저자는 아네트 Blak 라 스무 센과 크리스틴 Moeller 그들의 기술 지원에 감사 하고자

건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부 샘플 컬렉션 호스트 기관에서 윤리 위원회 로부터 승인을 받아야 합니다. 이 프로토콜은 지역 윤리 위원회의 지역 Midtjylland, 덴마크 (M-20110027)에 의해 승인 되었다. 여기에 설명 된 메서드는 Maciaq 그 외 여러분 에 의해 비슷한 연구에서 파생 된 10 그리고 Liu와 Karasek11.
1입니다. 인간의 피부에서 Keratinocytes의 격리
<ol>
	<li>다음과 같은 솔루션을 제작 하 여 시작: DPBS에 0.25 %trypsin 및 0.1% 포도 당 50ml 솔루션. 믹스와 필터 소독 (0.2 µ m) 솔루션. RPMI-1640 + 2 %FBS 솔루션, DPBS 및 keratinocyte 혈 청 무료 매체 (KSFM)의 50 mL의 10 mL를 준비 합니다. KSFM의 500 ml KSFM 보충 및 gentamycin의 250 µ L를 추가 합니다. 미리 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C.</li>
	<li>건강 한 성인 지원자 성형 수술에서 피부를 수집 합니다. 피부 샘플 사용 하지만 약 10 cm x 15 cm, 크기에서 다를 수 있습니다. 냉각 요소를 포함 하는 스티로폼 상자에 피부 샘플을 운반 하 여 교통 아래 피부 차가운 유지. 필요한 경우, 피부 샘플 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	<li>소독, scalpels가 위와 집게를 사용 하 여 피부 섹션 아래에서 지방을 제거.</li>
	<li>바늘을 사용 하 여 접시 위에 무 균 커버에 피부 섹션 (약 10 cm x 15 cm) 버클. 첫째, 건조 멸 균된 거 즈 패드와 함께 피부를 청소. 다음 70% 에탄올으로 소독된 거 즈 패드를 사용 하 여 피부를 청소.</li>
	<li>발 평면을 사용 하 여, 피부 섹션의 상위 계층 (표 피)의 잘라 고 9 cm 배양 접시에에서 넣어. 다음, 즉시 페 트리 접시 (단계 1.1에서에서 준비) DPBS/트립 신/포도 당 솔루션의 25 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 배양 접시에서 DPBS/트립 신/포도 당 솔루션을 제거 하 고 RPMI 1640 + 2 %FBS 트립 신을 비활성화에 10 mL을 추가.</li>
	<li>두 개의 집게를 사용 하 여, 지금 분리 상피 세포 매체에 부드럽게 된다고 하 고는 표 피와 피부 부분의 피부 구획을 교 반 하십시오.</li>
	<li>표 피 세포 현 탁 액 (1 m m 구멍 크기), 금속 필터를 통해 필터링을 50 mL 튜브에 수집 합니다. FBS와 소용돌이 없이 RPMI-1640의 10 mL를 포함 하는 포함 하는 표 피 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 금속을 통해 서 스 펜 션 필터의 s. 필터 10 개 50 mL 튜브에 나머지 피부 섹션을 추가 합니다. 50 mL의 총 볼륨 DPBS를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션 실내 온도에 450 x g에서 10 분 원심</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 37 ° C KSFM 셀 펠 릿의 크기에 따라 약 10 mL에 상피 세포 pellet을 resuspend. Trypan 블루 얼룩 현미경 메서드를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 10 cm x 15 cm 피부 단면도에서 얻은 세포 수는 약 50-100 x 106 세포입니다. 각 75 cm2 문화 플라스 크를 37 ° C KSFM의 12 mL와 8 x 106 셀을 전송 합니다. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 flasks 흔들.</li>
	<li>Keratinocytes 100% 습도 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 품 어. 2 일 후에 세 번 매주 매체를 변경 합니다. 문화는 keratinocytes의 확산 속도 따라 약 2 주 후 70-80% 합칠 때 세포를 통과.</li>
</ol>
2. 뿌리고 Keratinocytes의
<ol>
	<li>인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 4.5 mL를 사용 하 여 75 cm2 문화 플라스 크에 대 한.</li>
