유전 공학은 간 발생으로 알려진 과정에서 모델 유기체의 게놈을 수정하는 데 사용되는 귀중한 도구입니다. 발달 생물학에서, 이 접근은 살아있는 조직에서 구상될 수 있는 수정한 유전자를 표현하기 위하여 수시로 이용됩니다. 대안적으로, 유전 공학은 특정 유전자의 발달 기능을 연구하기 위하여 단백질 발현을 방지하거나 중단하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 비디오는 이 기술의 원리를 요약하고, 일부 유전 공학 절차를 검토하고, 이러한 기술이 실험실에서 사용되는 방법을 강조합니다.
먼저, 과기 생성의 근본적인 몇 가지 중요한 개념을 살펴보겠습니다. 이것은 모형 유기체의 게놈으로 DNA의 삽입을 관련시킵니다. 연구 목표에 따라 여러 가지 접근법이 있습니다.
첫째, 변경된 유전자의 추가는 돌연변이 때문에 기능성 또는 형태학적 변경을 드러낼 수 있습니다. 또 다른 방법은 종종 돌연변이만큼 손상 될 수있는 과발현의 효과를 연구하기 위해 변경되지 않은 야생 형 유전자의 추가 복사본에 넣는 것입니다. 다른 접근법은 살아있는 동물에서 유전자 발현의 위치 그리고 타이밍을 추적하기 위하여 녹색 형광 단백질과 같은 시각적인 태그를 포함하는 융합 단백질을 삽입하는 것입니다.
게놈에 삽입될 DNA의 세그먼트는 원하는 발현 패턴 및 결과를 생성하기 위하여 주의 깊게 설계되어야 합니다. 유전자가 발현되는 시기와 위치를 지시하는 서열 원소인 프로모터는 중요한 구성 요소입니다. 특정 프로모터는 거의 모든 조직에 걸쳐 유비쿼터스로 표현되며 다른 프로모터는 특정 조직에서만 활성화됩니다. 화학 적 투여 또는 고온에 노출에 의해 활성화되는 유도 성 프로모터는 유전자 발현의 타이밍을 조절하는 데 사용할 수 있습니다.
조직에서 안정적으로 표현되려면, 트랜스진은 먼저 게놈에 통합되어야 합니다. 이를 달성하기 위해, 전장은 유기체의 게놈의 지역을 일치하는 측면 DNA 서열을 포함할 수 있습니다. 이를 통해 균동재재조합으로 알려진 공정을 통해 전주 DNA와 통합할 수 있다. 대안적으로, 트랜스포손이라고 불리는 일부 종특수원소에서는 게놈내로 의한 트랜스진의 무작위 삽입을 촉매하는 효소 트랜스포사아제에 대한 인식 부위를 포함시킴으로써 전염을 보다 효율적으로 만들 수 있다.
이제 트랜스진 디자인의 몇 가지 기본 을 알고 있으므로 형질 전환 동물을 만드는 방법을 살펴보겠습니다. 유전자 생성을 하려면 PCR을 사용하여 관심 유전자를 증폭시키는 것으로 시작합니다. 이 증폭 된 영역은 그 때 세포로 질질질 수 있는 DNA의 조각인 벡터로 복제됩니다. 벡터는 전형적으로 대장균과 같은 박테리아를 사용하여 효율적인 유전자 증폭을 허용하는 요소를 포함합니다. 이러한 증폭 단계 후, 벡터는 세균 배양으로부터 정제된다.
트랜스제닉 동물은 정제된 DNA를 배아에 주입하여 만들어집니다. 물고기와 개구리에서, 구조는 일반적으로 1 세포 단계 배아의 노른자 또는 세포질로 직접 주입됩니다. 트랜스포슨 매개 트랜스게네시스의 경우, 트랜스포지효소를 인코딩하는 전사체가 주사 혼합물에 첨가된다.
마우스에서는, 과기 생성은 정자와 계란 pronuclei가 아직 융합되지 않은 새로 수정한 계란의 조작에 의해 달성될 수 있습니다. 상기 구조는 세포가 분열될 때 게놈으로 통합될 수 있는 더 큰 프로뉴클레우스로 직접 주입된다. 계란은 그 때 발달을 위한 의사 임신한 여성의 자궁으로 이식되어야 합니다.
제네시스 의 효율성은 다양하므로 동물이 게놈에 성공적으로 통합된 자손을 식별하기 위해 검사를 받아야 합니다. 이것은 쉽게 식별을 위해 삽입된 형광 태그를 찾고, 또는 작은 조직 조각에서 분리된 게놈 DNA의 PCR와 같은 분자 분석을 통해 서 행해질 수 있습니다.
