Name: organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori
Uploaded: 2015-11-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori at JoVE.com

This work was supported by EU Marie Curie Fellowship (EU/300686-InfO) to S.B. and a Research Prize from the United European Gastroenterology Foundation to H.C. We would like to thank Harry Begthel, Jeroen Korving and the Hubrecht Imaging Center for technical assistance, Meritxell Huch for help with initial organoid culture and Yana Zavros for discussion.

위 Organoid 문화 (1) 설립 주 :이 프로토콜은 마우스 또는 인간 조직으로부터 위산 분비의 분리를 위해 사용될 수있다. 그것은 약 1 cm² 이상의 조직을 사용하는 것이 좋습니다. 인체 조직은 위 절제 또는 생검으로부터 얻을 수있다. <ol><li> 물질의 제조 주 : 사용 지하 매트 리겔 매트릭스이다. 항상 얼음에 지하 행렬을 유지합니다. -20 ° C에서 지하 행렬을 저장하고 사용하기 전에 얼음에 해동. 기본 배지는 HEPES가 보충 된 고급 DMEM / F12를 말한다; 이러한 루타 및 1X Primocin 적절한 항생제로 적절한 글루타민 소스. 사용되는 배양기는 표준 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃, 가습 공기, 5 % CO 2) <ol><li> 날카로운 집게, 가위, 메스와 유리 현미경 슬라이드 : 고온 가압 멸균 또는 100 %를 이소 프로필 알코올을 사용하여 준비기구를 소독. </li><li> 격리 전날, 24 아를 배치인큐베이터에서 L 세포 배양 접시입니다. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 지하 행렬을 준비합니다. 반복되는 동결 해동 사이클을 방지하기 위해 1 ml를 분취 량을 준비합니다. </li><li> 얼음에 버퍼와 멋진 킬레이트 500 mL로 준비합니다. HPO 4, 8.0 mM의 KH 2 PO 4, 96.2 mM의 NaCl을, 1.6 밀리미터의 KCl 5.6 밀리미터 나 2와 멸균 증류수에서 1X 버퍼를 준비, 43.4 MM의 자당, 54.9 mM의 D- 소르비톨, 0.5 mM의 DL-디티 오 트레이 톨 (주의), pH를 7. 여러 아이솔레이션을 계획하는 경우, DL-디티 오 트레이 톨없이 5 배 농축 용액을 제조. 살균 필터 버퍼. 분리하기 전에 배에서 바로 분리하기 전에 DL-디티 오 트레이 톨을 추가 멸균 물을 5 배 버퍼를 희석. </li><li> 준비 및 제조사의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자를 희석. 작은 크기의 분취 량을 사용하여 동결 - 해동 사이클을 피한다. 기능적 성장 인자는 결과 중요하다. </li><li> 쿨 기초 얼음 매체와 4 원심 분리기를 냉각6; C. </li><li> 37 ° C에 기초 배지의 또 다른 나누어지는을 따뜻하게. </li></ol></li><li> 땀샘의 분리 <ol><li> 차가운 얼음 기초 배지에 조직의 약 1 cm² 이상을 수집합니다. 준비까지 얼음에 보관하십시오. 그것은 가능한 한 빨리 조직을 처리하는 것이 바람직하지만, 얼음 매체에 저장 조직 필요한 경우. </li><li> 10cm 페트리 접시에 조직을두고 차가운 1X의 킬 버퍼로 커버. 부드럽게 앞뒤로 이동하여 씻으십시오. </li><li> 마른 10cm 페트리 접시에 조직을 배치합니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 실체 현미경 점액뿐만 아니라 근육 층을 제거한다. 부드럽게 앞뒤로 이동하여 차가운 1X 킬레이트 버퍼에 조직을 씻으십시오. </li><li> 새로운 건조한 10cm 페트리 접시에 1cm 2 조직을 놓습니다. 사용 가위는 약 2-5 mm² 인 크기의 20 ~ 50 작은 조각으로 잘라. </li><li> 집게를 사용하여, 50 ㎖ 튜브에 모든 조각을 놓습니다. </li><li> 멸균 10 ML의 플라스틱 피펫을 가져 가라. 1X 킬레이트 버퍼의 피펫을 젖은. 유지절차 전반에 걸쳐이 같은 피펫을 사용하여. </li><li> 50 ML 튜브에 10 ml의에게 차가운 1X 킬레이트 버퍼를 추가합니다. 격렬하게 위아래로 10 회 피펫 팅하여 조각을 씻으십시오. 조각이 정착하자. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 뜨는 때까지 반복 세척 (단계 1.2.7)은 분명하다. 