배아 줄기 세포, 또는 ES 세포는, 정규 성인 세포에서 그(것)들을 구별하는 유일한 속성의 다수가 있습니다. 따라서 과학자들은 이러한 특성을 유지하거나 활용하기 위해 특별한 배양 기술을 고안했습니다. 제대로 배양 할 때, ES 세포는 자신을 더 만들기 위해 무기한 분할 할 수 있습니다. 동시에, 배양 조건을 변경함으로써, ES 세포는 우리 몸에서 발견되는 거의 모든 세포 유형으로 분화하도록 지시 될 수있다; ES 세포의 이 능력은 "흉부"라고 합니다.
이 비디오에서는 ES 세포를 배양하고 통과하여 독특한 특성을 유지하는 방법, 특정 세포 유형을 형성하기 위해 ES 세포에서 분화를 유도하는 방법, 그리고 ES 세포 배양 및 분화 기술이 오늘날 연구자들이 사용하고 정제하는 방법을 배우게 될 것입니다.
ES 세포 유지 보수를 위한 절차의 세부 사항으로 들어가기 전에 먼저 ES 세포 분화를 방지하거나 구동하는 것을 이해하는 것이 중요합니다. ES 세포가 자발성 및 자기 재생의 고유 한 특성을 유지하기 위해, 그들은 자발적인 분화를 억제하는 성장 매체의 특정 요인으로 배양해야합니다.
이것은 일반적으로 "피더"의 층에 ES 세포를 배양하여, 일반적으로 마우스 배아 섬유아세포, 또는 MEFs에 행해냅니다. 피더 세포는 그들의 미분화 상태에서 ES 세포를 유지하는 것을 돕는 activin A와 같은 특정 요인을 ES 세포에 "공급"합니다.
최근 과학자들은 정의된 레시피에 필요한 인자를 가진 ES 세포가 미디어에서 자라는 피더가 없는 배양 방법을 개발했습니다. 이 접근법은 가변성을 감소시키고 임상 응용을 위한 전제 조건인 ES 세포 배양에서 비인간적인 성분을 제거합니다.
ES 세포의 또 다른 특징은 클러스터 또는 식민지에서 자연적으로 성장하고 단일 세포, 특히 인간 ES 세포로 해리될 때 생존율이 낮은 경향이 있다는 것입니다. 그 결과, 인간 ES 세포를 통과하는 것은 일반적으로 기계적 "따기"를 통해 그대로 덩어리로 유지해야합니다.
ES 세포가 비 부착 조건에서 성장할 때, 그들은 ES 세포가 모든 다른 세포 모형으로 분화하는 태아 바디, 또는 EBs로 알려져 있는 3D 집계를 형성합니다. 매체에 특정 성장 인자의 첨가와 같은 분화 조건을 변화시킴으로써 과학자들은 ES 세포 분화를 특정 세포 유형으로 유도하는 방법을 개발하고 있다.
이제 ES 세포 유지 보수 및 분화의 원리를 이해되었으므로 MEF 피더에서 ES 세포를 배양하고 통과하는 방법을 살펴보겠습니다.
MEF는 초기 단계 마우스 배아에서 얻어지며 화학 물질이나 방사선에 의해 비활성화되어 추가 분할을 방지합니다. 불활성화 된 MEFs는 ES 세포를 배양하기 전에 적어도 하루 전에 젤라틴 화된 조직 배양 접시에 도금되어야합니다. 피더가 완전히 정착되면 ES 세포가 해동되어 플레이트에 시드됩니다.
앞으로 며칠 동안, ES 세포는 큰 식민지로 성장할 것입니다. 식민지가 만지고 융합되기 전에 ES 문화를 통과시켜야 합니다. 하나는 그들이 분화의 흔적을 보여주는 지 확인하기 위해 ES 세포의 형태를 관찰해야합니다. 차별화된 세포는 둔하고 불규칙한 모양의 "조약돌"처럼 보이지만, 미분화 된 ES 식민지는 일반적으로 잘 정의되고 균일하게 보입니다.
식민지가 70% 이상의 차별화를 보여주거나 희소한 경우, 기계적으로 미분화된 식민지를 잘라서 새로운 피더 플레이트로 옮기는 경우. 그렇지 않으면, 단순히 차별화 된 지역이나 식민지를 제거하고 통과진행.