유전 공학에 대한 두 번째 접근법은 유전자 기능을 방해하기 위해 특정 유전자 표적화에 초점을 맞춥니다. 이 목표를 달성하기 위한 여러 가지 방법이 있습니다. 게놈 편집으로 알려진 1개의 상대적으로 새로운 방법은, DNA 백본을 삭감하고 DNA가 복구될 때 유전자에 있는 돌연변이를 일으키는 원인이 되는 핵효소에게 불린 순서 특정 효소를 이용합니다.
또 다른 표적화 방법은 재조합으로 알려진 효소에 대한 인식 서열에 의해 측면유전자 또는 유전자의 사본으로 유전자를 대체하기 위해 상동성 재조합의 사용을 포함한다. 재조합이 존재할 때, 측면 서열은 게놈에서 절제될 것이다. 이는 조건부 녹아웃으로 알려져 있으며, 유전자 절제의 조절은 특정 조직 또는 특정 시점에서 효소를 표현함으로써 달성될 수 있다.
동종 재조합에 의해 녹아웃 마우스를 생성하기위한 일반적인 절차를 검토 할 수 있습니다. 여기서, 게놈 DNA 서열의 일부가 외국 DNA로 대체되는 구조를 준비해야 한다. 이 DNA는 수시로 나중에 단계에서 성공적으로 수정된 세포를 선택하는 쪽을 제공하는 항생 저항과 같은 또 다른 유전자를 인코딩합니다.
절차를 시작하기 위해 배아 줄기 세포는 발아세포로 알려진 초기 마우스 배아의 내부 세포 질량에서 수집됩니다. 선형화된 구조는 전기 펄스가 세포막에서 일시적인 모공을 생성하는 전기 포공을 통해 줄기 세포로 전달됩니다. 세포는 그 때 간질 없이 세포를 제거하기 위하여 항생제의 존재에서 배양하는 것을 허용됩니다.
이 선택 단계 후에, 줄기 세포는 배반구 단계에서 다른 마우스 배아로 주입될 수 있다. 배아는 그 때 발달을 계속하기 위하여 여성 마우스의 자궁으로 옮겨됩니다. 결과 새끼는 야생 형 과 녹아웃 세포로 구성된 키메라가 될 것입니다. 몇몇 키메라는 그들의 생식선 안에 녹아웃 세포가 있을 것이고, 그 때 그 때 새로운 녹아웃 라인을 설치할 때 중단한 유전자를 전송할 것입니다.
당신은 개발 모델의 유전 공학의 기초를 배웠습니다, 그래서 지금 몇 가지 실용적인 응용 프로그램을 살펴 보자.
발달 연구는 종종 세포를 식별하고 개발을 연구하기 위해 형광 태그 단백질을 사용합니다. 조직 별 프로모터를 사용하여, 형질 성 유기체는 신경 문장 같이 특정 세포에 있는 형광 단백질을 표현하기 위하여 설계될 수 있습니다. 고급 이미징 기술을 사용하여 형광 세포를 실시간으로 이미지화할 수 있으므로 연구자들은 복잡한 발달 이벤트를 직접 시각화할 수 있습니다.
유전 공학의 또 다른 중요한 사용은 특정 유전자와 질병 표현형에 있는 그들의 역할을 공부하는 것입니다. 여기서, 표적 돌연변이는 탈론과 같은 뉴클레아제들을 사용하여 특정 마우스 유전자로 도입된다. PCR은 마우스가 돌연변이된 유전자의 0, 하나 또는 2개의 사본을 가지고 있는지 여부를 보여줍니다. 2개의 돌연변이 사본을 운반하는 태아는 지금 유전자의 발달 기능을 결정하기 위하여 상세히 공부될 수 있습니다.
조건부 녹아웃을 사용하여 과학자들은 제한된 세포 세트 내에서 유전자의 기능을 결정할 수 있습니다. 여기서, loxP 측측면 유전자는 전체 배아 전반에 걸쳐 발현되었지만, Cre는 내피 세포에서만 발현되어 심장과 혈관에 유전자 삭제를 일으켰다. 이 조직 특정 녹아웃은 배아 심박수에 있는 측정가능한 변경을 초래하고, 전체 유기체를 바꾸지 않고 유전자의 현지화된 역할을 시험하는 방법을 보여줍니다.
당신은 방금 JoVE의 트랜스제닉 기술에 대한 소개를 지켜보았습니다. 이러한 기술은 유전 공학의 기초, 관련된 방법 중 일부 및 일상 과학에 적용되는 방법을 이해하는 데 도움이됩니다. 유전 공학은 많은 유기체에 널리 적용될 수 있고, 발달 질병에서 유전학의 역할을 공부하고 이해하기위한 중요한 도구가 될 것입니다, 뿐만 아니라 성인기 동안 나타나는 그. 시청해 주셔서 감사합니다!