이것은 인체 조직의 1 cm² 이상 대략 50 ~ 100 ml의 1 배 킬레이트 버퍼의 걸립니다. </li><li> 부드러운 매 2 분을 반전하여 실온에서 10 분 동안 10mM의 EDTA가 보충 된 20 ㎖ 1X 킬레이트 버퍼 조직편을 배양한다. 주 :이 인큐베이션 시간 및 온도는 속도 및 / 또는 선의 구조의 보존 중 위해 최적화 될 수있다. 그들은 200 RPM과 통에서 37 ℃에서 5 분에 롤링 플랫폼에서 4 ° C에서 몇 시간 배양에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 마우스 위를위한 좋은 출발점은 구름 플랫폼에서 4 ° C에서 인간의 위장 30 분, 실온에서 10 분입니다. </li><li> 피펫 한 번 부드럽게하고 10 ml의 피펫을 사용하여 아래로. 파이 허용eces 정착한다. 상층 액을 버린다. </li><li> 피펫을 사용하여, 깨끗한 10cm 페트리 접시에 조각을 전송합니다. 액체를 제거합니다. </li><li> 조직 조각의 상단에 유리 현미경 슬라이드를 놓습니다. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경 손상 조직을 관찰한다. </li><li> 유리 슬라이드와 페트리 접시에 압력을 적용합니다. 모두 (멸균 장갑) 손과 엄지 손가락으로 유리를 눌러를 잡습니다. 조직의 가장자리는 땀샘이 조직에서 출시되는 것을 나타내는 흐린 나타납니다. </li><li> 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경 발표 분비를 관찰한다. </li><li> 30 ml의 차가운 기초 매체에 땀샘과 조직을 수집합니다. 큰 조직 파편이 정착하자. </li><li> 이 15 ml의 튜브에 땀샘이 포함 된 상층 액을 수집합니다. </li><li> 200 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. 폐기 뜨는. 펠렛은 고립 된 땀샘이 포함되어 있습니다. 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 땀샘의 시드 <ol&gt; <li> 시드를 들어, 지하 행렬은 얼음처럼 차가운 항상 유지, 그래서 액체를 유지됩니다. </li><li> (1) 대안 : 씨 희석 행의 6 우물. <ol><li> 지하 행렬의 60 μL에 펠렛을 일시 중단합니다. </li><li> 지하 행렬의 각 포함 50 μL와 얼음에 5 멸균 1.5 ml의 튜브를 준비합니다. 전송 최초의 1.5 ML 튜브에 땀샘 / 지하 매트릭스 현탁액의 10 μL. 땀샘을 일시 중단하고, 다음 1.5 ML 튜브에이 용액 10 μl를 전송합니다. 다음 튜브에 대해 반복합니다. </li></ol></li><li> 방법 2 : 잘 당 땀샘의 계산 된 금액을 시드. 24 웰 플레이트 잘 하나에 50 μL 지하 매트릭스 100 땀샘 시작합니다. <ol><li> 조심스럽게 10 ml의 기초 배지에서 펠렛 분비를 일시 중지합니다. 깨끗한 10 ml의 배양 접시에 50 μl를 놓습니다. 10 배의 배율 세포 배양을위한 반전 현미경으로 땀샘의 수를 계산합니다. </li><li> 용액의 분비 농도를 계산한다. 볼륨을 그 접점 이동인 새로운 15 ML 튜브에 400 땀샘. </li><li> 200 XG, 4 ° C에서 원심 분리기 5 분. 뜨는을 취소하고 얼음에 튜브를 유지. 200 μL 지하 행렬을 추가하고 조심스럽게 재현 탁. 얼음에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 37 ° C 따뜻한 24 웰 플레이트를 타고 인큐베이터에서 (단계 1.1.2 참조). 잘의 중심에 지하 매트릭스 50 μL 땀샘의 한 방울을 놓습니다. 드롭 돔을 형성 할 것이다. </li><li> 주의 깊게 다시 세포 배양 용 인큐베이터에 플레이트를 옮긴다. 지하 행렬은 10 분을 공고히하자. </li><li> 모든 성장 인자와 따뜻한 매체를 준비합니다. <ol><li> 인간의 분비를 들어 인간 위 organoids에 대한 다음과 같은 성장 인자에 기초 배지를 보충 : 50 NG / ㎖ EGF, 10 %의 머리 에어컨 매체, 10 % R-spondin1 에어컨 매체, 50 %의 Wnt 에어컨 매체, 200 NG / ml의 섬유 아세포 성장 인자 (FGF) 10, 1 나노 가스트린 및 2 μM TGFbeta 억제제 및 10 μM RHO 회합을 형성 꼬인 코일 단백질 세린 / 트레오닌 키나제<html> 억제제 (RHOKi). </li><li> 뮤린 땀샘 : 마우스 위 organoids 대해 다음 성장 인자와 함께 기초 배지 보충 : 50 NG / ㎖ EGF, 10 % 머리 - 조정 배지 매체 R-spondin1가 에어컨 10 %, 50 %의 Wnt-조정 배지 100 NG / ml의 FGF10, 10 나노 가스트린, 0.5 mM의 TGFbeta 억제제 및 10 μm의 RHOKi. </li></ol></li><li> 인큐베이터에서 접시를 가져 가라. 