	<li>매체는 셀에서 제거 하 고 4.5 mL/75 cm2 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.</li>
	<li>셀의 약 50%는 느슨하게 하면 부드럽게 손 풀고 나머지 셀에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 75 cm2 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 6 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 키를 누릅니다.</li>
	<li>린스 RPMI 1640 + 2%의 3 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 실내 온도에 450 x g에서 10 분에 대 한 셀 원심
	<ol>
		<li>KSFM (37 ° C) 10 mL에 수송과 셀 resuspend 셀을 계산 하 고 KSFM (37 ° C)의 20 mL와 150 cm2 문화 플라스 크에 3 x 106 셀을 전송. 부드럽게 셀의 균일 분배를 보장 하기 위해 문화 플라스 크를 흔들어. 문화는 (냉동 프로토콜 아래 섹션 3 참조) keratinocytes의 확산 속도 따라 약 4-6 일 소요 80-90% 합칠 때 셀을 고정 합니다. 적절 한 냉동된 주식을 생성 하 keratinocytes를 확장 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다. 동결 Keratinocytes의
<ol>
	<li>인큐베이터에서 37 ° C에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션의 적절 한 금액을 열. 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 9 mL를 사용 하 여 150 cm2 문화 플라스 크에 대 한.</li>
	<li>매체는 셀에서 제거 하 고 9 mL/150 cm2 문화 플라스 크는 셀에 0.05% 트립 신-EDTA 솔루션에 미리 예 열을 추가 합니다. 인큐베이터 (37 ° C)에서 문화 플라스 크를 놓고 셀 불기 시작 하는 경우 약 5 분 후 현미경 검사.</li>
	<li>셀의 약 50%는 느슨하게 하면 나머지를 완화 하기 위해 부드럽게 손에 대 한 문화 플라스 크를 했다. 그런 다음 비활성화는 트립 신에 150 cm2 문화 플라스 크를 RPMI 1640 + 2 %FBS (37 ° C)의 12 mL을 추가 하 고 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 발음 키를 누릅니다.</li>
	<li>린스 RPMI 1640 + 2%의 6 mL와 함께 문화 flasks FBS 50 mL 튜브에 추가. 4 ° c.에 450 x g에서 10 분 동안 관을 원심 매체 (KSFM + 10 %DMSO) 얼어 얼음 처럼 차가운 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>Resuspend KSFM + 10 %DMSO 셀 펠 릿, 셀, 및 표준 느린 냉동 cryopreservation 방법12를 사용 하 여 6 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 동결.</li>
	<li>사용할 준비가 될 때까지 액체 질소 (기상) keratinocytes를 저장 합니다.</li>
</ol>
4. 해빙과 동결된 Keratinocytes 경작
<ol>
	<li>빠르게 녹여 37 ° C 물 욕조에 적절 한 냉동된 튜브. 70% 에탄올을 사용 하 여는 cryovial의 외부를 청소. 문화 플라스 크에 세포 (약 15, 000 셀/cm2)의 적절 한 번호를 전송 하 고 즉시 문화 플라스 크를 미리 데워 진된 성장 매체 (KSFM)를 추가 합니다. 문화 플라스 크의 어떤 크기 든 지 실험의 설정에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>5 mL 문화 매체를 사용 하 여 25 cm2 문화 플라스 크에 대 한.</li></ol>셀 수 추가 문화 플라스 크는 세포의 성장을 기증자 기증자에서 다르기 때문에 다를 수 있습니다. 셀 100% 습도 및 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 품 어.
	<li>변경 후 2 일 매체 세 번 매주 신선한 미리 데워 진된 KSFM을 사용 하 여. 참고: 데이터 평균 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 분리 하는 세포의 95%는 keratinocyte 마커 cytokeratine-1413에 대 한 긍정적인 것을 증명 하고있다.</li>

