Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

퓨전 방법으로 1 16S rRNA의 유전자의 증폭 도서관 준비 <ol><li> 5&#39;-CCT CTC :;, 역 R533-IonP1 5&#39;-CCA TCT의 CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;프라이머 (포워드, F343 - 오 - MIDXX 해동 TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;AT TAT GGG CAG TCG GTG, 굵은 이온 토렌트 특정 어댑터, 이탤릭체 :; 일반 글꼴 시퀀싱 실행의 시작 부분에 신호 강도를 교정에 대한 염기 서열 키 : 템플릿 특정 프라이머, X를 ... X : 10 염기쌍의 바코드를 바코드 일부 서열은 표 1 참조), 2X HotStartTaq 플러스 마스터 믹스 및 샘플. 부드럽게 혼합한다 마스터 믹스를 제외하고, 사용 전에 완전히 혼합. </li><li> 역방향 프라이머 0.5 μM, 0.4 밀리그램 / 소 혈청 알부민 (BSA) 1 배 HotStartTaq 플러스 마스터 믹스의 ML과 PCR 믹스 (20 ㎕의 반응을) 준비합니다. 이메일에 마스터 믹스의 18.5 μl를 추가ACH PCR 튜브. </li><li> 함께 시퀀싱 될 샘플들 각각에 대해 서로 다른 바코드 정방향 프라이머 (20mM의​​ 0.5 μL)에 추가. PCR 튜브에 샘플 1 μL (1 ~ 10 NG / μL)를 추가합니다. </li><li> PCR 기계에 튜브를 삽입하고 다음 프로그램을 실행시킵니다 5 분 동안 95 ° C에서 초기 변성; 30 초 동안 95 ° C의 25주기, 30 초 동안 55 ° C와 45 초 동안 72 ° C; 10 분 동안 72 ° C에서 최종 신장. PCR 제품은 4 ° CO 유지 / N 또는 사용할 때까지 동결 할 수 있습니다. </li></ol> 2 앰플 리콘 정제, 정량화 및 풀링 <ol><li> 가장 큰 빗 사용할 수를 사용하여 2 % 아가 로스 젤을 준비합니다. 물론 빈에 의해 각각의 샘플을 분리, 겔 반응 및 부하에 6 배 젤 로딩 염료의 5 μl를 추가합니다. 50 분 동안 70 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 겔의 사진을 가지고 밴드를 잘라 (250 bp의 주위에 예상 크기 : 190 bp의 제품 플러스 63 bp의 어댑터 및 바코드) 깨끗한 메스를 사용합니다. </li><l난&gt;을 절제 밴드를 달아 (예 :와, 제품, QIAquick 젤 추출 키트) PCR 제품의 겔 추출 및 정제를 진행합니다. </li><li> PicoGreen 각 PCR 제품을 정량화하고 5 × 10 9 분자 / μL (약 1 NG / μL)에서 원액을 얻기 위해 희석합니다. 몇 가지 샘플이 낮은 증폭을 표시하는 경우, 이후의 절차에 적합한 가장 낮은 농도가 1.57 × 10 7 분자 / μL (26 일 오후)임을 염두에두고, 낮은 농도로 희석을 조정합니다. </li><li> 각각의 희석 된 PCR 생성물의 풀 10 μL 샘플의 등몰 풀을 얻었다. 계획 순서 실행의 각 하나의 별도의 풀을 준비합니다. 사용할 때까지 풀링 된 PCR 생성물은 냉동실에 보관 될 수있다. </li></ol> 3 에멀젼 PCR 및 시퀀싱 <ol><li> 유화 PCR을 수행 <ol><li> 25 μL의 볼륨에서 26 시까 풀링 된 PCR 제품을 희석. 이온 PGM 템플릿 키트에서 해동 시약. </li><li> PCR 후드 에멀젼 PCR 믹스 (키트에 제공된 시약)을 준비하고 벤치에 풀링 된 PCR 제품과 (제공) 구 입자를 추가합니다. 