Name: generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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이 작품은 미국 암 학회 (American Cancer Society) 연구 학자 그랜트 (RSG-12-148-01-DDC) 및 CIRM 기본 생물학 상 (RB4-05779) supportedby했다.

인간의 피부 프로토콜 캘리포니아 대학, 샌디에고의 연구 윤리위원회의 지침에 따라 수행 하였다. 인간의 피부는 폐기 수술 샘플에서 얻은 또는 (피부 은행이 소재 / 장비의 표에 나와있는) 피부 은행에서 구입하실 수 있습니다. 피부 또는 기증자의 나이 파생 위치는 실험만큼 진피의 기저막 영역 단백질 (콜라겐 / 라미닌)에 중요하지 않은 것은 성능이 저하되지 않습니다. 약화 된 인간의 진피 1. 준비 <ol><li> 인간의 피부를 수신하면, (~ 3-5 분) 해동 조직 배양 후드에서 조직을 배치. 피부의 크기에 따라, 일회용 무균 50 ㎖ 원뿔형 튜브 또는 125 ml의 용기에 해동 조직을 배치. 피부 은행에서 피부의 전형적인 크기는 0.75 평방 피트입니다. </li><li> 1X PBS에서 4 배 페니실린과 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄 구균)와 75 %의 전체 컨테이너를 채 웁니다. 격렬하게 흔들어5 분 및 액체 폐기하십시오. 이 단계를 3 번​​ 이상 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 후, 새로운 튜브 / 병에 조직을 전송하고 컨테이너의 75 %를 채우기 위해 신선한 배 펜 / 패 혈성 / PBS를 추가합니다. 2 주부터 표피 진피의 분리를 허용하기 위해 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서이 혼합물을 배양한다. </li><li> 무균 조건에서, 진피에서 표피를 벗겨 집게를 사용합니다. 표피는 기증자 (그림 1A)의 인종에 따라 색상이 반면 진피는 완전히 흰색입니다. 인체 조직을 다루는 기관의 프로토콜에 따라 표피를 폐기하십시오. </li><li> 관 또는 병에 진피를 놓고 (4 시간 5 분 세척) 활발한 진탕 1X PBS에 희석 배 펜 / 연쇄상 구균에 씻는다. 마지막 세척 후 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 4 배 펜 / 1X PBS에 희석 연쇄 구균과 상점에서 새로운 튜브 / 병에 진피를 전송합니다. 진피 년까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></OL&gt; 2. 유전자 수정 기본 인간의 각질 형성 세포 주 : 차 인간 각화 세포를 감염 바이러스를 생산하기 위해 완벽한 DMEM 배지 [DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FBS) + 펜 / 연쇄상] 재배 사용 amphotropic 피닉스 세포. 이러한 개그-POL 및 봉투와 같은 단백질을 인코딩 바이러스 성 포장 유전자가 안정적으로 레트로 바이러스 벡터로 형질 전환 된 경우 바이러스 생산을 허용 피닉스 세포 게놈에 통합되어 있습니다. 피닉스 세포 고효율 높은 역가의 바이러스 생산을위한 형질 허용 될 수있다. 이 포장 라인에서 생산 된 바이러스는 인간을 포함한 포유 동물 세포의 큰 다양성을 감염시킬 수 있습니다. <ol><li> 1 일 : 형질 전날, 완전한 DMEM 매체 잘 당 800,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 피닉스 세포. </li><li> 주 2 : 형질의 날, 3 레트로 바이러스 벡터의 μg의 당을 잘 사용합니다. 1.5 ML 튜브에 레트로 바이러스 벡터의 나누어지는 3 μg의. 100 μ의 혼합을 사​​용하여; L의 DMEM 플러스 벡터의 모든 3 μg의에 대한 형질 전환 시약의 6 μL. 1.5 ML 튜브에 100 μL의 DMEM으로 형질 전환 시약의 6 μl를 섞는다. (사용되는 레트로 바이러스 벡터는 장비 / 재료 표에 나와 있습니다). <ol><li> 5 분 동안 인큐베이션 및 레트로 바이러스 벡터를 함유하는 3 μg의 사전 분취 튜브에 106 ㎕의 혼합물을 추가한다. 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. 피닉스 세포의 각 웰이 전체 혼합물의 적가를 추가합니다. </li></ol></li><li> 주 3 : 형질 전환 후 날, 피닉스 세포에서 미디어를 제거하고 신선한 완전한 DMEM 배지 2 ㎖를 추가합니다. 같은 날에, 웰 당 75,000 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 차 인간 각화 세포를 시드. 항생제와 각질 세포의 무 혈청 배지 (KCSFM) (펜 / 연쇄상 구균)에있는 각질을 유지한다. 참고 : 1 차 인간의 각질 세포가 구입 하였다. 세포 (소재 / 장비의 표에 나와있는) 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 주 4 : 하르지금은 바이러스 입자를 포함하는 형질 전환 피닉스 세포에서 용지를 가득. 