우리의 방법은 물 샘플에서 항생제 내성 박테리아의 전체 부하가 얼마인지와 같은 주요 질문에 답합니다. 이 박테리아의 정체는 무엇이며 그들이 가지고있는 항생제 내성 특성과 유전자의 다른 유형은 무엇입니까? 우리 프로토콜의 장점은 물 샘플의 전체 박테리아의 상당 부분을 구성하는 실험실에서 성장할 수 없는 박테리아도 검출할 수 있다는 것입니다.
따라서 이론적으로 박테리아 나 그 내성 특성이 빠지지 않습니다. 배양 기반 및 배양 독립적 기술을 모두 포함하는 이 조합 기술은 하수, 제약 또는 병원 폐수, 임상 및 비임상 환경 등에서 얻은 모든 샘플에 대해 복제하고 사용자 정의할 수 있습니다. Devika와 함께 실험 절차를 시연하는 것은 Harshali Shinde와 Maitri Mishra, 둘 다 내 실험실의 선임 연구원입니다.
시작하려면 물 샘플을 멸균 모슬린 천으로 여과하여 무균 처리하여 미립자 물질을 제거하십시오. 그런 다음 추가 분석을 위해 여과된 물 샘플을 연속 희석합니다. 총 박테리아 부하를 측정하려면 여과된 물 샘플의 적절한 희석액 100마이크로리터를 응고된 R2A 한천 플레이트에 놓고 복제하고 고르게 펴 바릅니다.
모든 샘플 확산 플레이트를 섭씨 35 내지 37도에서 48시간 동안 배양한다. 잠복기가 지나면 콜로니를 세고 총 박테리아 부하를 밀리리터당 콜로니 형성 단위로 표현합니다. 항생제 내성 박테리아 수를 결정하려면 약 섭씨 40도에서 변형된 멸균 용융 R2A 한천 20밀리리터가 들어 있는 튜브에 항생제를 별도로 추가합니다.
한천이 굳기 전에 고르게 혼합되도록 소용돌이 치고 멸균 페트리 플레이트에 붓습니다. 품질 관리 및 항생제의 효능을 확인하려면 R2A 한천 변형 플레이트가 포함된 각각의 항생제에 100마이크로리터의 박테리아 현탁액을 퍼뜨립니다. 플레이트를 섭씨 35도에서 37도에서 48시간 동안 배양한 다음 박테리아 수를 결정합니다.
PCR을 위해 분리물로부터 DNA 주형을 제조하기 위해, 멸균 이쑤시개를 사용하여, 페트리 플레이트 상에서 성장하는 단리물의 단일 단리된 순수 콜로니를 취한다. 박테리아 콜로니를 마이크로 원심 분리 튜브의 멸균 이중 증류수 100 마이크로 리터에 현탁하고 끓는 물 욕조 또는 건조 욕조에서 섭씨 100도에서 10 분 동안 끓입니다. 현탁액을 10, 000 g에서 2분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화하고 상청액을 새로운 멸균 미세원심분리 튜브로 옮겨 조 DNA 주형으로 사용한다.
PCR에 의해 16S rRNA 유전자의 V3 영역을 증폭하기 위해, PCR 튜브에 40 마이크로리터의 반응 혼합물을 준비한다. 튜브를 열 블록에 놓고 PCR 열 순환기에서 적절한 프로그램을 실행합니다. PCR 앰플리콘을 분해하고 시각화하기 위해 10마이크로리터의 증폭된 PCR 산물을 2마이크로리터의 6x 겔 로딩 버퍼에 혼합하고 이 혼합물을 앰플리콘의 크기를 추정하기 위한 100개의 염기 쌍 DNA 사다리와 함께 1.5%아가로스 겔의 웰에 로드합니다.
추적 염료가 겔의 3/4을 실행할 때까지 TAE 탱크 버퍼에서 80 내지 100 볼트에서 겔의 전기 영동을 수행한다. 그런 다음 UV 투과 조명기 아래에서 앰플리콘 밴드를 시각화합니다. 접종물을 준비하기 위해 항생제 없이 2밀리리터의 Luria-Bertani 또는 LB 배지에 멸균 루프를 사용하여 분리된 단일 정제된 항생제 내성 콜로니를 무균적으로 접종하고 섭씨 37도에서 80rpm으로 밤새 배양합니다.