철저하게 믹스와 필터 카트리지에 혼합물을 넣고 조심스럽게 유화 오일 맨 (제공). </li><li> 천천히 자동화 된 에멀젼 PCR 장치 (예를 들면, 이온 원터치이 악기)의 필터 카트리지 및로드 역. 해당 프로그램을 선택하고 절차를 시작합니다. </li></ol></li><li> PCR이 완료된 후 자동 에멀젼, 수집 튜브의 상등액을 제거하고 관의 하단 구 입자를 검색. (키트에 제공된) 세척 용액 100 ㎕의 구체를 재현 탁 및 라이브러리 정량 2.0 μL 나누어지는 가져 가라. </li><li> 라이브러리 정량화를 수행합니다. <ol><li> SSPE 버퍼 (150 mM의 염화나트륨, 10mM을 나포 4, 1mM의 나 2 -EDTA) 어댑터 B&#39;-식구의 2 μL (와 5&#39;-FAM -ct의 100 μl를 혼합G AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) 프로브 및 어댑터 A-Cy5에 2 μL (5&#39;-Cy5에 -CCA TCT의 CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) 프로브. 단계 3.2에서 찍은 2.0 μL 나누어지는이 혼합물의 52 μl를 추가하고 정량 빈으로 나머지 52 μL에 (템플릿 키트) 세척 용액 2 μl를 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 37 ° C에서 다음 2 분 동안 95 ° C에서 품어. 1.5 ml의 튜브 혼합물을 전송합니다. </li><li> 실온에서 3 분 동안 15,500 XG에서 TEX 버퍼 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, 0.01 % 트리톤 X-100, 산도 8.0) 1.0 ㎖를 섞어 추가하고 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 각 튜브에 20 μl를 둡니다. 이 세척 과정을 두 번 반복합니다. </li><li> , TEX 버퍼의 180 μl를 추가 고형 입자를 재현 탁하고 500 ㎕의 큐 비트 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 큐빗 장치를 이용 FAM 및 Cy5에 대한 형광을 측정하고 이온 커뮤니티 웹 사이트에서 확인할 수 계산기를 사용하여 포지티브 분야의 비율을 계산. </li></ol></li><li> 자동화 농축 시스템 (예를 들어, 이온 원터치 보충 시스템)를 사용하여 (증폭 된 DNA를 포함)에 대한 긍정적 인 구체 구 입자의 나머지 부분을 풍부. <ol><li> 제공된 8 웰 스트립의 적절한 우물에 피펫 시약 : 음 1 단계 3.2에서 구형 입자; 이 음 : MyOne 스트렙 타비 딘 C1 구슬 (13 μl를) 미리 세척; 그런데 3, 4, 5 : 세정액 (템플릿 키트에 제공됨); 6 음 : 빈; 음 7 : 용융 오프 용액 (125 mM의 수산화 나트륨, 0.1 % 트윈 20)으로; 음 8 : 빈. </li><li> 피펫의 팔에 팁과 시료 채취를위한 0.2 ML 튜브를 설치합니다. 악기를 시작합니다. 농축의 끝에서, 용액 (제공)를 중화의 10 μl를 추가합니다. 풍부한 구슬은 최대 15 일 동안 4 ° C에서 유지 될 수있다. </li></ol></li><li> 시퀀싱 기기를 초기화합니다 : <ol><li> 시퀀싱 실행의 세부 사항을 지정하여 시퀀싱 기기에 연결하고 시퀀싱 실행 계획을 준비합니다. </li><li> 설치된의L 세척 용액 # 2 (이온 PGM 시퀀싱 키트에 제공됨), 세척 용액 # 1 (350 ㎕의 100 mM의 수산화 나트륨) 및 자동 pH 완충 용액 (제공). </li><li> 초기화 절차를 시작하는 경우는 각각 50 ㎖의 튜브으로 dATP, dGTP를 dCTP 및 dTTP의 뉴클레오티드를 (제공)를 추가하라는 메시지가. 