This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 유럽 협약 (123) / 유럽 의회 및 지침 6백9분의 86 / EEC와 일치 발라 돌 리드 대학 동물 주택 시설에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 처리되고있다. 쥐 해마 신경 세포의 1. 단기 및 장기 문화 <ol><li> 폴리 D 라이신의 제조, 12mm 커버 글라스 코팅. <ol><li> 최소 24 시간 동안 에탄올에 12mm 직경 커버 글라스를 소독. 그들이 멸균 조건에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> 페트리 접시에 파라 필름의 스트립에 커버 슬립을 배포합니다. 1 ㎎ / ㎖ 폴리 D 라이신 200㎕의 각 커버 슬립의 표면을 커버. O / N 치료를 허용합니다. </li><li> 다음 날은 멸균 조건에서 90 분 동안 두 번 증류수 멸균 수로 매 15 분을 커버 슬립을 씻는다. </li><li> 로 Neurobasal 문화 매체의 500 μL와 네 잘 multidish 판을 채우기 당 잘. 로 Neurobasal 문화 매체는 보충해야한다10 % 소 태아 혈청, 2 % B27, 1 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 및 2 mM L- 글루타민. </li><li> multidish 판에 커버 슬립을 놓습니다. 사용할 때까지 가습 37 ºC 5 % CO 2 배양기에서 그들을 유지합니다. </li></ol></li><li> 신생아 쥐에서 해마 신경 세포의 분리. <ol><li> 멸균 조건 하에서 바이알 (20 μL / ml)에 1.8 ml의 파파인 용액을 (직접 구입) 제조 : 20 μL의 최종 농도를 얻기 위해 / 1.8 ml의 행크의 플러스 0.6 %의 BSA로 40 μL 파파인 추가 ㎖ (μL 계산되어야 ) 공급 업체의 조건에 따라. 행크의 0.6 %의 BSA가 4 % 소 혈청 알부민의 15 ㎖의 HBSS 배지 85 ml를 혼합하여 제조된다 (BSA, 100 ㎖의 HBSS에 BSA 4g을 해결 제조). 멸균 후드를 준비합니다. </li><li> 사용하기 전에 37 ºC에서 30 분 동안 행크의 플러스 0.6 % BSA의 파파인을 품어. 사용 전에 0.22 μm의 필터를 사용하여 용액을 필터. </li><li> 둘 베코의 추가하여 햄의 F-12 매체를 준비두 번 증류 멸균 물 900 ㎖에 이글의 중간 분말 (L 당 13.5 g)을 수정. 이어서 6g의 HEPES 및 336 밀리그램의 NaHCO3를 추가하고 NaOH로 4 N.은 1 L의 용액을 얻었다와 0.20 μm의 폴리 에테르를 사용하여 필터링하기 위해 멸균 물을 첨가하여 7.42으로하여 pH를 조정 (PES)은 상부 필터 병. 멸균 후드에이 과정을 수행. 마지막으로 사용하기 전에 멸균 조건에서 이산화탄소와 솔루션을 포화. 쇼핑몰 솔루션 4 ºC에서 그들을 냉장 사용합니다. </li><li> 잘린 신생아 (P0) 쥐의 새끼를 안락사 및 멸균 HBS 매체에 머리를 씻는다. 멸균 가위의 도움으로 두개골을 엽니 다. 주걱으로 뇌를 추출하고 햄의 F-12 매체에 신속하게 씻는다. </li><li> 각 반구 (도 1b)의 메스의 도움으로 대각선 절단을하고, 햄 F-12 배지를 함유하는 페트리 접시로 나른다. </li><li> 해부 포셉의 도움과 돋보기 아래 신중하게 폐기 수막. </li> &lt;리&gt; 돋보기를 사용하여 피질을 통해 특성 오목 위치에 해마를 확인합니다. 