용하여 (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) 역방향 프라이머로 정방향 프라이머 및 RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;)와 같은 25. , DNase의 및 RNAse가없는 물과 프라이머 원액을 준비 100 pmol의 / μL (100 μM)의 농도가 10 pmol의 / μL에서 작업 솔루션에 추가로 희석. -20 ° C에서 프라이머 재고 및 작업 용액을 저장하거나 직접 사용합니다. </li></ol></li><li> PCR 반응 믹스의 제조 <ol><li> 피펫 1 ㎕의 각 프라이머, 1 μL의의 dNTP 믹스 (100 mM)을 상기 DNA 추출물 2.5 ㎕의 25 mM의 ㎎을 함유하는 5 μL 배 PCR 완충액 (멸균 200 ㎕의 반응 튜브에 CL 2)의 Taq 중합 효소 μL 0.25 (5 개 / μL) 및 39.25 μL DNAse-과의 RNAse 무료 PCR 물. </li></ol></li><li> PCR 프로토콜 <ol><li> 다음과 같이 내장 된 PCR 프로그램을 시작 : 첫째, DNA 형성 촉매 - 중합 효소를 활성화 할 필요가 5 분 동안 95 ° C에서 초기 배양 단계. 둘째, 증폭 35 사이클, 1 분을 함유. 95 ° C, 1 분에서 변성 단계. 50 ℃에서의 프라이머 어닐링 단계, 그리고 72 ℃에서 1.5 분의 프라이머 연장 단계를 포함한다. 셋째, 72 ° C에서 10 분 동안 최종 연장. 마지막으로, PCR 반응은 4 ℃로 냉각시켰다. 참고 : 황색 포도상 구균 및 H 2 O는 긍정적이고 부정적인 제어를 제공 (그림 1b). </li><li> 열 순환기에서 PCR 반응 혼합물이 포함 된 튜브를 배치하고 프로그램을 시작한다. </li></ol></li><li> PCR 산물의 정제 주 : PCR 생성물을 정제하기 위해, 몇몇 프로토콜에서 어느효소 기반 또는 실리카 흡착 매트릭스가 사용될 수있다. 여기에 사용되는 단일 단계 PCR 정리는 두 가수 분해 효소 반응을 이용합니다. 엑소 뉴 클레아 제 I (출 I)가 단일 가닥 DNA를 제거하는 동안, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP)는 비법의 dNTPs를 가수 분해. 세탁 - - 낮은 소금 용출 사이클 두 번째 절차는 높은 염이 빠른 바인딩 실리카 막 흡착 기술을 기반으로합니다. <ol><li> 25 ㎕의 PCR 생성물에 엑소 I 및 SAP 모두를 포함하는 효소 혼합물을 1.5 μL를 추가 철저히 혼합하고 80 ° C에서 15 분,이어서 37 ℃에서 처음 15 분의 간단한 프로토콜을 적용하는 열 순환기로 옮긴다. -20 ° C에서 정제 된 PCR 제품 중 하나를 저장하거나 PCR을 라벨에 대한 대상으로 직접 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. DNA 아가 로스 젤 전기 영동 <ol><li> 영동 완충액 (TBE 버퍼)의 제조 <ol><li> (10 54.0 g (445 mM)을 TRIS베이스, 27.5 g (445 밀리미터) 붕산과 0.5 M EDTA의 20 ㎖를 적정mM)을 플라스크에 수산화 나트륨으로 pH 8.0 용액을 1000 ml의 총 부피를 증류수로 채운다. 그런 다음 전기 증류수 (0.5 배 TBE)이 5 배 버퍼 1:10 희석. </li></ol></li><li> 적하 버퍼의 준비 <ol><li> 250 블루 mg을 브로 모 페놀 250 mg의 크실렌 cyanol의 FF와 플라스크에 polysucrose (재료 표)의 15g을 섞는다. 그런 다음 100 ㎖의 전체 부피의 0.5 배 TBE 완충액으로 채운다. 추가 사용에 대한 -20 ° C에서로드 1 ml의 부분에 염료 및 저장을 나누어지는. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 캐스팅 <ol><li> (w / v) 아가로 오스 겔을 2 %를 제조 아가 플라스크 내의을 300ml의 0.5X TBE 완충액 (3.1.1 절 참조)에 6g 표준 전기 계량. 