시퀀싱 기계에 관을 나사 및 초기화 절차를 계속한다. 초기화가 완료되면, 즉시 실행 절차를 시작한다. </li></ol></li><li> 순서를 위해 샘플을 준비하고 칩을로드 : <ol><li> 1.5 분 동안 15,500 XG에서 원심 분리하여 튜브의 하단에 3.4 단계에서 농축 분야를 수집합니다. 정확히 3 μl를 떠나 뜨는을 제거합니다. </li><li> (시퀀싱 키트에서 제공) 시퀀싱 프라이머의 3 μl를 추가, 입자를 재현 탁 아래로 피펫 팅하여 잘 혼합합니다. 2 분 동안 37 ° C에서 다음 2 분 동안 95 ° C에서 품어. </li><li> 중합 효소 (제공) 잘 혼합하고 incub의 1 μl를 추가5 분 동안 실온에서 먹었다. 30 분 이내에 시퀀싱 칩 효소 구 혼합물을로드로 이동합니다. </li><li> 배양 동안에, 시퀀서 시퀀싱 칩을로드하고 칩의 품질 검사를 수행. 원심 분리에 의해 칩으로부터 액체를 제거하고 천천히 구 효소 믹스 (7 μL)를 누른 pipeting 및 칩 중의 기포의 도입을 피함으로써 칩의 샘플을로드. </li><li> 마이크로 원심에서 1 분 동안 칩을 세 번 원심 분리기. 각 원심 분리에서 칩의 방향을 변경하고 피펫 팅에 의해 각 실행 사이에서 아래로 섞는다. </li><li> 기기에 칩을 넣고 실행을 시작합니다. </li></ol></li></ol> 4 기본 시퀀스 데이터 분석 <ol><li> 시퀀싱 데이터 서버에 연결하고 fastq 파일을 다운로드합니다. 프라이머와 바코드 정보를 (표 1의 예 참조)이 포함 된 탭으로 구분 된 &quot;올리고&quot;파일을 만듭니다. 경구에서 Greengenes 참조 파일 다운로드허 웹 사이트 ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Mothur를 시작하고 분석을 수행 : <ol><li> 다음 명령을 사용하여 FASTA에 fastq 파일과 품질의 파일을 변환 : fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> 각 시퀀스의 그룹 구성원을 결정하고 다음 명령을 사용하여 시퀀스를 트림 : trim.seqs을 (FASTA = test.fasta, 올리고 = barcode.txt, Qfile을 = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T) </li><li> 다양한 옵션을 원하는 엄격도에 따라 변경 될 수있다 </li><li> 다음 명령을 사용하여 greengenes 분류법의 서열을 분류 : classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, 방법 = 왕, 그룹 = test.groups, 템플릿 = gg_99_otus.fasta, 분류 = gg_99_otus.tax, 차단 = 50) </li></ol></li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> 여기에 제시된 방법은 간단하고 저렴하며, 많은 실험실 metagenomic 시퀀싱 능력에 액세스 할 수 있도록한다. 이 사용 시퀀싱 플랫폼에 따라 다르지만, 일단 라이브러리는 공정의 대부분이 자동화가되는 매우 작은 손에 시간이 필요합니다 구성된다. 여기서 사용 시퀀싱 플랫폼 (이온 런트 PGM)의 경우, 전체 절차는 작업 이틀 내에서 수행 될 수있다. PCR의 36 샘플의 증폭 : 36 샘플 25달러, 젤 정화 및 PicoGreen DNA 정량은 다음과 같습니다 (2013 년 9 월) 작성하는 순간, 위에서 설명한 예와 관련된 시약 비용이었다 125 달러, 에멀젼 PCR 한 풀링 된 앰플 리콘 샘플 : $ 550 샘플 당 15달러 또는 품질 필터링 읽기 당 $ 0.0015 총 250 달러, $ 150, 시퀀싱 시약. 