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. 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O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li><li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+(MMP-1)+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes.">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li><li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes.">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li><li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. 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C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

. 저자는 충돌의 관심이 있다.

여기, 우리가 쉽게 기본 인간의 keratinocytes 성인 피부에서 분리 하는 방법과 생체 외에서문화를 설명 합니다. 이 모델의 표 피 세포 생물학, 조사에 대 한 광범위 한 응용 프로그램을 가질 수 있으며 연구자 피부 질병을 공부에 관심이 더 유용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜의 장점 중 일부입니다 keratinocytes 신생아 남성 할례를 받고에서 얻은 신생아 포 피에서 ?...

피부는 인체의 가장 큰 장기 이며 외부 환경에 대 한 보호벽 역할. 피부는 두 가지 주요 레이어 구성: 진 피와 표 피, 표 피는 피부의 가장 바깥쪽 레이어를 구성 하는 곳. 표 피에서 가장 풍부한 셀 타입 keratinocytes 셀 대량1,2의 95% 이상으로 구성 된입니다. Keratinocytes는 표 피에 차별화의 다양 한 단계에서 유지 하 고 차별화3의 특정 단계에 해당 하는 기초, spinous, 세분화, 및 cornified 계층으로 구성 됩니다. Keratinocytes의 기본 기능은 외부 세계에 그대로 배리어를 생산 함으로써 표 피의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다.
Keratinocytes는 또한 피부에 병원 체에 대 한 방어의 첫 번째 줄을 대표 하 고 따라서 타고 난 면역 반응4,5에서 중요 한 역할. 외부 자극에는 keratinocytes의 노출 및 연속적으로, 세포내 신호 통로의 활성화 다양 한 cytokines, 발산, 및 항균 성 펩 티 드를 포함 하 여 다양 한 선 동적인 중개자의 생산 리드. 이러한 keratinocyte 파생 단백질 보충 하 고 활성화 하는 수지상 세포, 호 중구, 특정 T 세포6,7등 면역 세포 염증 반응에 참가. 따라서, keratinocytes 수많은 생물학 과정에 중요 한 역할을 하 고, 때문에 피부 생물학 공부를 생체 외에서 모델을 생성 하 뒤 여기에 제시 된 기술에 근거가 했다. 신생아 포 피에서 얻은 기본 keratinocyte 문화 자주 피부 생물학8,9공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 기술을 두 남녀에서 keratinocytes 셀의 높은 생물 다양성의 결과로 얻어진 다.
여기, 선물이 분리와 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 유지 보수를 포함 하 고는 keratinocytes의 동결. 이 방법의 전반적인 목표 생성 기본 인간의 keratinocytes 피부 생물학 생체 외연구 모델로 사용 될 수 있는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>KSFM supplements</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Supplements for KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimethyl sulfoxid</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Cell culture medium additive</td></tr><tr><td>Sterilization filter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Syringe filter with a pore size of 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Used to trypsinize cells</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>-</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Used to inactivate trypsin</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>-</td><td>-</td><td>Forceps from any company can be used</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>-</td><td>-</td><td>Scissors from any company can be used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Scalpels from any company can be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gauze pads</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Gauze pads from any provider can be used</td></tr><tr><td>Foot planer</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Foot planer from any provider can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Petri dishes from any provider can be used</td></tr><tr><td>Metal filter</td><td>-</td><td>-</td><td>In-house 1 mm hole size metal filter</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>NUNC</td><td>156499</td><td>-</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>TTP</td><td>90151</td><td>-</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Used to trypsinize cells when passaging</td></tr></tbody></table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

Keratinocytes의 주요 기능 표 피, 유지 하 고 외부 세계에 기계적인 방 벽의 구조적 무결성을 제공 하는 것입니다. 또한, keratinocytes 빠른, 일반적인 방식으로 항 원 자극에 응답 하는 타고 난 면역 체계의 부분이 되 고에 의해 개시, 유지 보수, 그리고 피 면역 반응의 규칙에서 필수적인 역할을 재생 합니다. 우리가 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 셀 칼슘 유도 터미널 차별화, 차별화 마커 involucrin의 증가 식에 의해 측정에 응답 입증 하 고. 또한, 우리는 고립 된 keratinocytes p38 MAPK 통로의 활성화에 의해 측정 된 세포내 신호 통로의 활성화 IL 1β 유도 반응 하 보여줍니다. 함께 찍은, 고립과 성인 피부에서 기본 인간 keratinocytes의 경작 하는 방법을 설명 합니다. Keratinocytes는 표 피에 우위 한 세포 종류 이기 때문에,이 방법은 피부 생물학 생체 외에서 분자 메커니즘 연구 유용 합니다.

칼슘 유도 터미널 차별화 인간의 keratinocytes 칼슘14,,1516치료 시 터미널 차별화를 받 다. 기본 인간 keratinocytes 고립 되었고 위의 프로토콜에 설명 된 대로 양식. 때 약 50-60% 합칠 셀 칼슘 (1.2 m m) 자극 했다 또는 0, 1 및 2 일에 차량 및 셀의 사진을 찍은. 그림 1 에서는 칼슘 자극 시 관찰 keratinocyt...

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Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한 모델

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.3K 조회수.  Aarhus University Hospital. 인간의 피부는 외부 환경에 대 한 방어의 첫 번째 줄 역할을 합니다. 우리는 성인 피부에서 기본 인간의 keratinocytes를 격리 하기 위한 방법을 제시. 이러한 격리 keratinocytes 수많은 실험 설정에 유용 하 고 공부 하는 분자 메커니즘 피부 생물학에 생체 외에서. 에 대 한 매우 적합 한 모델

비디오: Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

연구

발생학

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

생물학

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

생체공학

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

신경과학

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...