이어서 아가 로스를 완전히 용해 될 때까지 가열하는 전자 레인지에 가까운 비등점 아가 혼합물을 넣고 용액을 명확 나타난다. </li><li> 용융 아가로 오스를 충분히 냉각하자 1 %의 10 μl를 추가 에티 디움 브로마이드 스톡 SOLU (/ V w)기. 캐스트에 솔루션을 붓고 캐스트에서 (30 우물을 허용) 겔 빗 놓습니다. 겔이 완전히 응고 될 때 빗살을 제거하고 0.5 배의 TBE 버퍼를 포함하는 전기 영동 챔버로 겔을 넣어. 참고 : 에티 디움 브로마이드는 독성 및 돌연변이입니다. 따라서이주의를 처리해야합니다. 니트릴 장갑을 사용하는 것이 좋습니다. 무독성 대안으로 사용할 수있는 다른 인터 핵산 얼룩이있다. </li></ol></li><li> PCR 산물의 아가로 스겔 전기 영동 주 : PCR 증폭 산물의 정확한 크기를 확인하고, 정제 된 PCR 생성물을 아가 로스 겔에서 분리 된 DNA의 농도를 추정하기 위해. <ol><li> 피펫 2 PCR 반응 관 내로 로딩 완충액 μL 및 PCR 생성물 8 μL를 추가한다. 겔의 우물에이 혼합물을 피펫. PCR 산물의 크기를 추정하기 위해 별도의 웰의 분자량 크기 마커 (DNA 사다리) 8 μL를 추가한다. </li><li> 대다일정 10 V / cm에서의 전압은 브로 모 페놀 블루 마커 약 ¾ 겔의 전체 길이에 도달하자마자 전기 영동을 멈춘다. 자외선 - transilluminator가 (파장 302 나노 미터)를 사용하여 분리 된 PCR 단편을 가시화하고, 겔 문서 시스템을 사용하여 기록. DNA의 사다리와 시각적 인 비교에 의해 DNA의 양을 추정한다. 라벨 PCR을위한 대상으로 약 10 NG를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 4. 생거 시퀀싱 <ol><li> 사이클 시퀀싱 PCR 참고 : 시판 키트 (재료 표)를 사용하여 10 ㎕의 반응에서 PCR 레이블링을 수행한다. <ol><li> 5 배 반응 mastermix의 2 μL의 DNA 준비의 2 μL, TPU1 또는 RTU4 작업 용액 (10 pmol의 / μL) 및 DNase의 4.5 μL 및 RNAse가없는 물 1.5 μl를 추가합니다. </li><li> 열 순환기이 시퀀싱 반응 혼합물을 넣고 다른 PCR을 실행합니다. 총 공정은 25 사이클 (96 ° C 변성 단계 이루어지는10 초), 열처리 공정 (45-60 ° C, 5 초) 및 확장 단계 (60 ℃, 2 분). 마지막으로, 4 ° C에서 반응을 냉각. </li></ol></li><li> 시퀀싱 반응의 정화 <ol><li> PCR 정화 (자료 표)에 대한 상업 스핀 열을 사용하여 라벨 반응 혼합물을 정제. </li><li> 예비 수화 겔 - 여과 매트릭스 상 시퀀싱 반응을 10 μl의 하중을 3 분 동안 750 XG에서 원심 분리 공정을 수행한다. 주 : 비 통합 염료 종결이 겔 매트릭스에 유지되는 절차의 사용에 의해. </li><li> 그런 다음 진공 농축기에서 수성 용출액을 건조. 40 ° C에서 20 분 30 2,500 XG에 원심 분리기 건조를 완료합니다. </li><li> 높은 탈 포름 아미드 10 ㎕를 다음 2 분 동안 90 ℃에서 변성과 얼음의 혼합물을 냉각 추가합니다. 피펫 96 웰 μl를 접시에 변성 샘플 10 μL. 분석이 경우 -20 ℃에서 건조 및 세정 PCR 생성물을 보관나중에 수행 될 수있다. </li></ol></li><li> 16S rRNA의 유전자 시퀀싱 및 DNA 서열 분석 참고 : 자동 시퀀서 (자료 표)에 서열 분석을 수행합니다. 여기서 사용 된 시퀀서는 액상 중합체 (67) (도 1C)와 (50cm 4 모세관 배열)을 동시에 4 샘플을 분석하는 자동 형광 계 모세관 전기 영동 시스템이다. <ol><li> 시퀀서의 미세 적정 플레이트를 놓습니다. 2 배치로 샘플 시트 (판 레코드)를 작성, 저장 1에 주어진 단계에 따라 시퀀싱 실행 / 분석을 시작합니다. 