주사기를 사용하여 0.45 μm의 필터를 통해 미디어를 전달 (모든 오염 피닉스 세포를 제거하기 위해) 및 각질 형성 세포에 2 ml의 배치 (전날 / 잘 75,000 세포에서 도금 : 단계 2.3 참조). 감염 과정을 중재하기 위해 언론에 hexadimethrine 브로마이드 (5 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 바이러스 역가는 ~ 1 × 10 7 TU / ㎖이다. <ol><li> RT에서 1 시간 동안 200 XG에서 원심 분리기에서 6 웰 플레이트 스핀. 스핀 후, 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하고 KCSFM를 추가하기 전에 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 제 5 일 : 단계를 다시 2.4로 각질 세포의 동일한 배치를 감염. 참고 : 레트로 바이러스 벡터의 선택 마커가있는 경우 약물을 사용하여 각질을 선택하고 다운 스트림 분석 또는의 Organotypic 문화 등의 용도로 확장합니다. </li></ol> 3. 피부의 Organotypic 문화를 설정 <ol><li> 구축일반 실험실에있는 자료 또는 카세트에서의 Organotypic 카세트 사용자 정의 금속 제조 가게를 통해 할 수있다 (그림 2A - F). 3.5 cm 조직 문화 판에서 이러한 카세트를하려면, 3.5 cm 접시 (그림 2A-B)의 뚜껑의 중심에서 1.0 cm X 1.0 cm 사각형을 제거하는 소작을 사용합니다. 무균 상태에서이 작업을 수행합니다. <ol><li> 명확한 매니큐어 (그림 2C)를 사용하여 카세트 (3.5 cm 접시의 뚜껑)의 바닥에 사각형 못을 연결합니다. 매니큐어 5 분 건조하고 광장 못 (그림 2D)에 쉬고되도록 카세트를 뒤집어하도록 허용합니다. 6cm 접시에 카세트를 놓습니다. 참고 : 광장 예술과 공예 상점의 다양한에서 구입하실 수 있습니다 쐐기. </li></ol></li><li> 각질 세포 성장 배지 DMEM 66 %, 22 %, 햄 F12, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % FBS, 2.67 μg의 / ㎖ 아데닌 100 μg의 40 N로 구성된 (KGM)를 준비g / ㎖ 하이드로 코르티손, 10 NG / ㎖ 콜레라 독소, 4.94 / ㎖ μg의 인슐린, 5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 1.36 NG / ㎖ Triiodo-L-로닌, 10 NG / ㎖ EGF 및 10 μg의 / ㎖ 시프로플록사신 염산염. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 미디어를 필터링합니다. </li><li> 배 펜 / 연쇄상 구균 + PBS 용액에서 진피를 타고 KGM에서 2 회 반복 한 후 사용하기 전에 이틀 동안 37 ° C에서 KGM에 품어. </li><li> 1.5 cm X 1.5 cm 크기의 조각으로 메스를 사용하여 진피를 잘라 다음의 Organotypic 카세트에 배치합니다. 이 위를 향하게하여 진피의 상부와 진피를 놓습니다. 진피의 정상은 각질 세포 (그림 1B)와 접촉하는면 될 것입니다. </li><li> (그림 3A)를 직면하고있는 진피의 상부면의 Organotypic 카세트의 사각형 구멍에 사전 컷 진피를 놓습니다. </li><li> 집게를 사용하여 위에 진피를 함유하는 전체의 Organotypic 카세트 (도 3b 플립). 얼음 외 기질 용액을 해동. 카세트 당 세포 외 기질 용액 100 μL를 그려 바늘과 주사기를 사용합니다. 진피 (광택면)의 바닥에 5 방울을 추가하고 진피 (그림 3B)에 걸쳐 고른 분포를 확인하기 위해 약간 흔들. </li><li> 상업 세포 외 매트릭스 솔루션을위한 5 분은 완전히 (그림 3C)를 공고히 할 수 있습니다. 응고 후, 다시 위에 카세트를 플립 집게를 사용합니다. 6cm 접시에 KGM의 4 ML을 추가합니다. </li><li> 진피 (그림 3D)를 포함하는의 Organotypic 카세트에 0.5-1000000 유 전적으로 변형 된 각질 세포를 놓습니다. <ol><li> 5 분 동안 10cm 플레이트에 0.05 % 트립신 4㎖를 배치하고 완전 DMEM 배지 4 ㎖로 급냉하여 각화 세포를 Trypsinize. </li><li> 혈구를 사용하여 각질 세포를 계산 한 다음 5 분 동안 200 XG에 스핀 다운. 재현 탁 0.5-1000000 세포는 90 μ로 (사용 가능한 셀의 수)에 따라그리고 KGM의 L은 진피에있는 모든 세포를 놓습니다. 주 : 재생 된 표피의 두께에 차이가 보이는 세포 수를 시작하는 차이에 의해되지 않도록 동일한 실험 진피 내에서 동일한 수의 셀을 배치하는 것이 중요하다. 진피에 미만 50 만 셀을 배치하면 가난한 계층화와 차별화 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 매일의 Organotypic 문화에 KGM 미디어를 변경합니다. 수확 조직 진피에 각질 세포의 배치 후 1-14일. 표피의 전체 계층화 및 분화는 일반적으로 5 일 후에 발생합니다. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