그런 다음, 하나의 국경에서 조심스럽게 잡아 당겨 눈 가위를 사용하여 위치에서 제거하여 피질에서 해마를 분리합니다. </li><li> 멸균 행크의 매체 칼슘이 부족 2+ 및 마그네슘 2 + 플러스 0.6 % BSA로 가득 4 웰 플레이트에 해마 조직을 전송하고 해마 조직을 씻는다. 제거하지 않고 미디어는 같은 눈 가위를 사용하여 작은 조각의 조직 (2 × 2 약 mm)를 절단. </li><li> 1.8 ml의에게 사전 필터링 파파인 솔루션을 포함하는 유리 병에 해마 조각을 전송합니다. 그리고 가끔, 부드러운 흔들림 37 ºC에서 그들을 품어. 15 분 후 (최종 50 μg의 / ㎖)의 DNase I 솔루션의 9​​0 μl를 추가하고 15 추가 분 동안 품어. </li><li> 10 ML의 원심 분리기 튜브에 조직을 전송하고 신선한로 Neurobasal 문화 매체와 조각을 씻는다. 5 ml의 플라스틱 핍을 통해 조직의 조각을 전달하여 세포 현탁액을 얻기두기가. </li><li> 5 분 160 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 플라스틱 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고로 Neurobasal 문화 매체의 1 ml의 피펫을 자동화 1 ㎖로 조심스럽게 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포 밀도를 측정한다. 노이 바 우어 챔버 위에 유리 커버 슬립을 넣습니다. 세포 현탁액의 10 μl를 추가합니다. 세포 현탁액이 균일하고 기포을하지 챔버를 입력해야합니다. 현미경 하에서 세포의 개수를 계산하고 30 × 103 세포를 함유하는 40-80 μL의 적합한 방울을 구하는 대응 계산을 수행한다. 세포의 총 수는 사용 된 동물의 수에 의존 할 것이다. </li></ol></li><li> 단기 및 래트 해마의 신경 세포의 장기 배양. <ol><li> 각각 약 50 μL의 드롭 약 30 × 10 3 세포로 Neurobasal 문화 매체의 500 μl를 포함하는 네 잘 multidish 접시 위에 전에 준비 인큐베이터, 판에 보관물론 하나의 폴리 D 라이신 코팅 된 12mm 직경의 유리 커버 슬립 함유 multidish 플레이트. </li><li> 문화를 변경하지 않고 실험 전에 체외에서 2-5일 (DIV, 단기, 젊은 문화) 또는&gt; 15 DIV (장기, 노인 문화)에 대한 가습 37 ºC 5 % CO 2 배양기에서 차 해마 세포를 유지 메디아. </li></ol></li></ol> 세포질 칼슘 2. 형광 이미징 2+ 농도 <ol><li> 형광 이미징을위한 테스트 솔루션의 준비. <ol><li> 염화나트륨 (145), KCl을 5의 MgCl 2 1, 염화칼슘 (2) (1), 포도당 (10), 나트륨 HEPES 10 (PH 7.42) : MM에 포함하는 외부 HEPES 완충 식염수 (HBS) 솔루션을 준비합니다. </li><li> 염화나트륨 (146), KCl을 5, 포도당 CaCl2를 1, 10, HEPES 10 (PH 7.42) : MM에 포함하는 외부의 Mg 2+ - 무료, HEPES 완충 식염수 (HBS) 솔루션을 준비합니다. </li><li> FINA에서 NMDA의 Mg 2+ - 무료에, HEPES 완충 식염수 (HBS)를 해결100 μM의 L 농도가 10 μM 글리신과 함께 보충. </li><li> (단위 : mm)에 의해 해결 NaCl 대신 KCl을 함유 HBS 용액을 제조 하였다 : 145의 KCl, 1의 MgCl 2, CaCl2를 1, 10, 10 HEPES (PH 7.42)를 글루코스. </li></ol></li><li> 형광 칼슘 프로브 fura2 / AM와 해마 세포의로드. <ol><li> 인큐베이터 해제 된 커버를 포함하는 세포 배양을 가지고 500 HBS의 μL 당 우물을 포함하는 새로운 4 웰 multidish 플레이트로 전송하여 실온에서 HBS 매체를 씻는다. </li><li> fura2와 세포를 품어 / 어두운 곳에서 실온 (25 ° C)에서 60 분 동안 (같은 HBS 매체에서 제조) 오전 4 μm의. </li><li> 60 분 후, 신선한 HBS 매체와 커버 슬립을 씻는다. </li></ol></li><li> 세포질의 기록 형광 이미지 [칼슘] 배양 세포에서. <ol><li> 램프, 현미경, 관류 시스템, 형광 카메라와 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 을위한 항온 플랫폼 된 커버를 배치거꾸로 현미경의 무대에서 열린 12mm 커버 글라스와 40X 목표 (1.3 오일, NA)를 사용하여 미세한 필드를 선택합니다. 부재 또는 시험 물질의 존재 (37 ° C) 예열 HBS 매체 지속적으로 세포를 관류. / 분으로 약 5-10 ㎖가 흐름 속도를 유지한다. 참고 : 살아있는 세포에 대한 세포 관류 시스템이 오픈 12mm 커버 글라스를위한 항온 플랫폼에 장착된다. 밸브 제어부를 구비 8 라인 중력 중심 관류 시스템 솔루션을 관류하는 데 사용된다. 진공 펌프는 과도한 매질을 제거 할 책임이있다. 솔루션에서 튜브 가열 시스템을 이용하여 가열된다. </li><li> 셔터가 모두 여기 파장에서 닫힌 배경 이미지를 캡처. </li><li> 340 및 380 nm에서 번갈아 세포 에피는-조명. 기록 등이 520 나노 미터의 Fura-2 다이크로 익 미러에 의해 필터링되는 형광 카메라,과마다 5 ~ 10 초에서 방출. </li><li> 기록 기간이 종료되면, 완전한 시퀀스 O 저장할F 이미지는 추가 분석을 위해 컴퓨터에 520 nm에서 방출. </li></ol></li><li> 기록 된 형광 이미지 분석. <ol><li> 실험 파일을 엽니 다. aquacosmos 소프트웨어를 사용하여, &#39;비율&#39;을 클릭하고 원하는 비율의 범위를 선택합니다. 비 이미지의 시퀀스를 얻기 위해 생성 된 이미지에서 화소의 비율에 의해 픽셀을 계산한다. </li><li> &#39;배경 제거&#39;를 조정하여 배경을 뺍니다. 를 눌러 &#39;시작 계산&#39;. </li><li> 를 눌러 &#39;항상 순서&#39;버튼과 관심의 고대 영역을 삭제 (로아). 개별 셀의 정량 분석​​을 위해, 개별 뉴런에 해당하는이자 또는 로아의 새로운 영역을 설정합니다. 각 ROI 각 화상에 대응하는 각 화소의 평균 비율 모든 값은 개개의 ROI (셀)에 대한 비 형광 값의 기록을 얻었다. </li><li> 그래프 progr에 각각의 투자 수익 (ROI)에 해당하는 비율의 형광 값을 내보내 개인 기록을 그래프로오전. </li><li> 적절한 데이터 분석을 이용하여 각각의 자극에 응답하여 비 fluorescences의 상승의 크기를 추정하는 소프트웨어를 그래프에 해당하는 계산을 할. </li></ol></li></ol> 미토콘드리아 칼슘 3. 생물 발광 영상 2+ 농도 <ol><li> mitGAmut 플라스미드 배양 해마 신경 세포의 형질. 주 : 세포를 제 미토콘드리아 타겟팅 서열 및 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합 칼슘 결합 부위 부족한 돌연변이 쿼린 함유 mitGAmut 플라스미드로 형질 감염된다. 이 구성은 미토콘드리아 칼슘 흡수에 큰 상승을 검출하고, GFP 형광에 의해 형질 감염된 세포의 확인을 허용한다. 