우리는 원고를 준비하는 그의 도움 박사 마이클 Wooten 감사드립니다. 이 작품은 NIH 2RO1NS033661 (MWW)에 의해 지원되었다.

1. 기증 설정하기 전에 <ol><li> 신경 세포의 수확을위한 태아 새끼를 생성하려면, 19 일 전에 신경 세포 분리의 하루 성인 쥐 사이에 번식을 예약합니다. (C57BL / 6 마우스 연령대 2~8개월이 프로토콜을 개발 목적으로 matings에 사용되었다). 성공적인 짝짓기는 임신 여성, 심장의 고동이나 시각적 확인의 질 플러그의 검색으로 확인하실 수 있습니다. </li><li> 이전 신경 세포 분리에 일 : <ol class="ualpha"><li> 들어 immunofluorescence 애플 리케이션, 3시 1분 콜라겐 1, 쥐 꼬리 가벼운 코팅 24 잘 플레이트의 코트 유리 coverslips : 폴리-D-라이신 솔루션입니다. </li><li> 세포 배양 어플 리케이션, 3시 1분 콜라겐 1, 쥐 꼬리 가벼운 코팅 코트 적절한 크기의 조직 배양 플라스틱 도자기 : 폴리-D-라이신 솔루션입니다. </li></ol></li><li> 하룻밤 자외선 아래에서 조직 문화 후드 던 접시를 놓습니다. </li><li> 이전 멸균 행크의 대차 소금 솔루션 (HBSS)으로 번호판을 씻으사용하는 방법. 코팅 플레이트는 HBSS 가득하고 어두운 4 ° C에서 최대 1 주일 정도 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 수확 <ol><li> 일차 전지 문화의 성장과 같은, 가장 큰주의가 가장 멸균 환경이 가능하도록 행사되어야 할 때 불임은 항상 요소입니다. 멸균 기술에 대한주의와 함께,이 프로토콜에 대한 신경 조직의 초기 절개와 추수는 오염의 최소한의 위험으로 층류 후드 외부에 완료할 수 있습니다. 초기 수확 후 모든 후속 단계는 세포 배양을위한 정격 후드 내에서 최대 무균 조건 하에서 실시되어야한다. </li><li> 잘린하여 약 19일 포스트 기름지게에서 임신한 쥐를 안락사. 마취가 (Stratmann, 외., 2010) 뇌 세포 죽음을 일으키는 것으로 알려져 있기 때문에 임신 여성을 안락사시켜야하는 마취의 사용은 권장되지 않습니다. 멸균 해부 가위와 집게 사용의 중반 복부 측면에 개구부를 만들마우스를 완전히 뱃속를 공개합니다. 계측기는 알코올과 열린 불꽃을 사용하여 소독 수 있습니다. </li><li> 태아 새끼는 마우스의 뱃속의 후부 방향으로 위치하게되며 자궁에서 쉽게 볼 수 있어야합니다. autoclaved 멸균 포셉 통해 자궁을 열고 새끼를 제거합니다. 해부 현미경 하에서 무균 거즈에 신선한 멸균 가위와 장소 제거된 머리로 새끼 목을 벨. 멸균, autoclaved 악기 불꽃 알코올 및 이전 오픈 불꽃을 사용하여 세척하고 사용하는 동안이 될 수 있습니다. </li><li> 멸균 가위 또는 코로 목 뒤쪽에서 강아지의 메스 오픈 두개 사용하기. 이 절차는 일반적으로 척추 구멍에 가위 중 하나 팁을 삽입 후 anteriorly 진행하여 완료할 수 있습니다. 조심스럽게 포셉으로 전체 두뇌를 제거합니다. 멸균 거즈에 머리를 놓습니다. 멸균 메스를 사용하여, 소뇌를 제거 두 반구 (그림 1)로 분리하는 뇌의 중간선을 절개<html> . </li><li> 멸균 포셉와 해마 주변 meninges의 작은 부분을 잡고 부드럽게 멀리 그것을 당기십시오. 그것이 해마를 분리하기 전에 meninges를 제​​거하는 엄격하게 필요하지 않지만, meninges의 존재는 멤브레인의 인성으로 인해 더욱 어려워 해마의 절개를 할 수 있습니다. 두 경우 모두, 해마는 meninges가 제거된 후 더 명확하게 볼 수 있습니다. 해마는 반구 및 ventrally 잠함병 (그림 2)의 말초 부분에서 시작 곡선 구조입니다. 내적, 오목, 측면 (꼬리)이 뇌실에 직면하고 있는데, 그것은 이미 무료입니다. 따라서 해마를 분리하기 위해, 하나는 볼록 바깥쪽 면을 따라 절단해야합니다. 절개 후 부드럽게 세포 배양 후드를 예열 (37 ° C) HBSS와 작은 조직 배양 접시에 무균 조직 포셉와 송금 각 hippocampi 리프트. 뇌 조직은 여러 새끼에서 조합하여 사용할 수 있습니다. </li></ol>&quot;&gt; 3. 조직 분리 <ol><li> 100 밀리미터 조직 배양 접시에 무균 HBSS에 3 ML에 무균 메스, 부드럽게 말하다 뇌 조직을 사용합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브로 다진 조직 및 HBSS를 전송합니다. HBSS의 1.5 ML 5 ML의 총 볼륨에 0.25 %의 트립신 용액 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 모자와 부드럽게 튜브에게 섞어 4-5 시간을 바꾸란. 