Name: tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection
Uploaded: 2015-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

참고 :이 프로토콜은 다중 검출을위한 다중 검출기와 결합 된 HPLC 시스템에 PSF 열을 사용하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 독자를 가정하는 크로마토 그래피 및 다양한 HPLC 검출 방법에 대한 기본 지식과 경험을 가지고 작성되었습니다. 주의 : (메탄올, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 계측 공학 컨트롤의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합니다. HPLC 기기의 1. 설치 <ol><li> LIN 초순수 (예, 100 % 밀리 Q 물)를 가진 HPLC 기기를 준비전자의 모바일 위상 라인 B에 대한 100 % 메탄올 제조 업체 요구 사항에 따라 펌프를 제거. 사용되는 검출기 중 하나가 MS를하는 경우는, 여기로, 두 이동상 A와 B로 0.1 % 포름산을 추가 </li><li> 검출기 및 열 사이의 데드 볼륨을 최소화하기 위해도 2에 도시 된 바와 같이 HPLC 쓸모 요소 및 검출기를 설정한다.이 칼럼에 대해 검출기의 편리한 배치를 필요로한다. HPLC 시스템 구성의 유연성이 바람직하다. </li></ol> UV-VI와 MS 검출기 2. 설치 <ol><li> 관심의 샘플 (예를 들어, 280 ㎚)에 따라 원하는 파장의 UV-마주 검출기를 설정합니다. </li><li> 전체 검사 검출 방법을 이용하여 이온 총 개수 (TIC) 분석을위한 양성 모드에서 MS 검출기를 설정한다. 따라서 다음과 같은 파라미터를 조정할 MS : 증발기 온도를 500 60 유닛의 속도, 보조 가스 유동 설정 ° C, 모세관 온도 350 ° C, 시스 가스40 5 부에서의 가스 유동 및 분무 3.5 kV의 전압을 스윕. 이러한 설정은 분석 시료에 따라 특정 사용자 요구 나중에 조정할 수있다. </li></ol> DPPH • 시스템 감지기의 2,2- 디 페닐 -1- 피 크릴 급진적 (DPPH •) 시약 설치 3. 준비 <ol><li> DPPH • 25 mg의 무게 및 부피 플라스크에 메탄올 250 ㎖에 용해. </li><li> DPPH • 시약에 포름산의 250 μl를 추가합니다. 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 호일 플라스크 커버. </li><li> 10 분 동안 DPPH • 시약을 함유하는 플라스크를 초음파 처리. </li><li> 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 DPPH • 시약 DPPH • 펌프를 제거. </li><li> T-조각의 입구에 펌프 라인을 연결하여 그림 2에 따라 DPPH • 시스템을 설정합니다. </li><li> 토륨 100 μL 반응 코일을 부착T 피스의 E 출구와는 검출기 반응 코일의 다른 쪽 끝을 연결. </li><li> 및 열 히터에 반응 코일 싸는 60 ° C로 컬럼 히터 온도를 설정한다. </li><li> 520 nm의 DPPH • 자외선 - 마주 검출기를 설정합니다. </li></ol> PSF 열 4. 