조심스럽게 잘 지하 행렬을 방해하지 않고 각각의 모든 성장 인자 (1.3.6) 500 μL 매체를 추가 할 수 있습니다. 인큐베이터에 배치합니다. </li><li> 주당 매체 3 회 (2-3 일마다)을 새로 고칩니다. 매체를 새로 고침은 그대로 지하 행렬의 드롭을 떠나와 기존의 매체를 제거합니다. 조심스럽게 모든 성장 인자 신선한, 따뜻한 매체를 추가합니다. RHOKi를 추가하지 마십시오. 만 직접 땀샘의 파종 후 또는 organoids (2 단계)의 분할 후 RHOKi를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 미세 주입하기 전에 위 Organoid 문화 2. 통과. &quot;ove_content&gt; 참고 : organoid 문화의 모든 유형은 자신의 배로 시간이 마우스를 장뿐만 아니라 위 문화가 보통 분할로 1 :. (5) 모든 5~7일 인간의 장 문화가 1 분할 :.. 5 매 10~12일을 인간 위 문화는 1 분할 : 5 14 일마다 하나의 세포에서 시작하는 경우, 인간의 위 organoids도 제대로 형성 20 일이 소요될 수 있습니다 그것은 신진 구조는 중앙 루멘을 둘러싸고 경우이 프로토콜에서, organoids가에 분할 좋은 징조입니다... organoids의 마이크로 인젝션. 유지 보수 4 웰 플레이트는 동일한 프로토콜을 따른다 있지만, 그러한 표준 24 웰 세포 배양 플레이트와 같은 임의의 다른 세포 배양 접시를 사용할 수있다. <ol><li> 물질의 제조 <ol><li> 오토 클레이브 파스퇴르 피펫. </li><li> 날이 통과하기 전에, 37 ° C에서 인큐베이터에서 4 웰 세포 배양 플레이트를 놓습니다. 4 잘 접시 낮은 가장자리가와 미세 조작을 할 수 있습니다. </li><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 지하 행렬을 준비합니다. passagi의 날NG, 얼음에 지하 행렬을 해동. </li><li> 준비 및 제조사의 권장 사항에 따라 모든 성장 인자를 희석. </li><li> 쿨 기초 얼음에 중간은 4 ° C에서 원심 분리기를 냉각. </li></ol></li><li> Organoid 문화의 통로 <ol><li> 인큐베이터에서 organoids으로 판을 가져 가라. 한 우물에서 매체를 제거합니다. </li><li> 잘 지하 행렬에 차가운 기저 매체의 1 ML을 추가합니다. 1 ML의 마이크로 피펫을 사용하여, 적극적으로 피펫과 지하 행렬이 깨진 될 때까지 아래로. 15 ML 튜브로 전송합니다. 얼음에 놓습니다. </li><li> 유리 파스퇴르 피펫과 분젠 버너 등 화재 소스를 가져 가라. <ol><li> 팁의 개구가 0.5 mm (그림 1) 1.5 mm에서 축소 될 때까지 불에 피펫의 끝을 잡고. 실온으로 냉각 피펫을 보자. </li><li> 기초 배지에서 피펫을 젖은. 최적 축소 피펫 않은 좁혀 피펫에 비해 눈에 띄게 느린 매체를 취할 것입니다,하지만 여전히 모든아야 잘 피펫 팅. </li></ol></li><li> 피펫에 organoids을 가지고 적극적으로 위아래로 10 배를 피펫. organoids의 파괴는 눈으로 관찰 할 수있다. </li><li> 200 XG에서 5 분, 4 ℃로 차가운 기초 배지 및 원심 분리기의 9 ML을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 모든 상층 액을 버린다. 250 μL 지하 행렬의 펠렛을 일시 중단합니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 37 ° C 따뜻한 4 웰 배양 판을 가지고도 각 50 μL의 organoids / 지하 행렬의 드롭 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 다시 인큐베이터에 접시를 전송합니다. 지하 행렬은 10 분 동안 37 ℃에서 고화하자. </li><li> 단계 1.3.6에 나와있는 마우스 또는 사람 중 하나 organoids에 적합한 매체를 준비합니다. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 타고 500 μL 매체와 각 지하 매트릭스 드롭 오버레이. </li><li> 인큐베이터에 접시를 전송합니다. </li><li> 2-3 일마다 매체를 주 3 회 새로 고침 (1.3.8를 참조하십시오.). </li><li> organoids의 동결, mechan 들어이 프로토콜에서 분할에 기재 한 바와 같이 ically organoids을 방해 (단계 2.2.1-2.2.5.). 매체를 동결 500ml의에서 organoid 조각을 일시 중단 및 C 사용 cryotubes 및 냉동 컨테이너 -80 ° 얼어. 