소화 조직에서 풀려나는 DNA가 거품을 준수하고 다진 조직은 튜브의 아래쪽 (그림 3)에 정착하는 대신 부유하게됩니다대로 거품을 생산하지 않도록하십시오. </li><li> 5 분마다 위와 같이 15 분 동안 37 ° C에서 반전 튜브를 hippocampal 조직을 품어. </li><li> 조직은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. </li><li> 조심스럽게 튜브의 하단에 그대로 조직을두고, 멸균 피펫을 사용하여 여분의 용액을 제거합니다. </li><li> 5 분 37 ° C에서 HBSS의 5 ML과 조직 펠릿 씻으십시오. 3 회 총을 반복합니다. 티슈가 완전히 정착하도록 허용튜브 다음 세척 단계로 진행하기 전에 때마다 하단 있습니다. </li><li> 조직 펠렛에서 최종 빨래를 제거하고 신선한 HBSS 2 ML로 바꿉니다. </li></ol> 4. 신경 세포 분쇄 <ol><li> 분쇄 단계를 시작하기 전에 화재 광택 파스퇴르의 pipettes을 준비해야합니다. Bunson 버너 사용하여 피펫 개구부의 직경은 (그림 4B) 약간 둥글게되어 크기 및 피펫 개구부의 모서리에서 약 0.5 mm까지 화염에 멸균 9 인치 파스퇴르 피펫 팁 (그림 4A)을 누르고 있습니다. 분쇄 프로세스를 시작하기 전에 완전하게 냉각 피펫을 허용합니다. </li><li> 정상 멸균 9 인치 파스퇴르 피펫 사용하여 부드럽게 조직에게 7 번 총 씹다. 큰 조직 조각이 시점에서 정상이며 이전 다음 단계로 이동으로 튜브의 바닥에 정착하도록 허용해야한다. </li><li> 신선한 멸균 50 ML 원뿔 튜브로 뜨는을 전송합니다. </li><li&gt; 나머지 조직하려면, 무균 HBSS 2 ML을 추가하고 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 5 회 총 씹다. </li><li> 남아있는 모든 큰 조직 조각은 튜브의 바닥에 정착 4 ML dissociated의 연결을 세포 전체에 대한 이전 뜨는로 뜨는 결합하도록 허용합니다. </li></ol> 5. 세포 도금 <ol><li> hemocytometer를 사용하여 dissociated 세포를 세어보세요. </li><li> 일반적으로 한 세포 숫자가 결정되었으며, 도금 후 발생할 수있는 모든 세포 죽음을 계정에 해당 최종 숫자의 20 %를 뺍니다. </li><li> 셀은 아래 권장 사항을 사용하여 도금 수있다 : 24 잘 접시에 coverslips 위해 - 6 X 10 4 셀 / 음 0.5 ML의 4 X 10 5 셀 / 3 ML의 플레이트 - 60 밀리미터 조직 배양 플레이트에 대한 6 X 10 6 셀 / 6 ML의 플레이트 - 100 밀리미터 조직 배양 플레이트에 대한 </li><li> Neurobasal 도금 미디어의 지정된 볼륨 (Neurobasal와 함께 적절한 세포 숫자를 혼용B27 보충을 포함한 미디어 [1 ML / 50 ML], 0.5 MM 글루타민 솔루션, 25 μm의 제품 글루 탐 산염 (미스터 147.13 g / 몰), 페니실린 (10,000 대 / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ml) 쇼핑 [250 μl / 50 ML] , 1mM HEPES (미스터 238.3 g / 몰), 10 %의 히트 Inactivated 기증자 말 혈청)과 접시에 세포를 추가합니다. 소용돌이 모양의 접시는 부드럽게 골고루 세포를 배포합니다. HI-기증자 말 세럼은 성장의 첫 24 시간 동안 세포를 풍부하게하기 위해 도금 미디어에 추가됩니다. 세포는 이후 혈청에서 투약하고 각 미디어 교체시 혈청 시리얼 감소하여 세럼 - 프리 환경으로 돌아왔습니다. 이것은 높은 농도의 조미료는 여기에 추가된 낮은 농도에서,의 연결을 세포 배양에 대한 독성있는 동안, 그것 이외의 연결을 세포 11 첨부 파일을 억제 것을 또한 지적되어야한다. 그러나, 그것은 문화의 첫 24 시간 동안 도금 미디어에 추가되어야하며 그 이후 세포의 neurotoxicity을 방지하기 위해 어떤 먹이 미디어 밖으로 떠났어. </li><li> 피5% CO 2 배양기는 하룻밤 사이에 37 ° C에서 뉴런을, 레이스. </li><li> 세포에서 미디어의 절반 볼륨을 제거하고 Neurobasal 먹이 미디어 같은 볼륨 (Neurobasal 미디어 B27 보충을 포함하는으로 교체 [1 ML / 50 ML], 0.5 MM 글루타민 솔루션 페니실린 (10,000 대 / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ML) [250 μl / 50 ML], 1 밀리미터 HEPES (미스터 238.3 g / 몰). </li><li> 뉴런은 오래된 미디어의 절반을 제거하고 신선한 Neurobasal 먹이 미디어의 같은 볼륨으로 교체하여 4 일에 싫증이되어야한다. 의 연결 프로세스는 1 일 (그림 5A)에 표시하며 10 일째 (그림 5B)에 의해 널리 사용되기 시작합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 기본의 연결 세포를 성장 및 문화 능력은 신경 과학의 indispensible 부분이되었습니다. 