이 가격은 악기 서비스 계약, 장비 감가 상각, 기술자의 급여 및 실험실 공간 사용을 포함하지 않습니다. 각 시료에 대해 판독의 텐트 &quot;&gt; 가장 중요한 단계 중 하나는 유사한 번호를 검색하기 위해, 등몰 비로 모든 제품을 풀이다. PicoGreen 정량 여기서 사용되었지만, 다른 방법은 비록 덜 정확, 적합 할 수도 (예를 들면, UV 정량, 젤 기반 정량화). 심지어 가장 정확한 정량 및 풀링을 수행하여, 샘플 당 읽기 수에 약간의 변화가있다, 표 2에 설명 된 일반적인 실행, 그것은 4380에서 32750의 범위 10,338의 평균 읽기로 읽습니다. 샘플 (이상 40 ~ 50보다) 많은 수를 처리하는 경우, 단일 열 젤 정화가 엄격한 크기의 컷오프와 함께 접시 또는 정제를 사용하여 비즈 겔 정제로 대체 될 수있다 (예를 들어, AMPure 비즈) . 현재까지, 16S rRNA 유전자에 가장 사용 차세대 시퀀싱 기술은이 프로토콜에서 사용되는 454 이온 런트 시퀀싱 기술은 개념적으로 매우 유사하다이며454과 두 기술은 시퀀싱 에러의 동일한 유형 쉽다. 당연히, 그것은 이온 토렌트 순서가 454 시퀀싱 (10)와 매우 유사한 염기 서열 결과를 초래 것으로 나타났다. 최근, 여러 연구자들은 16S rRNA의 유전자 앰플 리콘 서열 18,19 일루미나위한 기술의 사용을 탐구 하였다. 어떤 경우에는, 상기 방법으로 최근에 기술 된 것처럼, 이러한 시퀀싱 기술에 필요한 어댑터 및 바코드 맞게 융합 프라이머 서열을 변화시킴으로써 일루미나 MiSeq 또는 454 GS 주니어 등 다른 벤치 탑 시퀀서의 현재 프로토콜을 적응하기 쉬운 것 일루미나 MiSeq 19. 또한, 연구진은 단계 여기에 설명 된 프로토콜의 1과 2를 따라 에멀젼 PCR 및 시퀀싱을 수행 할 것 시퀀싱 센터로 풀링 증폭 산물을 보낼 수 있습니다. 16S rRNA 유전자는 트리밍 및 Mothur 분류를 사용하지만, 다른 많은 분석이 수행 가능 하였다 읽기16S rRNA 유전자의 증폭 물. 예를 들어, 베타 다양성에 설명 된 절차 사용하여 각 샘플 쌍 사이 Unifrac 거리를 계산하여 평가 될 수 <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. 다이버 알파 인덱스 및 각 샘플의 분류 학적 연산 유닛의 개수는 21처럼 AmpliconNoise QIIME 내에 도구를 사용하거나 Mothur 내의 HUSE 외. 22 사용할 의해 설명 된 절차를 사용하여 계산 될 수있다. 여기에 사용되는 프라이머는 16S rRNA 유전자로부터 가변 영역들 (3, 4)를 증폭하지만, 많은 다른 영역들이 타겟팅 될 수있다. 본 연구에서, 16S rRNA의 유전자는 식물 재료로부터 증폭 된 프라이머의 선택은 엽록체 16S rRNA 유전자 23,24 증폭을 피하기 위해 제출되었다. 제품의 길이, 분류 능력과 유용성 (25), (26)의 관점에서 차이가 사용할 수있는 다른 프라이머의 다양한있다. 그러나, 모든 경우에 200-400 BP 확실 종 레벨에서 분류 될 수없는 16S rRNA 유전자의 판독 및 분석은 속 높은 분류 학적 수준으로 제한된다. 종 레벨 정보 및 cpn60 rpoB 유전자 27,28 같이 필요한 경우에 다른 유전자가 더 적합 할 수있다. 분석 도구의 전력 시퀀싱 및 증가의 비용이 미래의 급격한 하락은 가능 엽총 메타 지노믹스에 의해 16S rRNA 유전자 염기 서열을 대체 할 수 있도록 수도 있지만 그때까지 16S rRNA 유전자 염기 서열은 환경 미생물학의 황금 표준 남아있다.