참고 : 시퀀스 실행의 지속 시간이 2 시간이고, 800에서 1,000 bp의 데이터를 제공한다. </li><li> 시퀀싱 분석 소프트웨어 (자료 표)를 엽니 다. 시퀀스 데이터는 텍스트 파일 (.SEQ) 및 품질 값 (QV)를 포함하는 electropherogram을 포함하는 파일로 주어진다 (.ab1). 참고 : 기본 통화는 당 자동적으로시퀀싱 분석 소프트웨어에 의해 형성된 하부 electropherogram 육안으로 판정한다 (예를 들어, 피크 높이, 피크 분리) 시퀀스 전에 추가 애플리케이션에 사용된다. </li><li> NCBI의 노이즈 감소 데이터베이스 이용한 BLAST 알고리즘 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)에 저장된 DNA 서열 파일을 비교한다. </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS 참고 : 질량 분석기는 337 nm의 N 2 레이저를 사용하고 특정 제어 소프트웨어 (자료 표)에 의해 운영되고 있습니다. 스펙트럼은 선형 모드와 2,000 만에 다가 덮여 사이의 질량 범위에 기록됩니다. 샘플에 대한 점수의 데이터 해석 및 할당 분석 소프트웨어 (재료 표) (도 1D)에 의해 실시간으로 수행된다. <ol><li> MALDI-TOF MS 분석을위한 박테리아의 준비 <ol><li> 골에 (예를 들어, Myroides odoratimimus) 관심있는 박테리아를 성장세균 균주 (도 2a)에 따라 18 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 5 % 말 혈액을 함유 umbia 혈액 한천. 문화의 조사에서 유기체의 morphotype뿐만 아니라 순도를 확인하는 그람 염색을 수행합니다. </li><li> 96 웰 스틸 타겟 잘 단일 박테리아 콜로니를 전송하는 나무 이쑤시개를 사용하여 (도 2b 및도 2c). 스팟 1 철강 대상에 공기 건조 유기체의 상단에 70 % 포름산 ㎕의 약 2 ~ 3 분 동안 건조 둡니다. </li><li> 이어서, 유기 용매 (50 % 아세토 니트릴, 2.5 % 트리 플루오로 아세트산, 47.5 % H 2 O) 50 ㎎ / ㎖의 CHCA (α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산)를 포함하는, 1 ㎕의 매트릭스 용액 스폿을 오버레이. 주 : (플레이트 제조 방법)에 산 오버레이 방법은 질량 스펙트럼의 품질을 개선하는데 사용될 수있다. 그것은 그람 양성 세균에 대한 것을 밝혀졌다 이러한 &quot;산 공격은&quot;점수 버지니아 증가측정 된 스펙트럼 (45)의 역병. 주 : 또는 자동화 된 샘플 준비 시스템 (재료 표)하는 제 1 건조 사이클 후 1 ㎕의 70 % 포름산 용액과의 접촉 프리 스폿, 1 ㎕의 매트릭스 용액을 박테리아 스미어에 적용 사용될 수있다. 샘플은 60 % 상대 습도에서 표준 조건하에 건조하고, 분석에 사용할 준비가되어있다. </li><li> 매트릭스 스미어는 후드에서 약 5 분 동안 다시 자연 건조 겹쳐 보자. 적용 행렬이 세균 도말 이제 많은 시간 동안 안정하다. 참고 : 매트릭스없이 세균성 얼룩 때문에 단백질 분해에 안정되지 않을 수 있습니다. </li></ol></li><li> MALDI-TOF MS 분석을 수행 <ol><li> 샘플 소개 <ol><li> 우리 MMIS (재료 표)의 제어 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 악기의 IN / OUT 버튼을 눌러 질량 분광계의 샘플 로딩 포트 통기. </li><li> 클릭 후로드 포트를 열고 건조 된 세균 도말 플러스 매트릭스와 MALDI-TOF MS의 목표 판을 삽입합니다. </li><li> 포트를 닫고 다시 대피. 