의 Organotypic 문화가 많은 장점을 제공하는 사람의 피부에서 유전자 조작은 일반적으로 2D를 배양 된 세포뿐만 아니라 마우스 모델을 공부합니다. 2D 배양 본래 조직 및 기관에서 발견 삼차원 세포 - 세포 및 세포 - 세포 외 기질의 상호 작용이 부족하다. 최근의 연구는 16 차 종양이 사람의 피부에 많은 유전자 발현 유사성을 보여주는 3 차원 배양 된 세포와 함께 배양 된 2D 및 3D 피부암 세포 ?...

인간 표피뿐만 아니라이 아니라를 보호하는 제 1의 방어선 수분의 손실을 방지하는 불 투과성 장벽 역할 기저막 zone.The 표피로 알려진 세포 외 기질을 통해 하부 진피에 연결 성층 상피이고 외국과 독성 물질 1 몸. 표피의 가장 깊은 층 인 기저층은, 표피 (2)의 나머지를 형성하는 분화 된 자손을 야기 표피 줄기 및 전구 세포를 포함한다. 상피 전구 세포는 분화 된 바와 같이 그들은 가시 층 (3)으로 알려진 분화 된 세포의 제 1 층을 형성하기 위해 위쪽으로 이동한다. 가시 층에서, 세포는 표피의 분화 층 물리적 응력을 견딜 수 있도록 강도를 제공 케라틴 1 내지 10의 발현에 차례. 가시 층 세포는 상기 차별화 된 바와 같이, 그들에 대한 표피의 위쪽으로 이동세포막 아래 조립 keratohyalin와 라멜라 과립의 형성뿐만 아니라, 구조 단백질을 특징으로 과립 층 미터. 세포 분화 과정에서 진행하는 라멜라 과립이 풍부한 층은 각질층 4라는 지질을 형성하는 셀로부터 압출되는 동안, 세포막 밑 단백질은 서로 결합 가교이다. 상피 세포 성장과 분화에 미치는 영향 ~ 인구 5의 20 %의 변화를 포함하는 질병. 따라서,이 과정의 기전을 이해하는 것이 매우 중요하다. 이 질병의 많은 표현이 세포 - 세포 또는 세포 - 매트릭스 접촉에 달려 있기 때문에, 인간의 표피가 3D 환경에서 재구성의 Organotypic 문화 6-10 만들어졌습니다. 이들 방법은 일반적으로 약화 된 인간과 같은 세포 외 기질에 파종 차 또는 변환 된 각화 세포의 사용을 포함진피, 마트 리겔, 또는 콜라겐. 표피 성장과 분화에 중요한 유전자 조절 기전을 이해하기 위하여 케 라티노 유전자 차원 배양 유전자 녹다운 또는 과발현하는 레트로 바이러스 벡터를 통해 조작 된 후 3D로 재구성 될 수있다. 이러한 방법은 종양 11-21 표피 줄기 및 전구 세포자가 재생과 분화뿐만 아니라 진행에 관여하는 유전자를 특성화하는 데 광범위하게 사용되어왔다. 여기서, 레트로 바이러스를 사용하여 배양 물에서, 표피의 Organotypic 유전자 발현을 변경하는 방법에 대한 심도있는 프로토콜이 제공된다.