그것은 환경 적 시료에 함유 된 유전 정보의 전체를 대상으로 Metagenomic 시퀀싱은 아주 강력한 기술이다. 샷건 시퀀싱, 대형 삽입 라이브러리와의 amplicon 시퀀싱을 포함 metagenomic 시퀀싱의 다른 맛이있다. 앰플 리콘 서열은 일반적으로 정렬 될 수있는 하나의 게놈 영역에서 상대적으로 저렴하고 빠른 판독 생산할 수있는 장점을 제공한다. 또한, 앰플 리콘 시퀀싱 데이터 분석 워크 플로우는 주로 표준화된다. 이 PCR에 기초하기 때문에, 모든 불완전한 특이성, 불완전한 커버리지 및 프라이머에 관련된 바이어스 기껏 반 정량이 접근하게 1,2, 편향을 갖는다. 몇몇 게놈 영역은 기능적 유전자 앰플 리콘을 포함한 시퀀싱의 대상이 될 수 있지만, 가장 인기있는 옵션 커뮤니티 프로파일을 생성하는 등의 16S rRNA 유전자 등 마커 유전자를 사용한다. 전통적으로, 16S rRNA 유전자의 앰플 리콘 sequencing는 E.에 클로닝 포함 노동 집약적 기술을 사용하여 수행 대장균, 식민지 따기와 격리 된 플라스미드에 생거 시퀀싱 다음 플라스미드 추출, 그리고, 결과적으로 대부분의 연구는 샘플 당 100 개 미만의 클론을 분석했다. 차세대 염기 서열은 두 가지 주요 발전을 가져왔다 : 가장 중요한 시퀀싱 반응과의 대규모 병렬, 템플릿의 클론 분리를 호스트에 유전자 조각을 삽입 할 필요없이. 이것은 대단히 16S rRNA의 유전자의 증폭 서열 3에 대해 &quot;르네상스&quot;의 결과로, 이제 다시 많은 환경 미생물 연구의 일상적인 기능을 그대로 16S rRNA 유전자 증폭 산물의 염기 서열을 단순화했다. 2005 년 4 로슈 454 서열의 출현 이후, 다른 여러 차세대 시퀀싱 기술은 시장에 등장했다 (예를 들면, Illumina 사, 고체, PacBio). 벤치 - 탑 시퀀스의 최근 소개RS는 작은 실험실에 큰 시퀀싱 센터에 한 번 독점적 시퀀싱 용량을 가져왔다. 다섯 벤치 탑 시스템은 현재 사용할 수 : 454 GS 주니어, 이온 토렌트 개인 게놈 머신 (PGM)와 양성자, 그리고 일루미나 MiSeq와 NextSeq (500) 모든 시퀀서 덜 제공하는 대부분의 풀보다 실행 및 달러 당 더 적은 기지 당 읽는 동안 스케일 시퀀서들은 빠르고 더욱 유연하고, 낮은 취득 및 실행 비용이 작은 학술 실험실들이 경제적 만든다. 연구의이 유형은 일반적으로 염기 서열의 극단적 인 깊이를 필요로하지 않기 때문에 벤치 탑 시퀀서는 특히, 환경 미생물 연구의 증폭, 작은 게놈과 낮은 복잡성 metagenome 염기 서열에 적합하다. 예를 들어, 일반적으로 16S rRNA 유전자 염기 서열이 수를 연구에 수백만이 데이터 세트 5를 읽어와 같은 패턴을 생성 할 수 있습니다 읽기 1000 ~로, 샘플 당 읽고 답은 아니라고보고있다. 그런 말로 미루어 보아, 벤치 탑 차세대 generatio<html> N 시퀀서는 여전히의 최대 수율 시퀀스 많은 양의 데이터를 생성 ~ 35 MBP (454 GS 주니어) ~ 2 일 GBP (이온 토렌트 PGM) ~ 10 ~ 15 일 GBP (이온 토렌트 양성자) ~ 10 일 GBP (Illumina의 MiSeq) 대부분의 환경 미생물학 연구에보다 더 충분하다 ~ 100 GBP (Illumina의 다음 서열 번호 500). 