차 문화는 연구자가 특정 세포 경로를 분석하기 위해 화학적 변형과 치료, 대상 LOC를 허용통제된 환경에서 alization과 성장 패턴. 이러한 절차의 대부분은 세포 반응에서 특정 변화를 시각화하는 정교한 방법론을 활용. 이 경우, hippocampal 뉴런은 그대로 뇌에 분석하기 어려운이 아니라면 불가능한 증명 특정의 연결 경로를 연구하는 데 사용됩니다. 두뇌의 특정 영역에서 뉴런의 근처 균질 인구의 준비는 뇌 기능을 연구에 중요합니다. 개별 뉴런 분자 효과는 메모리 또는 학습과 같은 높은 순서 경로를 delineating의 수단이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 glial 세포의 피더 레이어없이 hippocampal 뉴런의 비교적 순수한 문화를 듭니다적으로 이러한 뉴런 쉽게 immunofluorescence 연구에 활용하고 있습니다. 그러나, 다중 셀 유형을 포함하는 장기에서 모든 차 문화와 마찬가지로 적은 원하는 세포에 의해 어떤 오염 물질이 발생할 수 있습니다. 의 연결을 세포의 분리에서 glial 세포에 의해 오염이 일반적인 문제가 될 수 있습니다. Glial 세포 있습니다그들의 형태가 대상 뉴런 (그림 6)에서 크게 차이로 쉽게 문화의 미세한 시각화에 따라 검색됩니다. glial 세포 오염의 영향은 문화의 계획된 사용에 따라 달라집니다. 세포 immuno-형광 검사에 사용되는 경우 개별 뉴런 사진을 찍은 때, glial 오염 불편보다 더 아무것도 할 수가 없습니다. 의 연결을 문화가 생화 학적 분석에 사용하는 경우 다만, glial 세포에 의해 어떤 중요한 오염 결과에 큰 변화를 일으킬 수 있습니다. glial 세포 오염을 해결하기위한 방법은 토론에 추가로 설명되어 있습니다. 일단 뉴런이 성공적으로 격리와 문화에서 성장되어, 한 전형적인 응용 프로그램은 immuno-형광 기법 세포 프로세스를 검사하는 것입니다. 그림 7 그림과 같이 같은 mitochondria와 같은 organelles는, 해결하기 위해 이전에 문화 미디어에 추가된 중요한 염료를 사용하여 물들일 수ation. 내생 세포 단백질 표준 immuno-형광 기법 (그림 8)를 사용하여 고정 세포의 시각이 될 수 있습니다. 일단의 연결 세포를 고정하고 관심 단백질에 대한 특정 항체는 세포에 도입 수 있으며, 이러한 단백질은 형광 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 교양 뉴런은 또한의 연결 기능에 대한 개별적인 단백질 효과를 검토하는 방법으로 연구자를 제공합니다. DNA 검사 transfections, electroporation 또는 바이러스성 형질 도입을 포함한 기술의 다양한 사용하여, 단백질은 세포의 연결 (그림 9)에 overexpressed 수 있습니다. 지나친 표현 단백질의 영향에 대응하는 방법 신경 세포가 두뇌가 응답 수 방법에 대한 직접적인 inferences을 가지고 있고 약물 치료에 대한 세포 목표를 식별 가능성을 제공하고 있습니다. 실험 이러한 유형의 내용은이 문서의 범위를 넘어 그들은이 기술에 의해 준비 문화가 아래쪽의 다양한 적합한지 설명합니까tream 응용 프로그램입니다. 그러나,이 프로토콜의 전체적인 단순화가뿐만 아니라, 이들의 연결을 문화를 준비하는 데 필요한 짧은 기간이 오​​늘의 신경 과학 실험실에서 사용하기위한 이상적인 방법을 확인하십시오. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig1.jpg" /> 그림 1. 태아 쥐 두뇌의 해부. 첫 절개는 두 반구로 분리 뇌의 중간선에 내려갔습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig2.jpg" /> 그림 2. 태아 마우스 뇌의 해마의 위치. striatum는 해마을 시각화하기 위해 옆으로 이동하고 각 반구의 말초 지역의 곡선 &#39;신장 콩 &quot;타입 구조에 의해 기록됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig3.jpg" /> 그림 3. 트립신 용액의 hippocampal 조직의 분리. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig4.jpg" /> 그림 4. 파스퇴르 피펫 팁은 hippocampal 조직의 분쇄에 사용. () 일반 파스퇴르 피펫 팁. (b)는 불타는 광택 파스퇴르 피펫 팁. 둥근 모서리의 메모와 피펫을 여는 크기가 대략 50 %의 감소를 가져가라. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig5.jpg" /> 그림 5. Hippocampal 뉴런이 절차와주의 미디어의 도금을 사용하여 고정. () 세포 성장 일일 포스트 도금. 의 연결 프로세스는 1 일 동안 볼 수 있도록 시작합니다. (B) 세포 성장 십일 포스트 도금은 neurites는 측쇄과 중복됩니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig6.jpg" /> 그림 6. 