플라스미드를 개발하고 친절 P. Brûlet 및 동료 (18) (CNRS, 파리)에 의해 제공되었다. <ol><li> 소 태아 혈청을 결여로 Neurobasal 배양액을 함유로 Neurobasal TF 준비, B27, gentamic및 2 mM의 L- 글루타민. </li><li> 로 Neurobasal TF의 50 μL 플러스 유리 병 (솔루션) 2.5 μL 형질 전환 시약을 준비합니다. (50)로 Neurobasal의 TF의 μL 플러스 4 μg의 유리 병에 mitGAmut 플라스미드 (솔루션 B)를 준비합니다. 흔들림없이, 20 분 동안 혼합 허용 솔루션 A. 위에 부드럽게 용액 B를 추가합니다. </li><li> 신선한로 Neurobasal의 TF 200 μl를 포함하는 새로운 multidish 판에 해마 신경 세포가 포함 된 커버를 전송합니다. </li><li> 모든 커버 슬립을 통해 드롭에 의해 용액 A + B의 100 μl를 드롭을 추가합니다. 30 분 동안 품어. 매체를 제거합니다. 신선한로 Neurobasal의 TF와 세포 번 씻으십시오. 원래로 Neurobasal 문화 매체로 된 커버를 돌려줍니다. </li><li> 37 ºC 5 % 형질 전환 후 CO 2에서 추가 24 시간 동안 배양 신경 세포 효율적인 표현과 프로브의 목표를 ​​허용합니다. </li></ol></li><li> 생물 발광 이미징을위한 테스트 솔루션의 준비. <ol><li> 100 μM NMDA로 또는 145 mM의 KCl을 함유 HBS 용액을 제조상기 (단계 2.1). 10 mM의 칼슘을 포함하는 2 + 플러스 100 μM을 디기 토닌 HBS 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 코 엘렌 테라가 n 인 미토콘드리아 - 타겟 쿼린의 재구성. <ol><li> HBS 200 ㎕를 함유하는 네 개의 웰 플레이트에 형질 해마 신경 세포를 포함하는 전송 된 커버. </li><li> 4 μM의 최종 농도에 대한 HBS 200 μL에 코 엘렌 테라의 N (200 μM)의 4 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. RT (25 ° C)에서 2 시간 동안 어둠에 품어. </li></ol></li><li> 미토콘드리아의 기록 생물 발광 이미지 [칼슘 2 +]. <ol><li> 현미경, 램프, 관류 시스템, 생물 발광 카메라와 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 온도 조절 (37 ºC) 관류 챔버에 재구성 된 커버 옮기고 50-10 ml / 분의 속도로 미리 예열 HBS 용액으로 연속적으로 관류. </li><li> 40X 대물 렌즈 (오일, NA : 1.3)를 이용하면, 발현 세포를 포함하는 미세 필드를 선택FITC 필터를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현과 관련된 형광 방출에 의해 도시 된 바와 같이 poaequorins. 일반적인 필드는 1-2 형질 감염된 세포를 포함 할 수있다. CCD 카메라를 사용하여, GFP 형광 이미지를 캡처. </li><li> 현미경의 빛을 끕니다. 빛 경로에있는 이색 함유 상자를 제거합니다. 여기 광을 끄고 완전한 어둠에 대한 어두운 상자를 닫습니다. </li><li> 또는 시험 용액 37 ºC에서 미리 예열없이 HBS 매체 5-10 ㎖ / 분에서 세포를 관류. </li><li> 광자 방출 이미지를 이미지 프로세서로 처리 광자 계수 카메라로 매 10 초를 캡처합니다. </li><li> 각 실험의 끝에서 나머지 광을 방출하기 위해 HBS 10mm의 디기 토닌에 0.1 mM의 CaCl2를 가진 세포를 Permeabilize 하시려면. 