<table><tbody><tr><td>Human skin</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&quot;&gt;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>amphotropic phoenix cell lines</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cautery</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 1 antibody</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>square pegs</td><td>Arts and crafts stores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>human neonatal keratinocytes</td><td>Cell Applications</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV retroviral vector</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS retroviral vector</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

의 Organotypic 문화 기능과 생체 조직의 대응의 생리를 모방 세포 - 세포 연락처 및 세포 - 기질 상호 작용에 중요한 3D 환경의 재구성 할 수 있습니다. 이 충실히 표피 분화와 계층화 프로그램을 되풀이되었습니다의 Organotypic 피부 배양을들 수있다. 기본 인간의 표피 각질 세포는 유전자가 쉽게 과발현 또는 무너 뜨렸다 수 있습니다 레트로 바이러스를 통해 유전자 조작 될 수 있습니다. 이러한 유 전적으로 변형 된 각질 세포는 유전자 전달 경로에 충격을 표피 성장, 분화, 및 질병 진행을 연구하는 모델을 제공하는 강력한의 Organotypic 피부 배양 인간 표피를 재생성하기 위해 사용될 수있다. 여기에 제시된 프로토콜은 약화 된 인간의 진피를 준비뿐만 아니라 유 전적으로 피부의 Organotypic 문화를 생성하기 위해 기본 인간의 각질 세포를 조작하는 방법을 설명합니다. 인간의 피부는 재생 downstr 사용될 수있다이러한 유전자 발현 프로파일, 면역 및 높은 처리량 시퀀싱 하였다 염색질 면역 침전 등 EAM 애플리케이션. 따라서, 이러한 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성은 피부의 항상성 유지에 중요한 유전자의 결정을하실 수 있습니다.

인간 피부의 Organotypic를 생성하는 첫 번째 단계는 표피 진피를 제거하는 것이다. 37 ° C에서 4X 펜 / 연쇄상 / PBS에서 피부의 2 주 인큐베이션 표피 (도 1a)에서 진피의 분리를 허용한다. 표피와 진피를 분리하는 것이 어려운 경우 다른 주 동안 4 배 펜 / 연쇄상 구균에 37 ° C / PBS에서 조직을 배치하고 다시 벗겨 집게를 사용해보십시오. 약화 된 진피에 인간의 표피를 ?...

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K 조회수.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

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A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

연구

암 연구학

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

발생학

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

생체공학

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

조류 배아 피부 이식 배양 프로토콜에 대한 종합적인 검토

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

저자 스포트라이트: 현재 실험적인 조류 피부 이식 방법론에 대한 통찰력

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

요약

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3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

개선 2D 및 3D 스킨

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

조직 패터닝 및 유기 형성을 연구하기 위해 조류 피부 이식물을 사용합니다.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

자가 조립 혈관 인체 피부 등가물의 생성