진공을 관찰하고 도달 할 때 4.5 × 10 -6 mbar에서 측정을 시작합니다. </li></ol></li><li> 샘플 분석 <ol><li> 우리 MMIS (재료 표)의 분석 소프트웨어를 열고 &#39;파일&#39;메뉴를 클릭합니다. &quot;새 분류&quot;새 창 &quot;MALDI의 biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;를 선택 열립니다. 프로젝트 이름 &quot;필드에, Myroides 측정 project_1&quot;예를 들어, 프로젝트 이름을 입력합니다 &quot;하고 버튼을 눌러&quot;새 프로젝트 &quot;라는 이름의 새 대화 상자에서.&quot;새 &quot;를 체크 프로젝트 이름과 버튼을 눌러 계속 진행&quot;OK &quot;를. </li><li> 은 &quot;MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;에서 열린 &quot;분석 배치&quot;창을 관찰합니다. 선택 대상 위치 (예를 들어, A1, A2, A3 ...), 마우스 오른쪽 CLICK 선택된 (파란색 사각형으로 표시) 위치는 &quot;샘플을 추가&quot;를 선택합니다. 샘플 이름, 샘플 ID 및 선택적 주석에서 자동으로 열립니다 테이블 뷰 유형에. 계속 버튼 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;에서 열린 &quot;선택 MALDI의 biotyper 방법&quot;창을 관찰합니다. 에서 &quot;브루 커 분류&quot;, &quot;분류 나무에서 MSP가&quot;를 선택하고 계속 &quot;다음&quot;을 클릭합니다. </li><li> 은 &quot;MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사&quot;에서 열린 &quot;프로젝트 요약&quot;창을 관찰합니다. 실제 분류 프로젝트 위에서 주어진 삽입 된 항목을 확인합니다. 버튼 &quot;마침&quot;을 눌러 실행 분류를 시작합니다 (그림 2D를 - F). 적절한 진공에 도달하면 측정이 자동으로 시작됩니다. </li><li> 측정이 성공적으로 완료 될 때까지 분류 실행하십시오. t에서 결과 테이블을보기그는 &quot;MALDI Biotyper 실시간 분류 프로젝트 Myroides 측정 project_1&quot;메뉴 &quot;보기&quot;를 열고 &quot;결과&quot;를 클릭합니다. </li><li> 기본 웹 브라우저에서 HTML 파일로 &quot;브루 커 달 토닉 MALDI Biotyper 분류 결과&quot;를 볼 수 있습니다. 인쇄하고 결과를 저장합니다. </li></ol></li><li> 계측기 교정 및 장비 검증 주간 (악기 자체 테스트)를 수행하기 위해 분석을 샘플링 매일 전에 테스트 표준을 측정합니다. 주 : MALDI-TOF 측정 스펙트럼 중은 분석 소프트웨어 (재료 표)에 의해 실시간으로 분석한다. 각각의 점수와 함께 10 종의 목록이 주어진다 및보고를위한 실험실 정보 시스템 (LIS)로 공급된다. </li><li> 비판적으로 MALDI-TOF MS 결과 (대표 결과를 참조)는, 적절한 경우, 그러한에 필요한, ​​그람 염색 경우 biochemical- 및 항생제 감수성 프로필 또는 16S rRNA 유전자 염기 서열과 같은 다른 테스트를 포함 평가미생물 학적 보고서 박테리아 종을 지정. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 서열은 모두 다른 박테리아의 다수를 식별 할 수있는 가능성을 제공한다. MALDI-TOF MS는 처리하고 세균 질량 스펙트럼의 대형 데이터베이스를 사용할 수있는 용이 한 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 이유로, MALDI-TOF MS 희귀 세균성 병원균 17,20,39,51 집중 스크리닝 연구를 수행하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 방법이다. 다른 표현형 식별 방법,...