분화된 식민지가 정리되면 콜라게나아제와 같은 프로테오리틱 효소가 첨가되어 적절한 시간 동안 37°C의 배양으로 플레이트에서 세포를 들어 올립니다. 신선한 ES 매체가 추가되어 효소 반응을 중지합니다. 식민지는 기계적으로 접시에서 빠져 나와 원심분리기 튜브로 옮겨져 부드러운 파이펫팅으로 원하는 크기로 분해됩니다. ES 세포는 원심분리에 의해 수집되고, ES 매체에서 재중단되고, 준비된 피더 플레이트에 도금된다.
ES 세포를 통과하는 방법을 배운 후, ES 세포를 배아 체로 분화하는 데 사용되는 일반적인 기술 중 하나를 살펴 봅시다- 매달려 있는 방울 방법.
우선, ES 세포는 콜라게나아제와 같은 프로테오리틱 효소의 도움으로 분리되고, 계보 특이적 분화 인자를 포함하는 매체에서 원하는 농도로 희석된다. ES 세포 현탁액은 세균페트리 접시의 뚜껑에 방울로 증착됩니다. 뚜껑은 빠르게 반전되어 접시에 놓이기 때문에 미디어 방울이 거꾸로 매달려 배아 체가 발달할 수 있습니다.
약 이틀 후, EB를 가진 방울을 더 배양하기 위해 비 부착 판에 수집하고 도금될 수 있습니다. 원하는 세포 혈통에 적합한 시점에서, 배아 체는 추가 분화를 위해 젤라틴 부착 조직 배양 접시에 다시 도금된다.
이제 ES 세포를 배양하고 차별화하는 기본 기술을 다루었으니 특정 실험적 요구에 맞게 어떻게 조정되는지 살펴보겠습니다.
앞서 언급했듯이, ES 세포는 상이한 배양 조건 하에서 특정 세포 유형으로 분화하도록 지시될 수 있다. 이 실험에서 과학자들은 인간 ES 세포에서 운동 뉴런을 생산했습니다. 이것은 신경 혈통으로 그(것)들을 지시하는 태아 바디를 분화하는 요인을 처음으로 추가해서 행했습니다, 화학제품 및 도금 조건다음 이 세포를 모터 뉴런으로 구체적으로 바꾸는. 유사한 접근을 사용하여, 연구원은 리듬으로 심장 근육 세포를 치기로 ES 세포를 분화에 성공했습니다.
ES 세포를 분화하는 것은 태아가 자연적으로 발전할 때 생기는 사건을 모방하기 때문에, 우리는 또한 초기 배아 발달의 생물학을 조사하기 위하여 그(것)들을 사용할 수 있습니다. 연구되는 현상 의 한개는 X 염색체 불활성화, 또는 XCI, 2개의 X 염색체 의 한개가 여성 포유동물의 각 세포에서 침묵되는 결정적인 프로세스입니다. 과학자들은 특정 RNA와 단백질의 분포를 개발 중인 EB의 분포를 시각화함으로써 XCI의 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 얻었습니다.
마지막으로, ES 세포 실험의 일관성과 효율성을 높이기 위해 과학자들은 ES 세포를 배양하기 위해 더 나은 기술을 고안하기 위해 지속적으로 노력하고 있습니다. 한 가지 접근법은 비콜로니식 단층 배양 또는 NCM이라고 하는 단일 층에서 ES 세포를 성장시키는 것입니다.
인간 ES 세포가 3D 집계로 성장하지 않을 때 불행해지는 경향이 있다는 것을 기억하십니까? 과학자들은 ROCK 억제제로 알려진 화학 물질이 단세포 현탁액으로 통과되고 고밀도로 도금될 수 있도록 해리된 ES 세포의 생존을 증가시키는 것으로 나타났습니다. NCM 기술의 장점은 모든 세포가 배지의 성장 인자와 영양소에 더 동등하게 노출되어 배양 내의 이질성을 감소시키면서 많은 수의 ES 세포를 쉽게 성장시킬 수 있다는 것입니다.
배아 줄기 세포를 배양하고 분화하는 방법에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 그들의 미분화 상태에서 ES 세포를 유지하는 데 중요한 요인이 무엇인지 알아야하며, ES 세포 흉통을 활용하여 접시에 특정 세포 유형을 생성하는 방법을 알아야합니다. 앞으로 과학자들은 재생 의학 응용 분야에서 사용할 수있는 전문 세포 유형을 생산하기 위해 보다 효율적이고 잘 정의 된 배양 및 분화 조건을 개발하기 위해 노력할 것입니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