장기간 저장을 위해 액체 질소에 튜브를 전송. </li><li> 단계 1.1.2, 1.1.3., 1.1.5., 1.1.6., 1.1.7에 설명 된대로 organoids의 해동을 위해, 문화 플레이트, 지하 매트릭스, 성장 인자, 추위와 따뜻한 매체를 준비합니다. 즉시 10 ㎖ 차가운 기본 배지와 15 ㎖의 튜브에 해동 후 냉동 수욕을 사용하여 바이알 및 전송 세포를 가온. 2.2.12에 2.2.5에 설명 된대로 원심 분리기 세포를 플레이트. 참고 : organoids의 미세 주입이 힘든이지만, 독특한 가능성이 3D로 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. </li><li> 3D 과정이 필요하지 않은 경우, 이차원 organoids 시드. 단계 2.2.6에 2.2.1에 배치로이를 위해 organoids을 방해. 지하 엄마의 250 μL에 모든 성장 인자와 2,250 μL 차가운 매체 추가organoid 파편 TRIX. <ol><li> 물론 당 500 μL와 24 웰 플레이트의 5 우물에 씨. 방해받지 판의 맨 아래에있는 지하 행렬을 유지하기 위해주의 깊게 만 상위 400 μl를 교체하는 중간 3 회를 변경합니다. 참고 : Organoids는 세포 배양 접시에 부착 및 2D로 확장됩니다. 전자 현미경은 세포의 선단 측이 잘 매체 대향 것을 보여 주었다 (데이터는 미도시). </li><li> 감염 전에 박테리아가 세포에 부착 할 수 있도록, 지하 매트릭스를 포함한 모든 매체를 교환한다. 유사한 프로토콜은 또한 H. 감염에 대해 기재 한 내용 파이로리 (14). 2D 셀 층은하지 3D organoids에 존재하는 모든 종류의 세포를 함유 할 수있다. </li></ol></li></ol></li></ol> Organoid 문화 3. 미세 주입. 주 :이 프로토콜은 organoids 내로 박테리아 microinject하는데 사용될 수있다. 그것은 organoids에 주입을 시작하는 것이 도움이 될 수 있습니다미세 주입에 더 허용됩니다. 예를 들어, 마우스 위 organoids는 대상이 용이 매우 큰 낭성 organoids로 성장할 수 있습니다. <ol><li> 물질의 제조 <ol><li> 제조업체의 권고에 따라, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 두 개의 주사 바늘에 유리 모세관을 당겨. 마이크로 피펫 풀러는 중간에 유리 모세관을 가열하고 이에 두 유리 바늘을 생성, 두 부분으로 모세관을 끌어. 그것은 여러 바늘을 당겨 깨끗한 페트리 접시에 보관하는 실용적이다. </li><li> , 세균 감염을 허용 최소 3 매체의 변화 (= 일주)에 대한 모든 매체에서 항생제를 제거하십시오. 이 지하 매트릭스에서 항생제를 희석합니다. 특정 항생제에 내성 균주를 사용하는 경우, 오염 가능성을 최소화하기 위해이 특정 항생제를 추가합니다. </li><li> microinjections에 대한 작업 벤치를 준비합니다. 다른 바이오 안전성 수준의 작업을 위해 그것은 스테레오를 배치 할 필요가있다멸균 벤치 내부 현미경. 이 프로토콜에서는, H.를 주입 2 조건 멸균 벤치 내부 실체 현미경 하에서 바이오 안전성 수준에서 파이로리. </li><li> 배양 13, 23 표준 프로토콜에 따른 박테리아. </li><li> 박테리아의 수와 organoid 당 세포의 수 아래 설명과 같이 감염 (MOI)의 다양성을 평가하기 위해, 두 개의 매개 변수를 추정한다. MOI는 호스트 IL-8 mRNA 발현 (13) 예를 들어, 결과와 상관 관계가있다. <ol><li> 감염 용액에서 박테리아의 밀도를 계산하기 위해, 제 24 표준 프로토콜에 따른 광학 밀도 및 콜로니 형성 단위의 표준 곡선 (CFU)을 확립한다. 550 nm에서의 0.1의 광학 밀도는 대략 107 CFU / ㎖를 수득한다. </li><li> organoid 당 세포의 수를 추정하기 위해,도 1에 organoids의 개수를 카운트. 단계에 설명 된대로 organoids을 방해 2.2.1-2.2.4. 원심 5 분 200 XG에 후 4 ° C,효소 분해 용액을 Resuspend 1 ㎖를 추가합니다. <ol><li> 반복 5 ~ 10 분 동안 진탕 37 ° C에서 품어. 세포가 (10 배 배율에서 같은 라이카 DMIL으로 거꾸로 현미경) 현미경으로 단일 세포로 해리 여부를 결정합니다. 필요하면 배양을 연장. </li><li> 혈구를 사용 organoid 당 세포를 세어 organoid 당 세포의 수를 계산한다. 약 200 μm의 직경 인간의 위 organoids은 약 4,000 세포를 가지고있다. (50)의 대략의 MOI로 ml의 결과 당 1 × 109 박테리아와 세균 용액 0.2 μL를 주입. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Organoids 사출. 