설치 <ol><li> HPLC 기기에 PSF 컬럼의 입구를 연결합니다. </li><li> 0.13 mm의 ID 튜브의 15cm 길이를 사용하여 MS 검출기에 중앙 포트를 연결합니다. </li><li> 0.13 mm의 ID 튜브의 15cm 길이를 사용하여 자외선 마주 검출기에 주변 포트를 연결합니다. </li><li> 0.13 mm의 ID 튜브의 15cm 길이를 사용하여 DPPH • 탐지 시스템의 T-조각에 다른 주변 장치 포트를 연결합니다. </li><li> 열 스토퍼를 사용하지 않는 주변 장치 포트 블록. </li><li> 분당 1ml의 HPLC 펌프의 유량을 가지고 -1 100 % B에서 행 - 100 % 메탄올 (0.1 % 포름산). </li><li> 100 % 메탄올 모바일 산도와 열 평형4.6 밀리미터 (내경) x 250mm 길이 컬럼에 대해 20 분 동안 ASE. 이 시간은 사용자가 이용할 수있는 다른 컬럼의 사이즈에 따라 스케일링된다. </li></ol> 5. 멀티 플렉스 검출을위한 PSF 열 조정 <ol><li> 적어도 두 개의 빈 수집 용기를 사용하여 분석 저울 (DPPH • 검출기 용 검출기 UV-비스 하나에 접속 포트 당 하나)의 질량을 측정한다. </li><li> 두 개의 사전 무게 수집 용기 (5.1)에 UV-VI와 DPPH • 포트에서 이동상를 수집합니다. 수집에 대한 기간을 기록한다. 각각의 용기에 용매의 적어도 500 mg의를 수집합니다. </li><li> 수집 용기를 달아 이동상의 질량을 결정한다. 0.791 g -1 ml의 메탄올 농도를 감안할 때, 각 포트로부터 수집 이동상 체적을 결정한다. </li><li> 차이에 의해, 즉, 공칭 펌프 세트 유량 마이너스 DPPH • 통한 유량 및 UV-비스 디텍R 흐름 포트, MS 검출기 유속을 결정한다. 총 유량의 비율로 각각의 유동 비율을 표현한다. 주의 : 이상적으로, 유동 비율은 : MS는 총 유량의 18 %되는, UV-비스 22 %로, DPPH • 검출기 60 %. </li><li> 그렇지 않으면, 검출기 UV-비스에 배압을 변경함으로써 유량 비율을 조절한다. UV-비스로 되돌아가 너무 높은 경우, 예를 들어, UV-비스 검출기의 콘센트에 0.13 mm 아이디 튜브 15cm 섹션을 추가 첨가하여 비중을 감소시킨다. 그런 다음 5.5 단계 5.1를 반복합니다. </li></ol> 6. 최종 설치 조건 <ol><li> DPPH • 검출기에 연결된 배출구를 빠져 나가는 동일한 유량 DPPH • 시약 펌프의 유량을 설정한다. 참고 : UV-마주 다중화 PSF 열, DPPH •와 MS는 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 연구는 특성화 및 다중 검출 병렬 분할 흐름 (PSF) 컬럼을 사용하여 HPLC를 사용하여 커피의 프로파일을 포함한다. PSF 열을 다중화 HPLC는 종래의 다중 검출 프로세스를 사용하여 소요 시간의 분획 내에 분자 특정 정보의 큰 정도를 획득하는 동안 샘플의 데이터의 복잡도를 감소시킴으로써 키 화학적 실체의 특성화 및 식별을 가능하게한다. PSF 열은 멀티 플렉스 검출을위한 플랫폼을 허용하지만, ?...