7 일 동안 성장 glial 세포로 오염된와 organelle 마커 MitoTracker 레드 CM-H2XRos (Invitrogen # M7515)와 transfe 물들일 Hippocampal 뉴런Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019)를 사용하여 GFP-LC3과 cted. Mitochondria는 모든 세포에서 그러나 단지 하나의 신경 세포가 성공적으로 형광 구조로 transfected되었다 볼 수 있습니다. glial 세포로 오염 시각화하기 어려운의 연결 프로세스에서 GFP-LC3 표현의 분석을 만듭니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig7.jpg" /> 그림 7. Hippocampal 뉴런은 7 일 동안 성장하고 organelle 마커 MitoTracker 레드 CM-H 2 XRos (Invitrogen # M7513) 물들일. 이것은 중요한 염료는 조직 배양 세포에서 활성 mitochondria를 착색하는 데 사용됩니다. 세포는 4 % paraformaldehyde / PBS에서 해결하고 형광 현미경에 의해 시각되었다. mitochondria에서 산화 때까지 염료 자체가 아닌 형광등입니다. 액티브 mitochondria가의 연결 프로세스에 걸쳐 볼 수 있습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig8.jpg" /> 그림 8. </str긴 사연이 7 일 동안 성장&gt; Hippocampal 뉴런은 4 % paraformaldehyde / PBS 및 단클론 항-tubulin의 β 항체 (시그마 # T0198)와 immuno 묻은로 고정. 일차 항체 따라 오리건 그린 (Invitrogen # O11033) 염소 - 안티 마우스 이차 항체를 라벨이 추가되었으며, 형광은 현미경에 의해 시각. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig9.jpg" /> 그림 9. Hippocampal의 연결을 문화가 Lipofectamine 2000 (Invitrogen # 11668019)를 사용하여 구조 5 일째 성장과 GFP-LC3β DNA로 transfected되었다. 7 일 때, 세포는 형광 현미경을 사용하여 외부 막에 통합 GFP 태그를 LC3β와 시각 4 % paraformaldehyde / PBS 및 aggresomes을했다 사용해 해결했다. Aggresomes는 세포 몸과 neurites 전역에 위치하고 화살표로 표시된있다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Hippocampal 문화는 20여 년 동안 분자 생물학에서 사용되었습니다. 원칙적 동안의 연결을 문화가 두뇌의 어떤 부분에서 만들 수 있고, hippocampal 문화는 해마 7의 신경 세포 인구의 상대적으로 단순한 구조로 인해 가장 인기있는 것으로 입증되었습니다. Hippocampal 문화는 일반적으로 말기 배아 조직에서 만들어진다. 이 조직은 해리 쉽게이며 성숙 뇌 조직을 한 사람보다 적게 glial 세포?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 쥐의 꼬리에 콜라겐 1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,236 </td></tr><tr><td> 폴리-D-라이신 솔루션 </td><td> Chemicon </td><td> -003-E </td></tr><tr><td> 행크스 균형 소금 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td></tr><tr><td> 트립신 솔루션 (1X) 0.25 %, 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> NeuroBasal 중간 (1X) 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 보충 (50X) 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> 액체 L-글루타민 200 MM (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-149 </td></tr><tr><td> 페니실린 (10,000 대 / ML) / 스트렙토 마이신 (10,000 μg / ml) 쇼핑 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> HI-기증자 말 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S12150H </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice

쥐, murine hippocampal 뉴런의 차 문화를 널리 신경 생물학에서 세포 메커니즘을 공개하는 데 사용됩니다. 개별 뉴런을 분리하고 성장함으로써, 연구자들은 세포 인신 매매, 세포 구조 및 생화 학적 기법의 다양한 사용하여 개별 단백질 지방화에 관련된 특성을 분석할 수 있습니다. 이러한 실험의 결과는 메모리와 교육의 신경 기초를 다루는 이론을 테스트하기 위해 중요합니다. 그러나 실험의 이러한 형태의 모호하지 않은 결과가 다른 뇌 세포 유형별로 최소 오염 물질로의 연결을 문화를 성장 능력에 predicated있다. 이 프로토콜에서는 오염 세포 유형 (즉, astrocytes)를 최소화하면서 건강한 뉴런의 성장을 최적화하기위한 배아 hippocampal 세포의 신경 세포의 성장과주의 해부용으로 설계된 특정 미디어를 사용합니다. 배아 마우스 hippocampal 조직이 디위한 표본의 크기로 인해 유사한 설치류 조직보다 분리가 더 어려울 수ssection. 우리는 배아 일 19 일 (E19) 마우스 새끼에서 해마의 상세한 해부 기술을 보여줍니다. 개별 셀에 대한 최소한의 손상을 제공하면서 일단 hippocampal 조직은 고립되고, 세포의 연결을 부드럽게 분리는 트립신과 결합 조직 세포와는 별도로 고안된 기계 혼란의 묽은 농도로 이루어진다. 장애에 사용되는 pipettes을 준비하는 방법에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. 최적의 도금 밀도는 성공적인 세포 배양을 최대화하기 위해 immuno-형광 프로토콜 제공되었습니다. 프로토콜은 마우스 hippocampal 세포에서 세포의 연결의 문화에 대한 빠른 (약 2 시간)하고 효율적인 기술을 제공합니다.

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

69.8K 조회수.  Auburn University. 우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

비디오: Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

태아 기 이슬mn에서 Oculomotor, Trochlear 및 척추 모터 뉴런의 격리 및 문화 :GFP 형질전환 마우스

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

성인 쥐 요로 방광에서 1 차신경및 glia의 격리 그리고 문화

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...