참고 :이 광 배출이 전체 광자 방출, 칼슘 농도 교정에 필요한 값을 추정하기 위해에 추가해야합니다 &lt;./ 리&gt; <li> GFP 관련 형광 이미지로 컴퓨터에 보관 생물 발광 이미지는 광자 계수 이미징 전에 캡처. </li></ol></li><li> 미토콘드리아 [칼슘 2 +]를 반영하는 생물 발광 이미지 분석. <ol><li> 특정 소프트웨어를 사용하여 광 배출량을 정량화. 광 배출은 미토콘드리아 자유 칼슘으로 전환시킬 수있다 2 + 농도 ([칼슘] MIT) Brini 외. (15)에 의해 설명 된 알고리즘을 사용. </li><li> 실험 및 GFP의 형광 이미지를 엽니 다. 실험의 시작 부분에서 촬영 된 형광 화상에 의한 형질 전환 세포의 형상을 그려서 특정 소프트웨어의 도움으로 관심 (로아)의 선택 영역. </li><li> 모든 이미지에 동일한 ROI를 붙여 넣습니다. 각 ROI의 총 광 배출은 각 시점에서 각 셀에 대한 발광 방출 값 (L)을 얻기위한 특정 소프트웨어로 계산된다. </li><li> 모든 광자 emiss을 추가모든 광 방출을 함유 생물 발광 이미지를 얻기 위해, 특정 소프트웨어를 이용하여 투과성으로 만들어를 디기 토닌 후의 것들을 포함 생물 발광 이미지 내의 이온. </li><li> 계산을위한 특정 소프트웨어에 대한 관심의 모든 지역에 대한 광자 방출의 수출 값. 이렇게하려면, 각 시간에 모든 투자 수익 (ROI)에 대한 생물 발광 값을 계산하기 위해 &#39;그래프&#39;를 클릭하십시오. &#39;총액&#39;을 선택하고 &#39;모든 이미지에 현재의 투자 수익 (ROI)을 사용합니다. 를 눌러 &#39;계산&#39;. 워크 시트에 &#39;txt.file&#39;수출 데이터를 저장합니다. 모든 투자 수익 (ROI)를 들어, [칼슘 2 +] MIT는 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 계산된다 : [칼슘 2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)] 어디에, R = [L / (L 총의 λ)] 1 / N L은 관심있는 각각의 영역에서 측정시 방출 발광이다. L 총입니다관심있는 각각의 영역에 대해 측정시, 그 때의 조직에 존재하는 개수의 첨가 후 남아 총 발광. λ, K (TR), K, R n은 그 값의 애큐 오린의 조합에 따라 (야생형 또는 돌연변이)과 coelenterazin 사용 (야생 형 또는 n 형) 상수뿐만 아니라 기록 온도 (16)이다. 여기에 사용되는 조합은 37 ºC에서, (AEQ 및 coelenterzine 없음을 돌연변이), 우리는 다음과 같은 값 사용 : K R = 8.47 × 10 (7), K (TR) = 165.6 × 10 (3), N 1204 및 λ = 0138 =. </li></ol></li><li> 적절한 데이터 분석을 이용하여 각각의 자극에 응답하여 생물 발광의 상승의 크기를 추정하는 소프트웨어를 그래프에 해당하는 계산을 할. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

노화 뇌 세포 내 칼슘의 리모델링 2 + 항상성이인지 적 손실과 관련되어, 허혈성 손상, 흥분 독성 및 신경 퇴행에 대한 감수성을 증가했다. 체외에서이 가설을 조사하기 위해, 칼슘 이미징 절차를 사용할 수 있습니다. 불행하게도, 이전 해마 신경 세포의 생존 문화는 신뢰할 수 없습니다. 최근에는 관찰되었음을 래트 해마 뉴런 ROS의 축적, 리포 푸신 과립, 염색질 초점의 형성...