활동 흐름 기술 열 활성 플로우 기술 (AFT) 크로마토 그래피 컬럼은 최근 흐름 이질성 1-6과 관련된 분리의 비 효율성을 극복하기 위해 개발되었고, 또한 다중 검출을 가능하게 할 수 있습니다. 이 특정 통신 우리의 세부 사항에 병렬의 작동 과정은 다중 검출과 흐름 (PSF) 열을 분할. PSF 열의 키 기능적 장점은 : (1) 칼럼 베드의 방사상 중심 영역으로부터의 흐름은, (2) 검출 수단에 의해 처리되어야하는 이동상의 부피 유량의 주연 또는 벽 영역으로부터 격리 소스가 감소되고, (3) 검색 소스 각각 검출 프로세스를 통해 검출 지연을 주입하거나,이어서 포스트 칼럼 유동 스트림 7,8의 분할을 필요로하지 않고 샘플 정보를 확장 다중화 될 수있다. 수 PSF 칼럼의 디자인의 핵심 기능다중 검출 dvantage은 새로운 출구 피팅 및 프릿 조립입니다. (1) 기존의 컬럼에 비해 AFT 컬럼의 사진도. 이 분할 프로세스는 포스트 칼럼 유동 스트림 분할과 동일하지 병렬 분할 흐름 컬럼을 사용하여 얻어지는 것을 이해하는 것이 중요하다. 포스트 칼럼 흐름 스트림 (즉, 축 방향으로), 이에 따라, 각각의 흐름 스트림이 효율 및 민감도에 대한 동일 균등 샘플링 꼬리의 말단에 전연으로부터 샘플 전체 대역을 분할; 감도의 크기함으로써 분할 수에 의해 분할된다. PSF 그러나, 분할 프로세스 샘플 밴드 반경 방향, 축 방향하지. 이와 같이, 중앙 포트 샘플 피크 정점 - 피크의 가장 농축 영역. 피크가 확산 미행 지역에 따라 희석되지 않기 때문에, 여기에 감도는 최고입니다. 주변 포트에서 용출 샘플은 CENTRA에서만큼 효율적이지 않다밴드가 다소 축 방향으로보다 반경 샘플링되기 때문에 L 존하지만, 피크의 폭, 즉 축 방향으로 포스트 칼럼 분할 피크 분할 샘플링 프로세스의 경우보다 좁다. 따라서 농도 의존적​​ 검출기 감도가 감소되지 않습니다. PSF 열에서 출구 피팅 다중 출력 포트를 포함하고, 피팅이 단부의 내측에 환형 프릿이 수납된다. 출구 프릿 채널의 바깥 지​​름 부는 상기 주변 또는 벽 영역 출구 흐름 포트를 통해 칼럼 유출하면서이 환형 프릿 채널의 내부 부분은, 반경 방향 중심 유출구를 통해 칼럼 유출. 출구 프릿의 내측 및 외측 부분은이 흐름 영역 (2) 사이의 교차 흐름을 방지하는 불 투과성 배리어에 의해 분리된다. 이러한 설계의 결과로 칼럼 베드를 통해 중앙 방사상 유동 스트림 벽 영역 인 흐름으로부터 분리열을 IDE. 이들 두 영역에서의 흐름의 상대적인 부분은 분리 효율이나 검출 감도와 같은 열 기술의 다양한 기능적 측면을 최적화하기 위해 압력 관리를 통해 거의 모든 원하는 비율로 변할 수있다. 본질적으로, 이러한 설계는 효과적으로 더 좁은 내부 지름을 갖는, 큰 포맷 칼럼 &#39;가상&#39;항목에서 설정 한 칼럼 베드 이질성과 벽 효과 9,10 극복 진정한 벽없는 열과 그에 열 함수. PSF 컬럼의 주요 이점은 열 효율, 감지 소스 (S) 및 멀티 플렉스 검출을 가능하게하기위한 용매의 최소화 처리의 개선이다. 그러나, 추가적인 이점이 어떤 대역의 테일링 및 향하고있는 영역이 전체적으로 용출로부터 제거되기 때문에 용출 또는 검출에 용질을 프로파일 있다는 것은 달리 동일한 S 관찰되는 것보다 높은 농도로 존재채용 분할 비율에 따라, 종래의 칼럼에 주입하고 집중 하중 olute. 결과적으로 자주 PSF 컬럼 2 실시 분리 용 신호 강도의 증가가 관찰된다. 사실, 분할 비율은 네 개의 출력 포트 각각으로부터 흐름 종료 중 25 %, 자외선 (UV) 검출을 통해 관찰 된 신호 강도가 종래을 사용하여 알 수있는 바와 같이 동일한 신호 강도가 거의 보여 지도록 조정하면 이동상의 전체 (100 %) 7 열 분석된다. 또한, 중앙 및 벽 유동 출구 영역 사이의 비 미세 조정은 열 효율이 최적화 될 수있다. (1) 유량 (2) 분할 비, 및 (3) 용질 고정 계수 : 열 효율의 향상이 이러한 효율성 향상은 세 가지 요인의 함수이기 때문에, 하나의 값을 명시 할 수 없다 AFT 컬럼을 사용하여 관찰 . 그럼에도 불구하고, 효율 이익은 전환 수에 비해entional 열은 거의 항상 관찰하고, 이러한 이득은 때때로 이론적 플레이트 1,2- 수의 100 % 이상이다. 튜닝 기능은 분할 비율은 분석 효과적으로 &#39;가상&#39;칼럼의 직경을 조정할 수 있으며, 이는 검출 처리와 관련하여 중요한 인자이다. 분할 비율은 방사상 중앙 출구 포트로부터 용출 이동상 21 % 인 경우, 예를 들면, 가상 2.1 mm의 내부 직경 (ID) 열은 실제 4.6 mm ID 열에서 확립된다. 이러한 조건 하에서, 가상 2.1 mm ID 열은 유량에 따라, 종래의 2.1 mm ID 열보다 70 % 이상 더 클 수있다 효율성 및 용질 고정 인자 10 행한다. 