주 : 마이크로 인젝션 들어 유리 바늘 미세 조작기에 의해 3 차원 적으로 조작 될 수있는 홀더에 안정화된다. Organoids는 잘 내 지하 매트릭스 내에 남아 있습니다. 때문에 잘 크기 및 위치에, 모든 organoids 동등하다주입 menable. 일반적으로, 하나의 웰 (30)은 큰 organoids 5 분에 타겟팅 할 수있다. <ol><li> 수확 박테리아와 표준 프로토콜 (24)에 따른 기저 매체에 씻어. </li><li> 광학 농도에 따른 당 ㎖의 박테리아의 수를 계산한다 (단계 3.1.5.1 참조). 기본 배지에서 ㎖의 당 1 × 109 박테리아 박테리아 희석. </li><li> 유리 바늘을 가져 가라. 오프닝은 약 10 μm의 폭 될 수 있도록 사용 집게는 팁을 휴식. </li><li> 주입 홀더에 바늘을 삽입하고는 미세 조작기에 고정합니다. </li><li> 바늘로 약 10 μL 세균 솔루션을 차지합니다. </li><li> 실체 현미경 하에서 organoid 문화를 포함하는 낮은 가장자리 4 웰 플레이트를 놓습니다. </li><li> 미세 조작기로 탐색, 바늘 하나 organoids을 대상으로. organoid에 가까운 바늘을 배치하고 하나의 빠른 움직임에 organoid에 바늘을 삽입합니다. approximatel를 주입Y로 각각 0.2 μL 균액은 마이크로 인젝터를 사용 organoid. </li></ol></li><li> 모든 분석을위한 수확 Organoids. <ol><li> 예를 들어, 4 시간 후 organoids를 해결. 상층 액을 제거하고 1 ml의 2 % 포름 알데히드를 추가하고 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 20 분을 품어. Organoids 표준 절차 (25)에 따른 면역 조직 화학을 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+Troy++Chief+Cells+Act+as+Reserve+Stem+Cells+to+Generate+All+Lineages+of+the+Stomach+Epithelium.">Differentiated Troy+ Chief Cells Act as Reserve Stem Cells to Generate All Lineages of the Stomach Epithelium.</a> Cell. 155 (2), 357-368 (2013).</li><li>Van de Wetering, M., Sancho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/TCF-4+complex+imposes+a+crypt+progenitor+phenotype+on+colorectal+cancer+cells.">The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.</a> Cell. 111 (2), 241-250 (2002).</li><li>Schumacher, M. A., Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology.">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> Journal Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. -. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PLoS ONE. 8 (10), e76871 (2013).</li><li>Koo, B. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nat Meth. 9 (1), 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Li, V. S. W., Ng, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+through+Inhibition+of+&#946;-Catenin+Degradation+in+an+Intact+Axin1+Complex.">Wnt Signaling through Inhibition of &#946;-Catenin Degradation in an Intact Axin1 Complex.</a> Cell. 149 (6), 1245-1256 (2012).</li><li>Van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+'Living+Organoid+Biobank'+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a 'Living Organoid Biobank' of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li></ol>