흥분 독성은 허혈과 같은 신경 욕설에서 신경 손상과 세포 사멸에 관여하는 가장 중요한 메커니즘 중 하나이며, 알츠하이머 병 (1)과 같은 몇 가지 신경 퇴행성 질환이다. 신경 독성의이 유형은 주로 칼슘 글루타메이트 작용에 의해 매개된다 2+ -permeable, 이온 성 NMDA 수용체 (NMDAR) 2. 글루타메이트에 배양 된 신경 세포의 노출은 신경 세포 사멸 4가 발생 흥분 독성 (excitotoxicity) 3로 이어질 수 있습니다. 우리와 다른 사람은 이전에 NMDA에 의한 세포 사멸에 신경 취약점이 체외에서 개발 및 5-8 노화로 변경 될 수 있다고보고있다. 널리 세포질 무 칼슘 농도 ([칼슘] CYT)의 증가는 세포의 활성화에 이르게하는 것이 허용된다. 이 너무 높게 상승 및 / 또는 충분히 지속 된 경우에는, 그 세포 사멸을 유발할 수 9. 또한,이 제안되어있다그 흥분 독성 (excitotoxicity)는 미토콘드리아의 칼슘 흡수 (10), 글루타메이트에 의한 세포 사멸 (11)에 대한 미토콘드리아 uncoupler 보호 뉴런과 뉴런을 치료부터해야합니다. 미토콘드리아는 칼슘을 너무 많이 차지하면 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개통은 시토크롬 C 및 기타 프로 세포 사멸 인자와 유도 세포 사멸의 해제로 이어지는 발생할 수 있습니다. 우리는 최근에이 미토콘드리아의 칼슘 흡수가 직접 직접 하나의 해마 신경 세포 5 NMDA에 의한 미토콘드리아의 칼슘 흡수,이 문서에보고하는 방법을 측정하여, 흥분 독성에 나이 의존 감수성과 관련이 있음을 보여 주었다. 이러한 학습, 기억과 다른인지 과정 (12)과 같은 생리적 과정에 관여하는 해마는 노화 및 퇴행성 신경 질환 (13)에 매우 취약합니다. 이 시험관 내에서 몇 주 후에, 제안 된 배양해마 신경 세포는 14 세 뉴런의 전형적인 특성들을 나타낸다. 따라서, 장기 배양 해마 신경 세포가 노화 강화 흥분 독성 (excitotoxicity)의 칼슘 - 매개 메커니즘을 조사하기 위해 포괄적 인 모델을 제공 할 수있다. 제시된 방법의 전체 목표에 따라서, 장기 배양 된 해마 뉴런에서 NMDA 수용체 작용제에 의해 유발되는 차동 칼슘 응답을 포함한 노화 뇌 세포 내 칼슘 항상성 또는 칼슘 리모델링에 실질적인 변화를 조사한다 . 방법은 각각 래트 해마의 신경 세포 배양의 상세한 설명 및 개별 뉴런의 형광 및 생물 발광 이미징에 의해 미토콘드리아 세포질 칼슘 농도의 모니터링을 포함한다. 배양 된 신경 세포의 세포질 칼슘의 형광 이미징은 표준 절차입니다. 그러나이 방법은 서브 덜 신뢰할 수있다세포의 칼슘 미토콘드리아의 칼슘을 포함하여 2 + 측정. 이것에 대한 이유도 mM의 수준으로 낮은 μm의 수준에서 미토콘드리아에서 변경 될 수 있습니다 칼슘 농도에 대한 합성 프로브의 적절한 타겟팅 및 부적절한 친 화성의 부족을들 수있다. 인스턴스 쿼린 등의 단백질에 대한 기초 칼슘 프로브의 사용은, 세포 내 소기관으로 타겟팅 특정 칼슘 결합 부위 (15)가 부족한 다른 coelenterazines 또는 돌연변이 된 프로브를 사용하여 다른 칼슘 친화 유도체의 사용을 허용하고있다. 이러한 방식으로, 미토콘드리아 타겟팅 쿼린을 발현하는 세포의 생물 발광 촬상 개별 뉴런 미토콘드리아 칼슘 농도의 모니터링을 허용 할 수있다. 그러나,이 절차는 생물 발광 촬상 16-18 대 광자 카운팅 고감도 카메라 또는 CCD 카메라의 사용을 요구할 수있다. 더 establ입니다에서 확인해야 새로운 결과를 얻을 수 있습니다이 방법예를 들어 같은되고 이로 뇌 노화 모델, 오래된 동물의 뇌 조각.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