멀티 플렉스 검출을 위해 사용되는 전류 PSF 컬럼 디자인은 4 포트는 출구 피팅 포함하지만, 열이 장착 될 수있는 2 포트는 최종 피팅 또한, 그러나,이 검출 t 제한두 검출기 오. 그 네 검출기 다중화 검출 범위를 넓히는 4 포트 출구 PSF 컬럼에 동시에 연결될 수를 제외하고이 열의 기본 동작은, 그러나, 동일하다. 이외에도 전후 열의 결합 튜브에서 유일한 추가적인 요구 PSF 열을 주변 출구 포트에 접속 될 수있는 튜빙, 각 튜브를 통과하는 이동상의 양을 측정 할 수있는 수단이되는 동작하도록, 일반적으로 질량 측정 또는 체적 측정 중. 튜닝을 용이하게하기 위해서, 모든 출구 유동 튜브의 내경은 동일해야한다. 둘레 방향 및 반경 방향 중앙 배출 포트 사이의 유동 비율은 단순히 끼워 주연 출구 또는 방사상 중앙 배출구에 호스 포스트 검출기의 길이에있는 튜브의 길이를 변화시킴으로써, 압력 관리의 사용을 통해 변경된다. 멀티 플렉스 감지 PSF 열을 사용하여 </stroNG&gt; PSF 열의 중요한 장점은 출구 배출 포트들의 각각은 다중화 따라서 검출을 가능하게하는 검출 소스에 직접 접속 될 수 있다는 것이다. 잘 설계된 검출 시스템에 다중화 검출 단일 분석 시료 내의 요소의 특성에 관해서 상당한 정보를 제공 할 수있다. 중요한 파괴 및 비파괴 시험 검출 지연없이 정확히 동시에 수행 될 수있다. 이것은 구성 요소가 UV 및 / 또는 질량 분광법 (MS) 검출로 응답 7,11 용출 관찰하여, DPPH • 시약을 사용하여 실시 예, 산화 방지제를 들면, 절대 할당을 허용한다. 따라서, 네 개의 독립 탐지기 네 출구 포트 중 통해 각 검출기에 관한 흐름의 적절한 부분들과 동시에 동작 할 수있다. 이들 포트를 통과하는 유동이 용이 검출기에 도달하는 모든 용질의 양을 조절할 수 있기 때문에 적합하도록 조절 될 수있다주어진 소스 검출기의 감도. 그것은 가장 효율적인 용질 이주 방사상 중앙 출구 포트를 통해 관측되는 점에 유의해야한다. 주변 각 포트에는 각 포트를 통해 25 %로 설정하면, 약간 덜 효율적인 기존의 열보다 동등한 분리 효율을 제공합니다. 이와 같이, 이것은 정량적 검출기 방사상 중앙 출구 포트에서 샘플을 분석하도록 설정하는 것이 중요하다. 다중화 검출 목적 PSF 열을 설정할 때 효율적이고 높은 품질의 결과를 달성하기 위해 만들어 질 필요 사항들이있다; 즉, 각 포트에 대한 튜브의 크기이며, 선택 검출기 및 유량 조정의 유형에있는 포트. 각 포트에 대한 튜브 치수 크로마토 그래피 후 컬럼 튜브의 길이가 분리 효율과 성능에서 중요한 역할을한다. 대형 마약 단속반검출기 열 콘센트에서 길거나 넓은 ID 튜브의 결과로 D-볼륨은 효율성, 해상도와 감도의 손실이 발생할 것입니다. 다중화의 이점을 제공하는 반면 효과적인 분리를 제공하는 최대 전위를 달성하기 PSF 열을 설정할 때, 따라서, 적절한 배관 사이즈가 이용되어야한다. 감지기 포트 그림 2는 다중 검출 (자외선 - 가시 (U-비스), 질량 분석기 (MS)와 2,2- 디 페닐 -1- 피 크릴 (DPPH •) 검출)의 예를 들어 설정의 그림입니다. 그림 중앙 포트 DPPH • 반면, MS 검출기에 부착되고 UV-비스 검출기 주변 포트에 연결되어 도시한다. MS는 세 가지의 가장 민감한 검출기 때문에, 중앙 배출구로부터 지시되었다이 검출기에 흐른다. DPPH • 감지으로 presenc에 선택적입니다산화 방지제의 전자,이 검출기에 흐름, 가장 민감하고 밴드 폭이 넓어에 가장 관대은 주변 포트에서 지시되었다. UV-비스 2 차 &#39;일반&#39;검출기, 그래서 제 주변 포트에서 지시 된이 검출기에 흐른다. 흐름 조정 튜브가 적절한 검출기 포트로부터 연결되면, 각각의 검출기로부터 나오는 흐름은 필요한 양으로 조정할 수있다. 각 검출기로부터 나오는 흐름의 양을 측정하는 간단한 방법은 주어진 기간에 걸쳐 각각의 포트를 통해 용출 이동상의 양을 계량한다. 백분율 흐름에 따라서 결정될 수 있으며, 유동 비율은 단축 또는 적절히 선택 검출기 요구 사항에 맞도록 검출기에 출구 라인에 연결된 호스를 길게하거나 조정할 수있다. 다른 탐지기의 예를 들면, 플로우 셀, 유동의 다양한 요구를 가지고형광 검출기 (FLD)는 유동 속도가 제한되지 않으며, 치료는 플로우 셀의 과압을 방지하기 위해주의해야한다. 따라서 FLD를 통해 흐름의 제어는 일반적으로 다른 검출기에 걸쳐 압력 강하 및 유량의 나머지 다음 FLD 통과를 조정함으로써 달성된다. 전달되는 유동의 양에 민감한 검출기 MS이다. 일반적으로, 현재의 하이 엔드 질량 분석기 용이 약 1~1.5 ㎖ / 적당히 수성 이동상 분을 처리 할 수​​있다. 