일상적인 진단에 드문 병원체의 안전 확인은 고전 문화와 생화학 적 방법이 복잡하고 때로는 의심 있다는 사실에 의해 방해된다. 또한, 진단 미생물학 연구소는 자동화 된 시스템의 사용을 필요로 매일 수천에 수백에 이르는 병원균 다수, 처리한다. 높은 일일 처리량의 관리뿐만 아니라, 박테리아 종의 정확한 식별은 필요하다. 그들은 자신의 항균제 감수성 패턴에 차이가 있으므로 올바른 식별 적절한 항생제를 선택하는 중요한 정보 (예를 들어, 엔테로 종., 된 Acinetobacter 종.) 12,43와 임상의를 제공하기 때문에이 보증합니다. 자동 미생물 식별 시스템 (AMIS)는 박테리아 균주의 대사 특성을 특성화하기 위해 효소 반응의 표준 세트를 적용 <sup&gt; 13,15,16,26,27. 이러한 시스템에 사용되는 카트리지는 다양한 생화학 적 반응의 다수, 예를 들어, 52이 연구에 사용 된 AMI의 GN 카드 (47) 만 세균 제한된 전략이 허가 보안 ID를 이용하더라도. 또한, 데이터베이스, 고급 전문가 시스템은 명확 의학적 중요성 13,15,16,36의 관련성 관련성 세균의 검출에 초점을 맞추고있다. 널리 실험실에서 사용되는 두 개의 추가 시스템은 또한 박테리아 식별이 생화학 적 방법을 적용 할 수 있습니다. 종 (35) 수준에서 3 차 AMI를 단지 82.4 %의 식별 정확도를 갖는다 최근의 연구는 본 연구에서 사용 된 AMI와 경쟁 온 (93.7 %는 각각 93.0 %) 사이의 비교 식별의 정확도를 증명한다. 이러한 불일치는 기본 식별 데이터 참조, 키트 및 소프트웨어, 메타 보의 차이 버전의 품질에 의해 설명 될 수있다lism 및 기술 인력 35, 36의 능력. 두 자동화 된 MALDI-TOF MS 시스템 (MALDI-TOF 미생물 식별 시스템, MMIS)이 주로 사용된다. 이 시스템은 단백질 지문 질량 스펙트럼에 기초한 박테리아 종의 다수의 검출을 허용한다. 예를 들어, 사용 된 MMIS의 데이터베이스는 6000 참조 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 질량 분석을 기반으로 식별 시스템은 희귀 병원균 11,48,51를 포함하는 미생물의 큰 다양성의 빠르고 안정적인 검출을 제공합니다. 지금까지 몇 직접적인 비교는 본 연구에서 사용 된 MMIS와 경쟁 19,33 사이에 사용할 수 있습니다. Daek 따르면 외. 두 시스템 식별 정확도 유사한 높은 속도를 제공하지만, 본 연구에 사용 된 MMIS 종 식별 19보다 안정적인 것으로 보인다. 마찬가지로, 분자 기술은 또한 잘 보존하지만 주소 지정 고유 한 유전자 ( <em&gt; 예를 들어, 16S rDNA의 또는 rpoB)는 명확한 종 식별 3,22,61을 허용합니다. 이들 중에서, 16S rDNA의 때문에 모든 세균 (34)의 존재에 가장 널리 사용되는 하우스 키핑 유전자이다. 그 기능은 생물 정보학 14, 34에 적합 할만큼 충분히 긴 대략 1,500 염기쌍으로 변경하고 마지막 유지된다. 많은 연구자들은 박테리아 식별 (21)에 대해 &quot;금 표준&quot;등의 16S rRNA 유전자 분석을 간주한다. 이것은 몇몇 실험실 희귀하거나 새로운 박테리아 14, 34 식별하기위한 날짜 DNA-DNA 혼성화 기술을 사용한다는 사실에 기인한다. 또한, 더 많은 데이터베이스는 16S rRNA 유전자 분석 (50)에 이용 될 수 있습니다. 그러나, 16S rDNA의 기반 탐지 시스템은 표준 PCR 프로토콜에 비해 제한된 감도를 가지고 있음을 고려해야한다. 또한, 분자 접근 방식은 많은 시간이 소요, 정교하고 고도로 훈련 된 직원뿐만 아니라 필요전용 실험실 시설이며, 따라서 쉽게 일상적인 진단 (55)에 구현되지. 또한, 세균의 식별 중 적어도 두 가지 방법들의 조합이 고정밀 스트레인 식별에 이르게하는 것이 밝혀졌다. MALDI-TOF MS 및 16S rDNA 염기 서열의 결합은 높은 정밀도로 다른 세균 종의 다수의 식별을 허용한다. 최근 MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 분석의 조합은 역학적 질문 희귀 병원균 세균성 56 공부 식별을 위해 제시되었다.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>85600</td><td>Oscillating homogenizer</td></tr><tr><td>Glass-beads 1.0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Germany</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1,000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&amp;acute;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3&amp;rsquo;)</td><td>biomers.net, Ulm, Germany&amp;nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer RTU4 (5&amp;acute;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&amp;acute;)</td><td>biomers.net, Ulm, Germany&amp;nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>-&amp;nbsp;</td><td>Thermocylcer</td></tr><tr><td>Reaction tube 1.5 ml</td><td>SARSTEDT, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>72,692</td><td></td></tr><tr><td>Reaction tube 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&amp;uuml;mbrecht, Germany</td><td>72,693,005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&amp;nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburg, Germany</td><td>-</td><td>Microwave</td></tr><tr><td>Titriplex III (EDTA Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-salt dehydrate; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp</td><td>Eurogentec, L&amp;uuml;ttich, Belgium</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xylene cyanol FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&amp;nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution 1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&amp;uuml;nchen, Germany</td><td>-</td><td>Gel-documentation system&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 reactions)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer (10x) with EDTA&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di formamide (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>-</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, well plate septa</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Software 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>Our mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&amp;eacute;rieux, N&amp;uuml;rtingen, Germany&amp;nbsp;</td><td></td><td>2&lt;sup&gt;nd&lt;/sup&gt; mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>Device control software</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>-</td><td>Analysis software</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1&amp;nbsp;g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Peptide Calibration Standard II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 target polished steel</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&amp;nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxy&amp;nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Germany</td><td>Part No. 1836007&amp;nbsp;</td><td>Automated sample preparation system</td></tr><tr><td>Vitek 2&amp;nbsp;</td><td>bioM&amp;eacute;rieux, N&amp;uuml;rtingen, Germany&amp;nbsp;</td><td></td><td>Our aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Germany</td><td></td><td>2&lt;sup&gt;nd&lt;/sup&gt; aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&amp;trade; Automated Microbiology System</td><td>BD, Heidelberg, Germany</td><td></td><td>3&lt;sup&gt;rd&lt;/sup&gt; aMIS</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Staphylococcus aureus&lt;/i&gt;&amp;nbsp;subsp.&amp;nbsp;aureus&amp;nbsp;Rosenbach (ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;25923&amp;trade;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France</td><td></td><td>Positive control for PCR&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