다음날, 2 밀리리터의 신선한 비 선택적 LB 배지에 100 내지 150 마이크로 리터의 하룻밤 성장 배양물을 첨가하고 600 나노 미터에서의 광학 밀도가 0.4 내지 0.5에 도달 할 때까지 2 내지 4 시간 동안 배양한다. 멸균 된 0.85 % 식염수를 사용하여 새로 성장한 배양 현탁액을 희석하고 부드럽게 혼합하여 세포를 고르게 분배하여 0.5 McFarland 표준에 해당하는 배양 밀도에 도달합니다. 희석 후 15분 이내에 멸균 면봉을 접종물에 담그고 플레이트의 과다 접종을 피하기 위해 초과 현탁액을 제거합니다.
그런 다음 준비된 Mueller Hinton 한천 플레이트에 배양 물을 위에서 시작하여 가장자리에서 가장자리로 앞뒤로 고르게 펴십시오. 그런 다음 플레이트를 60도 회전하고 다시 면봉을 시작하십시오. 항생제 디스크를 배치하려면 화염 멸균 된 집게를 사용하고 항생제 디스크를 접종 된 한천 플레이트에 무균 적으로 옮깁니다.
한천과 완전히 접촉하도록 디스크를 부드럽게 누르십시오. 억제 영역이 겹치지 않도록 항생제가 사용되는 유기체와 플레이트 크기를 고려하여 한천 플레이트에 적절한 수의 항생제 디스크를 놓습니다. 항생제 디스크 적용 후 15 분 이내에 플레이트를 뒤집어 섭씨 37도에서 밤새 배양하십시오.
다음날, 밀리미터 단위의 억제 직경 영역을 측정하고 EUCAST에서 제공한 중단점 값에 따라 해석합니다. 물 샘플의 총 박테리아 부하가 3.0 x 10에서 9 번째 CFU / mL로 밝혀졌으며 항생제 내성 박테리아 부하가 높은 것으로 나타났습니다. 시퀀싱된 항생제 내성 배양균은 장내세균과에 속하며 대부분은 대장균과 클렙시엘라 폐렴입니다.
또한 희귀 한 기회 박테리아도 확인되었습니다. 디스크 확산법에 의한 항생제 감수성 검사는 8개의 분리주에 대해 약 0.2의 다중 항생제 내성 지수를 나타내어 높은 수준의 내성을 나타냅니다. 그러나 코마모나스와 아르트로박터 종은 테스트된 항생제에 내성을 나타내지 않았습니다.
배양 가능한 분리물은 베타-락탐, 트리메토프림 및 아미노글리코사이드에 대한 인자를 암호화하는 항생제 내성 유전자의 존재를 밝혀냈습니다. 총 박테리아 다양성에 대한 메타게놈 DNA 분석을 통해 50개의 문이 확인되었으며, 이는 프로테오박테리아가 알파프로테오박테리아, 베타프로테오박테리아 및 감마프로테오박테리아 클래스로 구성된 가장 지배적인 문인 높은 박테리아 다양성을 나타냅니다. 주문 수준에서 Burkholderiales는 베타 프로 테오 박테리아 클래스에 속하는 가장 널리 퍼졌습니다.
일반적으로 슈도모나스, 아시네토박터, 페도박터, 프로스테코박터, 림노아비탄스, 플라보박테리움, 코마모나스는 풍부한 박테리아 중 일부였습니다. 메타게놈 DNA 분석은 또한 더 많은 항생제 내성 유전자를 밝혀냈습니다. 이 방법에서는 오류가 발생하면 총 CFU 및 항생제 내성 박테리아 부하를 잘못 해석 할 수 있으므로 연속 희석 단계가 중요합니다.
또한 격리물이 내성인지 민감한지 정확하게 해석하기 위해 억제 영역의 직경을 신중하게 측정해야 합니다. 이러한 프로토콜을 사용하여 물 샘플 외에 환경, 식품 또는 임상 등 다른 샘플을 연구 할 수 있습니다. 또한 박테리아 외에도 모든 생태계의 다른 미생물 개체군도 유사한 접근 방식을 사용하여 연구 할 수 있습니다.