벤치 탑 시퀀서를 사용하여 16S rRNA를 증폭 산물의 차세대 시퀀싱은 최근 다양한 환​​경에 적용되었다. 예를 들어, 이온 토렌트 PGM이 사회를 위해 사용 된이 오일 샌드 광산의 영향 퇴적물의 탄화수소 오염 북극 토양 8,9의 양식 체계 (7), 순환의, 특히 높은 pH와 낮은 투과성 6 있었다 우라늄 광산 찌끼의 분석 인간과 동물의 몸의 13 ~ 16, 오염 된 토양 (12)에 심은 버드 나무의 혐기성 소화조 (17)의 근권의 Athabasca 강 (10, 11)에서 생물막 (biofilm). 이 공헌 우리 세부 벤치 탑에게 차세대 시퀀서 (이온 토렌트 PGM)를 사용하여 사내 16S rRNA 유전자 증폭 산물을 순서에 우리의 접근 방식에서 jove_content &quot;&gt;. DNA 추출 후, 16S rRNA의 유전자가 포함 된 도메인 수준 세균 프라이머를 사용하여 증폭 시퀀싱 어댑터와 독특한 샘플 특정 시퀀스 (바코드)가. 증폭 산물이 몰 비율로 정제 정량화 및 풀링됩니다. 풀링 된 샘플은 다음 clonally 에멀젼 PCR 증폭 및 염기 서열됩니다. 결과 시퀀스는 (공개 생물 정보학 도구를 사용하여 분석 예를 들어, Mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

미생물 생태학의 주요 질문 중 하나는 &quot;사람이 있습니까?&quot;입니다이 문제는 다양한 도구를 사용하여 대답하지만, 오래 지속 골드 표준의 한 도메인 수준 PCR에 의해 생성 된 16S 리보솜 RNA (rRNA의) 유전자 증폭 산물을 시퀀싱하는 것입니다 수 있습니다 게놈 DNA에서 증폭 반응. 전통적으로, 이는 클로닝 및 생거 (모세관 전기 영동) PCR 증폭 산물의 염기 서열에 의해 수행되었다. 차세대 시퀀싱의 출현 대단히 단순화 및 16S rRNA 유전자의 염기 서열에 대한 서열 깊이를 증가했다. 벤치 탑 시퀀서의 도입은 이제 작은 실험실 일 만에 사내들은 16S의 rRNA의 염기 서열을 수행 할 수 있습니다. 여기서, 벤치 탑 차세대 시퀀서를 사용하여 16S rRNA의 유전자 앰플 리콘 서열에 대한 접근은 상술된다. 환경 적 DNA 서열은 제 어댑터 및 바코드를 함유 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭된다. 그런 다음 에멀젼 PCR을 통해 구형 입자에 결합된다. 입자 리터 아르일회용 칩 oaded 및 칩 시퀀싱이 수행 된 후, 시퀀싱 기계에 삽입된다. 시퀀스는, fastq 형식으로 검색 필터링 및 바코드는 읽기의 샘플 구성원을 설정하는 데 사용됩니다있다. 다음 더 공개적으로 사용할 수있는 도구를 사용하여 분석 읽기 여과하고 비닝. 읽기 예 분석 Mothur가 주어진 소프트웨어 패키지 내의 분류법 탐지 알고리즘으로 분류 하였다. 여기에 설명 된 방법은, 간단하고 저렴 간단하며 지속적인 게놈 혁명에서 활용할 작은 실험실을 도와야한다.