Hans Clevers is an inventor on several patents for organoid culture. Otherwise the authors have nothing to disclose.

This protocol describes the use of ever-expanding, untransformed primary organoids from adult stem cells for infection biology. Critical steps are i) the isolation of viable glands, ii) expansion of organoids and iii) the microinjection. Below are some suggestions for modifications, troubleshooting and technical considerations. 
Compared to other isolation methods, which use vigorous shaking or pipetting to release glands and can be equally successful, the technique presented here has the adva...

병원균의 연구는 생체 내 감염을 모방하기 위해 적절한 모델 시스템에 의존합니다. 사용 된 시스템의 일부는 최적의에서 멀리있는 동안 일부 감염 에이전트의 경우, 적절한 모델 시스템은 부족하다. 일례 인과 위암 개발에 관한 것이다 위암 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)이다. 또 다른 더욱 적합한 세포 배양 시스템의 부재하에, 목표 많은 연구 암 캐스케이드의 끝점을 나타내는 암 개발 사용 암 세포주를 기본 분자 메커니즘을 분석한다. 차, 비 형질 전환 세포는 이러한 연구를위한 더 나은 모델이 될 것입니다. 그러나, 일차 전지는 기증자의 작은 숫자 만 사용할 수 있으며, 오랜 기간 동안 배양 할 수 없습니다. 최근 몇 년 동안, 줄기 세포 연구는 감염 생물학의 연구를위한 기본 세포 배양을위한 새로운 소스를 제공하기 위해 상당한 진전을 이루었습니다. 에서 문화세 줄기 세포 공급원이 사용되었다 : 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC) 또는 성체 줄기 세포. 그들은 이러한 거대 세포 바이러스 1, 2 또는 C 형 간염 바이러스와 같은 바이러스에 감염을 모델로 사용되어왔다 3-7, 예컨대 Bacterioides thetaiotaomicron 10 살모넬라 엔테 (11) 말라리아 원충 8 톡소 포자충 (9), 박테리아 등의 기생충. 최근, 여러 가지 접근 방법은 H. 감염을 모델로 발표되었다 15 - ESC 또는 유도 만능 줄기 세포 (12), 마우스 성체 줄기 세포 (21, 22) 인간 성체 줄기 세포 (13)에서 파생 된 organoids와 파이로리. 성체 줄기 세포로부터 organoid 문화의 발달은 뮤린 장내 상피 세포로부터 분리 된 단일 줄기 세포는 3 차원 행렬로 시딩하는 연구로부터 유래뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 16 시그널링을 억제 Wnt 신호 및 머리를 향상 미토 겐, R-spondin로 EGF를 포함하는 장 줄기 세포의 환경을 모방 매체에 매립. 특히 이러한 문화는 중간 엽 세포와 공동 배양이 필요하지 않습니다. 이러한 조건에서, 줄기 세포는 증식 도메인 장내 소낭 세포를 형질으로 작은 구조를 형성하고, 장내 융모의 세포를 포함하는 도메인. organoids 따라서 생체 내 상황을 모방하기 위해 자체 구성 할 수 있습니다. 오늘날, 많은 쥐와 인간 조직에서 성체 줄기 세포는 시험관 및 성장 될 수있는 소장과 대장 17 위 13,18, 간, 19, 20로 자신의 생체 대응을 닮은 organoids에 자기 조직, 췌장 (21) 전립선 (22). 여기에서 우리는 성체 줄기 CEL에서 문화 마우스 또는 인간의 위 organoids에 비디오 프로토콜을 제공LS는 H. 그들을 microinject과 파이로리. 이 프로토콜은 이전 보고서 13,18 기반으로합니다. 이 방법은 배양과 같은 장내 organoids 다른 organoid 배양 감염에 대해 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, phenol free</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td>Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Stock concentration 50 x, final concentration 1x</td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM</td></tr><tr><td>Murine recombinant EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>Stock concentration 500 &amp;micro;g/ml, final concentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Human recombinant FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Stock concentration 100 &amp;micro;g/ml, final concentration 200 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;i A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Stock concentration 500 &amp;micro;M, final concentration 2 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>Stock concentration 100 &amp;micro;M, final concentration 1 nM</td></tr><tr><td>RHOKi Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Wnt3A conditioned medium</td><td></td><td></td><td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 50%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td></tr><tr><td>R-spondin1 conditioned medium</td><td></td><td></td><td>Stable cell line generated in the Kuo Lab. Final concentration 10%. Cell line can be obtained from Calvin Kuo, Stanford.</td></tr><tr><td>Noggin conditioned medium</td><td></td><td></td><td>Stable cell line generated in the Clevers Lab. Final concentration 10%. Cells can be obtained from Hans Clevers.</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3500-RS/CF</td><td>Alternative source for R-spondin. This has been tested on human intestine organoids (1 &amp;micro;g/ml), but not yet on gastric organoids.</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10</td><td>Alternative source for noggin. This has been tested on human intestine organoids (100 ng/ml), but not yet on gastric organoids.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Enzymatic dissociation solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CoolCell&amp;reg; Alcohol-free Cell Freezing Containers</td><td>biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Invitrogen</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>An antibiotics composition agains bacteria and fungi. It is helpful after initiation of a culture. For long term culture you can switch to other antibiotics or none.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Stock concentration 10,000/10,000 U/ml, final concentration 100/100 U/ml. Can be used alternatively to Primocin in long term culture.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Neolabs</td><td>2-1033</td><td>Tweezers with fine tips are helpful for the removal of muscle layer from the tissue.</td></tr><tr><td>4 Well Multidishes</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>You can use other Multidishes. These were particularly helpful for microinjections because they have a low outer rim and allow more mobility for the manipulator.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-5B</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>Workbench</td><td>Clean Air</td><td></td><td>Custom made to fit the stereomicroscope in ML2 condition</td></tr><tr><td>Capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100T-10</td><td>1 mm outer diameter, 0.78 mm inner diameter.</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Flaming Brown Micropipette Puller</td><td></td></tr><tr><td>anti Cag A antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25766</td><td></td></tr></tbody></table>

organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

이 프로토콜은 위 글 랜드 (그림 2)의 분리를 할 수 있습니다. 땀샘은 organoids에 분비가 증가 수 있도록 라미닌과 콜라겐이 풍부한 3 차원 프레임 워크 (그림 3)를 제공, 잘 내에서 드롭으로 굳어 지하 행렬에 씨앗을 품고있다. Organoids는 일반적으로 작은 낭종을 시작 12-16 일 이내에, 그들은 50-300 μm의 (그림 4)의 직경 분야로 확장합니다. 일부 organoids는 일부 작은 ...

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Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.1K 조회수.  University Medical Centre Utrecht. Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

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Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

연구

생체공학

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

면역학 및 감염병학

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived from all sections of the GI tract (gastric, jejunum, duodenum, ileum, colon, rectum) and, upon differentiation, contain most of the cell types that are naturally found in each individual section. For example, intestinal organoids contain nutrient-absorbing enterocytes, secretory cells (Goblet, Paneth, and enteroendocrine), stem cells, as well as all lineage-specific differentiation intermediates (e.g.,&#160;early or immature cell types). The greatest advantage in using gastrointestinal tract-derived organoids to study infectious diseases is the possibility of precisely identifying which cell type is targeted by the enteric pathogen and to address whether the different sections of the gastrointestinal tract and their specific cell types similarly respond to pathogen challenges. Over the past years, gastrointestinal models, as well as organoids from other tissues, have been employed to study viral tropism and the mechanisms of pathogenesis. However, utilizing all the advantages of using organoids when employing highly pathogenic viruses represents a technical challenge and requires strict biosafety considerations. Additionally, as organoids are often grown in three dimensions, the basolateral side of the cells is facing the outside of the organoid while their apical side is facing the inside (lumen) of the organoids. This organization poses a challenge for enteric pathogens as many enteric infections initiate from the apical/luminal side of the cells following ingestion. The following manuscript will provide a comprehensive protocol to prepare human intestinal organoids for infection with enteric pathogens by considering the infection side (apical vs. basolateral) to perform single-cell RNA sequencing to characterize cell-type-specific host/pathogen interactions. This method details the preparation of the organoids as well as the considerations needed to perform this work under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions.