identification of rare bacterial pathogens by 16s rrna gene sequencing and maldi-tof ms

특히 면역 환자에서 심각한 감염을 일으킬 것으로보고되고 있으므로, 충분히 설명 된 희귀 세균성 병원체가 있습니다. 대부분의 경우 보고서로 게시 대부분의 경우 단지 몇 데이터,에서, 감염원과 같은 병원균의 역할을 조사 할 수 있습니다. 따라서, 병원성 미생물의 특성을 명확하게하기 위해, 이들 박테리아의 다수를 포함 역학 조사를 수행 할 필요가있다. 균주의 확인은, 그들이 루틴 진단 (견고성) 취급하기 쉽고 경제적이어야 유효 명명법에 따른 정확성을 가지며, 이들은 비교 생성 할 : 이러한 감시 연구에서 사용되는 방법은 다음 조건을 만족해야 다른 실험실 중 결과. 일반적으로, 일상적인 환경에서 박테리아 균주를 식별하기위한 세 가지 전략이있다 같습니다 biochemica의 특성 1) 표현형 식별박테리아 L 및 대사 특성 2) 신규 프로테옴 기반 접근법으로서 16S rRNA 유전자 서열 3) 질량 스펙트럼 분자 기법. 질량 분석 및 분자 접근법 박테리아 종의 많은 종류를 식별하기위한 가장 유망한 도구이기 때문에, 이러한 두 가지 방법이 설명된다. 이러한 기술을 사용하여 진행 제한 및 잠재적 인 문제가 논의된다.