겔 정제 한 후, PCR 증폭을 25 사이클과 함께, 증폭 산물은 물 50 μL에 겨 0.2-10.0의 농도에서 일반적이다. 이는 출발 DNA 농도, 시료의 종류와 정제 키트에 따라 광범위하게 변할 수있다. 이것은 모든 샘플주기 동일한 번호를 사용하여 증폭한다 명심 키메라 형성을 방지하고 증폭 편견을 줄이기 위해 가능한 최저로 PCR 사이클의 수를 유지하도록 권장한다. 클론의 수를 판독하고, 비어있는 분야를 최소화 그리고 읽기 수를 최대화하기 위해, 큐 비트 비율, 평균 출력은 약 0.1과 0.3 FAM 형광은 이온 런트 PGM에 314 칩을 사용하여 (200) 이상이어야 사이 여야 36 다중화 싸다 함유 실행하기위한 절차의 각 단계 후에 판독 중 0.3-0.5 M 양질 Mothur에서 결과의 필터링 후에 판독한다. 표 2 번호의 전형적인 파괴를 도시정신 시료는 프라이머 16S의 V3-4 영역을 대상으로하고 Mothur를 이용하여 분석하여 증폭. Mothur에서 trim.seqs 절차 품질 필터 및 이유와 함께 품질이 필터를 통과하지 않은 서열을 포함하는 &quot;* .scrap.fasta를&quot;전달 시퀀스를 포함하는 &quot;* .trim.fasta&quot;파일을 생성 시퀀스 헤더의 거부. &quot;올리고&quot;파일에 바코드와 함께 제공되는 경우,이 명령은 또한 바코드 순서에 따라 모든 시퀀스의 그룹 구성원을 포함하는 &quot;* .groups&quot;파일을 생성합니다. classify.seqs 절차는 Excel에서 열 수있는 &quot;.tax.summary&quot;를 생성합니다. 이 파일은 (열)에 각 시료 (라인) 분류학 소속 요약을 포함한다. 이 파일은 하류 통계 분석에 사용할 수있는 다양한 분류 수준에서 커뮤니티 조성물을 시각화. &quot;.taxonomy&quot;파일은 상세한 분류를 포함각 시퀀스에 대한 제휴 나. 모든 샘플 (36)에 걸쳐 분류학상의 문 / 클래스 레벨에서 평균 커뮤니티 조성물은도 1에 도시된다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> 모든 샘플에서 분류학상의 문 / 클래스 수준에서 1 평균 공동체 구성을 그림. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> 앞으로 </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> 바코드 </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> Mothur에서 사용하기위한 실시 예를 표 1 &quot;올리고&quot;파일. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> #의 읽기 </td><td style="width:123px;"> 이전 단계의 % </td><td style="width:107px;"> 평균. 샘플 당 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> 우물의 수 </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> 구슬 웰스 </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20 % </td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> 템플릿 비즈 </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90 % </td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> 단일 클론 구슬 </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30 % </td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> 좋은 품질 읽기 (시퀀서에서 출력) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60 % </td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> 패스 Mothur 필터 (분. 평균. 50bp의 창을 통해 20의 품질 평가 점수, 최소. 150bp의 길이) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60 % </td><td align="center"> 10338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes의 분류학상의 문 수준에서 분류 (50 % 신뢰 한계) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90 % </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes에서 가족 수준에서 분류 (50 % 신뢰 한계) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50 % </td><td align="center"> 8792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> GreenGenes에 속 레벨에서 분류 된 (50 % 신뢰 한계) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60 % </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> 한 이온 토렌트 314 칩에 멀티 플렉스 (36) 환경 시료의 일반적인 실행에서 생성 된 읽기 표 2 수.

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Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

83.1K 조회수.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

연구

생물학

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

모기 내장 Metagenomic RNA-seq에 대한 Ribosomal RNA의 고갈

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...