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 BSL-3 Conditions

This protocol describes how to infect human intestinal organoids from either their apical or basolateral side to characterize host/pathogen interactions at the single-cell level using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology.

생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

기계론적 연구 및 약물 발견을 위한 괴사성 장염 모델

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, which remains incompletely understood. The pathophysiology of NEC includes disruption of intestinal tight junctions, increased gut barrier permeability, epithelial cell death, microbial dysbiosis, and dysregulated inflammation. Traditional tools to study NEC include animal models, cell lines, and human or mouse intestinal organoids. While studies using those model systems have improved the field&#39;s understanding of disease pathophysiology, their ability to recapitulate the complexity of human NEC is limited. An improved in vitro model of NEC using microfluidic technology, named NEC-on-a-chip, has now been developed. The NEC-on-a-chip model consists of a microfluidic device seeded with intestinal enteroids derived from a preterm neonate, co-cultured with human endothelial cells and the microbiome from an infant with severe NEC. This model is a valuable tool for mechanistic studies into the pathophysiology of NEC and a new resource for drug discovery testing for neonatal intestinal diseases. In this manuscript, a detailed description of the NEC-on-a-chip model will be provided.

저자 스포트라이트: NEC-on-a-Chip 모델을 통한 이해 및 치료 전략 강화 

This protocol describes an in vitro model of necrotizing enterocolitis (NEC), which can be used for mechanistic studies into disease pathogenesis. It features a microfluidic chip seeded with intestinal enteroids derived from the human neonatal intestine, endothelial cells, and the intestinal microbiome of a neonate with severe NEC.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...

의학

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

생물학

상부 내시경 생검에서 인간 위 오가노이드 생성

Establishment and Characterization of Patient-derived Gastric Organoids from Biopsies of Benign Gastric Body and Antral Epithelium

Gastric patient-derived organoids (PDOs) offer a unique tool for studying gastric biology and pathology. Consequently, these PDOs find increasing use in a wide array of research applications. However, a shortage of published approaches exists for producing gastric PDOs from single-cell digests while maintaining a standardized initial cell seeding density. In this protocol, the emphasis is on the initiation of gastric organoids from isolated single cells and the provision of a method for passaging organoids through fragmentation. Importantly, the protocol demonstrates that a standardized approach to the initial cell seeding density consistently yields gastric organoids from benign biopsy tissue and allows for standardized quantification of organoid growth. Finally, evidence supports the novel observation that gastric PDOs display varying rates of formation and growth based on whether the organoids originate from biopsies of the body or antral regions of the stomach. Specifically, it is revealed that the use of antral biopsy tissue for organoid initiation results in a greater number of organoids formed and more rapid organoid growth over a 20-day period when compared to organoids generated from biopsies of the gastric body. The protocol described herein offers investigators a timely and reproducible method for successfully generating and working with gastric PDOs.

저자 스포트라이트: Generation of and Comparison Between Patient-Derived Gastric Organoids from Different regions of the Stomach(위의 다양한 영역에서 환자 유래 위 오가노이드 생성 및 비교) 

Gastric patient-derived organoids find increasing use in research, yet formal protocols for generating human gastric organoids from single-cell digests with standardized seeding density are lacking. This protocol presents a detailed method for reliably creating gastric organoids from biopsy tissue obtained during upper endoscopy.

양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화

Gastric patient-derived organoids (PDOs) offer a unique tool for studying gastric biology and pathology. Consequently, these PDOs find increasing use in a ...

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

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인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발은 미세 중력 하에서 성장

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 장 소기관을 사용 하 여 살 모 넬 라 및 기타 병원 균에 대 한 상피 세포 보호 연구 및 수정

생체 안전 수준 3 (BSL-3) 조건 하에서 병원체 감염 및 단일 세포 염기서열분석에 대한 위장 오르가노이드 적응

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화

양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화