MALDI-TOF MS는 소설, 미생물 일상적인 진단을위한 신속하고 저렴한 방법입니다. MALDI-TOF MS에 의해 세균 종 식별이 주로 리보솜 단백질뿐만 아니라 다른 &quot;환경 조건에 의해 최소한의 정도에 영향을 집 유지 기능을 가진 매우 보존 된 단백질&quot;로 구성 스펙트럼을 생산하는이 MMIS의 17 국지적 인 데이터베이스는 기준 스펙트럼의 큰 집합을 포함 거의 임상 분리에서...

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Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

identification-rare-bacterial-pathogens-16s-rrna-gene-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K 조회수.  TU Dresden. Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

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Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. Allelic isoforms of the detectable biomarker ions result in isolate-specific mass shifts. Mass spectrometry-based phyloproteomics (MSPP) is a novel technique that combines the mass spectrometric detectable biomarker masses in a scheme that allows deduction of phyloproteomic relations from isolate specific mass shifts compared to a genome sequenced reference strain. The deduced amino acid sequences are then used to calculate MSPP-based dendrograms.
Here we describe the workflow of MSPP by typing a Campylobacter jejuni ssp. doylei isolate collection of seven strains. All seven strains were of human origin and multilocus sequence typing (MLST) demonstrated their genetic diversity. MSPP-typing resulted in seven different MSPP sequence types, sufficiently reflecting their phylogenetic relations.
The C. jejuni ssp. doylei MSPP scheme includes 14 different biomarker ions, mostly ribosomal proteins in the mass range of 2 to 11 kDa. MSPP can in principle, be adapted to other mass spectrometric platforms with an extended mass range. Therefore, this technique has the potential to become a useful tool for strain level microbial typing.

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

Mass spectrometry-based phyloproteomics (MSPP) was used to type a collection of Campylobacter jejuni ssp. doylei isolates at the strain level in comparison to multilocus sequence typing (MLST).

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

연구

유전학

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

생화학

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats(수생 서식지에서 탄화수소 대사 특성을 가진 박테리아 종의 분리, 번식 및 식별)

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

환경과학

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the present study, freshwater samples were collected and analyzed with respect to the total bacterial diversity and AR genes (ARGs) using both conventional culture-based techniques and a high-throughput culture-independent metagenomic approach. This paper presents a systematic protocol for the enumeration of the total and antibiotic-resistant culturable bacteria from freshwater samples and the determination of phenotypic and genotypic resistance in the culturable isolates. Further, we report the use of whole metagenomic analysis of the total metagenomic DNA extracted from the freshwater sample for the identification of the overall bacterial diversity, including non-culturable bacteria, and the identification of the total pool of different ARGs (resistome) in the water body. Following these detailed protocols, we observed a high antibiotic-resistant bacteria load in the range of 9.6 &#215; 105-1.2 &#215; 109 CFU/mL. Most isolates were resistant to the multiple tested antibiotics, including cefotaxime, ampicillin, levofloxacin, chloramphenicol, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, trimethoprim, and ciprofloxacin, with multiple antibiotic resistance (MAR) indexes of &#8805;0.2, indicating high levels of resistance in the isolates. The 16S rRNA sequencing identified potential human pathogens, such as Klebsiella pneumoniae,&#160;and opportunistic bacteria, such as Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., and Aeromonas spp. The molecular characterization of the isolates showed the presence of various ARGs, such as blaTEM, blaCTX-M (&#946;-lactams), aadA, aac (6&#39;)-Ib (aminoglycosides), and dfr1 (trimethoprims), which was also confirmed by the whole metagenomic DNA analysis. A high prevalence of other ARGs encoding for antibiotic efflux pumps-mtrA, macB, mdtA, acrD, &#946;-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, the&#160;chloramphenicol acetyltransferase gene catB10, and&#160;the rifampicin resistance gene rphB-was also detected in the metagenomic DNA. With the help of the protocols discussed in this study, we confirmed the presence of waterborne MAR bacteria with diverse AR phenotypic and genotypic traits. Thus, whole metagenomic DNA analysis can be used as a complementary technique to conventional culture-based techniques to determine the overall AR status of a water body.

Here, we present a detailed protocol for the isolation and identification of antibiotic-resistant bacteria from water and the molecular characterization of their antibiotic resistance genes (ARGs). The use of culture-based and non-culture-based (metagenomic analysis) techniques provides complete information about the total bacterial diversity and the total pool of different ARGs present in freshwaters from Mumbai, India.

수인성 항생제 내성 박테리아의 분리 및 동정과 항생제 내성 유전자의 분자 특성 분석

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

면역학 및 감염병학

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

화학

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

생물학

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...