신경 변성과 허혈에 관련된 신경 세포 사멸에 대한 감수성이 대단히 세 뇌에서 증가하지만 책임 메커니즘이 심하게 알려져있다. 흥분 독성 (excitotoxicity), 두 모욕에 의해 유도 된 신경 세포 손상에 기여하는 것으로 과정은 칼슘 유입 및 미토콘드리아의 칼슘 과부하를 촉진 글루타메이트 수용체의 활성화에 의해 매개된다. 세포 내 칼슘 항상성의 세포 내 칼슘 항상성 또는 리모델링에 상당한 변화가 된 신경 세포에서 신경 세포의 손상을 선호 할 수 있습니다. 노화에 칼슘 리모델링을 조사를 위해 우리는 생체 내에서 뉴런 세 일부 측면에서 유사한 쥐의 해마 신경 세포의 장기 문화에서 라이브 세포 이미징을 사용했다. 이를 위해, 해마 세포는 처음에 갓 새로 태어난 쥐의 해마에서 분산 POLI-D 라이신 코팅, 커버 글라스에 도금입니다. 그런 문화는 며칠 동안 제어 매체에 보관 또는 W 몇 가지있다각각, 젊은이와 노인 신경 세포를 조사하기위한 eeks. 둘째, 배양 된 신경 fura2 로케이션 디지털 형광 비 이미징을 사용하여 세포질 칼슘 농도의 측정을 실시한다. 셋째, 배양 된 신경 세포는 미토콘드리아를 대상으로 낮은 선호도 쿼린 및 GFP의 탠덤을 표현하는 플라스미드로 형질된다. 24 시간 후, 균체 내에 쿼린은 코 엘렌 테라으로 재구성되고 뉴런은 미토콘드리아의 칼슘 이온 농도를 모니터링 생물 발광 촬상을 실시한다. 이 세 단계의 절차는 예를 들어, 글루타메이트 수용체 효능 NMDA 및 이들과 다른 응답이 노화에 의해 영향을 받고 있는지 여부를 비교 관련성 자극 세포질과 미토콘드리아 칼슘 응답의 모니터링을 허용한다. 이 절차는 어떻게 영향 세포질과 미토콘드리아 칼슘 선택 자극에 대한 반응뿐만 아니라, 신경 세포를 방지하기위한 선택 약물의 테스트를 노화에 관한 새로운 통찰력을 얻을 수있다노화 관련 질환 사망.

여기에 우리가 칼슘 리모델링 및 세포질과 미토콘드리아에 NMDA의 효과를 평가하기 위해 간단한 방법을 설명 [칼슘 2 +] 세 뉴런. 그림 1은 분리 및 신생아 쥐에서 해마 신경 세포를 배양하기위한 절차의 회로도를 보여줍니다. 시작하기 전에, 우리는 살균, 폴리 D 라이신 코팅, 커버 글라스를 준비하고 4 잘 접시에 그들을 찾을 필요가있다. 그런 다음, 신생아 쥐 사망하고 ...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K 조회수.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

연구

신경과학

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

혜성 분석을 사용하여 Hippocampal 뉴런의 DNA 손상을 시금

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.