이 유량 위, 소스의 홍수는 MS가 작동 할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 질량 분석기에서 검출 감도가 낮은 흐름 속도를 사용하여 이득되고; 따라서 PSF 흐름 분할 기능은 MS 검출과 관련된 애플리케이션에 매우 유용하다. 높은 열 체적 유량하지만 MS 검출기로 운반 저용량 부하와 함께, 이용 될 수있다. MS 검출기의 조정 흐름은, 그러나, 이전의 압력 강하를 조절함으로써 이루어질 수 있어야MS 검출기보다는 포스트 MS. 압력이 용이 부적절한 데드 볼륨을 추가하지 않고 조정될 수있다 여기 좁은 보어 튜빙 (0.1 mm의 ID)의 사용은 매우 유용하다. 검출기의 유형에 분할 비의 조정을 따라 전 또는 후 어느 검출기를 수행 할 수있다. 이러한 UV-비스를 사용하는 등의 비파괴 검출기는, 유동 비율을 측정 한 후 검출기를 조정하면된다. 단일 검출기 파괴가 설정된 다중화에 사용되는 경우 유동 비율은 다시 다른 포트 유동 비율에 대해 계산함으로써 결정된다. 시약 기반 검출기는 DPPH •로 사용되는 경우, 유동 비율은 시약의 첨가없이 포스트 검출기를 측정한다; 둘 이상의 파괴 검출기가 사용된다면, 그때 유량비 미리 검출기 측정된다. 인식 추가 계측, 이러한 DPPH • 필요할 수 있습니다 시스템, 흐름을 바꿀 수 있습니다 여분의 시스템 압력이있을 것이다백분율 일단 검출 시스템에 부착. 따라서,주의 깊은 고려가 파괴 검출기의 시스템 압력, 유량 비율을 조정 사전 검출기에 지불해야한다. 상관없이 임의의 포트를 통해 설정된 유량의 비율의 정량 정보는 적절한 표준화 통해 얻어 져야한다. 유량비가 설정되면, 그러나, 그들이 견고하고, 심지어 그들이 구배 용출 조건하에 7 변경하지 않는, 이 원고를 동반 상세한 비디오 프로토콜은 검출 다중화 모드에서 PSF 열 기능을 사용하고 조정하는 방법을 보여하기위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td>Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, pump.</td></tr><tr><td>Parallel Segmented Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.</td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td>Any brand</td><td></td><td>For blocking unused peripheral ports.</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr></tbody></table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

다중화 HPLC 분석 PSF 모드 (도 1)에 AFT 컬럼을 사용하여 수행하고,도 2에 도시 된 바와 같이 설정 하였다. 설정이 유형의 커피 샘플 전체에 UV-VI를 DPPH • 및 MS를 사용하여 동시에 분석하도록 허용 이온 수 (TIC) 모드. 도 3에 도시 된 바와 같이 크로마토 동시에 기록 되었기 때문에, 체류 시간의 조정에 기초하여 TIC 응답 - ​​응답 DPPH • 커피 시료...

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Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K 조회수.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

비디오: Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

연구

생체공학

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Photoacoustic Flowmetry를 사용하여 순환 흑색증 전지의 탐지 및 격리

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

화학

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

흐름 열 커튼 : 효율성과 감도의 최적화

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

공학

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

콜 로이드 반도체 나노의 체계적인 연구를 위한 모듈형 미세 기술

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.