EPSRC, HFSP, 한국의 국립 연구 재단 (부여 번호 R11 - 2009 - 044-1002 - 0K20904000004 - 09A050000410) : 저자는 다음과 같은 연구위원회와 보조금의 지원을 인정하고 싶습니다.

1. 마이크 로칩 제조 <ol><li> SU8 마스터 제작. 30 S.를위한 3,000 RPM에서시 웨이퍼 40 μm의 높이, 스핀 코트 SU8 - 50 (MicroChem 주식 회사)의 microfluidic 채널을 얻으려면 65 핫 접시에 부드러운 빵을 ° 5 분, 95 C ° C 용매를 증발하고 필름을 densify 30 분. 아래로 냉각 후, SU8가 적절한 마스크 아래에 300 MJ / 2에서 360-440 nm의 방사와 저항 노출. 다음 노출, 65에서 웨이퍼를 구워 ° 사분 2 분 95 ° C에 대한 C. 냉각 후, 감동과 함께, 5 분 unexposed 영역을 (Micrpoposit EC 용제, Chestech) 개발 5. 사용하여 신선한 웨이퍼를 씻어하고 깨끗한 표면을 생성하는 가스에 따라 그것을 건조 용매 EC. 헥산 및 메탄올 세척과 웨이퍼를 처리합니다. 표면에 실란 trichloro 증발의 마지막 단계 (1,1,2,2 - perfluoocytl) (40 분 건조기)와 SU8 마스터 제조 과정을 완료하십시오. </li><li> PDMS curinG, 다이싱 및 홀 - 펀칭. 구조 microfluidic 기판을 형성하기 위해, 우리는 마스터를 통해 부어 다음 crosslinker에 수지 10시 1분 (W / W) 비율 Sylgard 184 (다우 코닝)을 혼합합니다. 다음 건조기에서 가스를 제거하다, 그리고 65 한 시간 동안 장치 (위 계층)을 치료 ° C. 마스터에서 치료 PDMS와 껍질을 잘라. 생검 펀치를 사용하여 유체 튜브에 대한 액세스 구멍을 만듭니다. 65 20 분 동안 PDMS의 또 다른 계층 (균등 10x10 cm 배양 접시에 확산 수지 8 G) ° C. 치료 하단의 레이어에 준비 상위 레이어를 삽입하고 65 하룻밤 치료 ° C. 사용하기 위해 페트리 접시와 주사위에서 칩 껍질. </li></ol> 2. 실험 설정 <ol><li> Microfluidic 설정 <ol><li> 기포가가 튜브의 부분에 남아 있도록, 필요한 솔루션 주사기를 (Beckton, 디킨스와 회사 또는 SGE 분석 과학에서 플라스틱이나 유리) 입력합니다. 비말 생성을위한 두 단계가 사용됩니다. 수성 (분산) phasE는 관심의 시약 (예 : 성장 매체 세포의 정지, 또는 분자 fluorophores의 솔루션)이 포함되어 있습니다. 이 경우 지속적인 단계 역할을 석유 단계는 일반적으로 기름과 계면 활성제의 혼합물, 플루오르 기름의 예 2 % 레인 댄스 계면 활성제 (레인 댄스 기술) (3M Fluorinert 전자 액체 FC - 40)에서 형성, 또는 2% 스팬 미네랄 오일 80 (Croda). </li><li> 바늘 한 끝에 주사 바늘 팁과 같은 내부 직경의 튜브 (폴리에틸렌 튜브, 하버드 장치)를 맞습니다. 튜빙은 vibrational perturbations로 인한 흐름 불안정을 최소화하기 위해 가능한 최단 길이로 절단한다. </li><li> 직접 PDMS 기판에 구멍 뚫은 구멍으로 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 이러한 실리카 모세관 포트 또는 커넥터 (예 : Upchurch의 Nanoports)의 사용으로보다 복잡한 솔루션은 또한 microfluidic 장치와 튜브 사이에보다 강력한 인터페이스를 구현할 수 있습니다. 콘센트를 연결수집 (폐기물 수집 또는 추가 analyte 처리)로 튜브와 직접하는 칩의 포트. </li><li> 주사기 펌프 (예 : PHD 4400 Hpsi 프로그램 주사기 펌프, 하버드 장치)에 주사기를 탑재하고 각 단계 (보통 분당 microliters의 주문)에 대한 원하는 일으키는 흐름 속도를 정의합니다. 1 오일 / 수성 흐름 요금의 최소 비율은 불안 정한 비말 형성 (장치 기하학에 따라 다름)로 이어질 것입니다 수성 단계에 의해 PDMS의 젖음을 방지하는 것이 좋습니다. 같은 이유로, 그것도 처음 수성 단계의 도입 전에 모든 microfluidic 채널을 통해 혼자 기름 단계를 플러시하는 것이 좋습니다. 실험에 본에 사용되는 최종 설정은 그림 2A에서 그림입니다. </li></ol></li><li> 광학 시스템 설치 <ol><li> 높은 공간과 시간적 해상도 microfluidic 채널 내의 작은 볼륨 (아래 몇 picoliters)를 탐사하려면 공촛점 현미경 (자동 판매기와 함께 사용에드 submicron 위치 용량). </li><li> 이상 높은 양자 수율로 수용성 형광 분자를 사용합니다. 관련 형광단의 흡수와 일치하는 파장의 레이저 작동을 사용하여 분자를 자극. 예를 들어, 플루오레신 5 isothiocyanate (FITC)와 알렉사 - 형석 488과 같은 일반적인 형광 분자가 효율적으로 488 NM 다이오드 레이저 (예 : PicoQuant GMBH, LDH - PC - 485)를 사용하여 흥분하실 수 있습니다. 같은 텍사스 레드 Allophycocyanin (APC)로 형광 분자가 효율적으로 사용하여 633 nm의에서 나온 수있는 그 / Ne 레이저 (예 : 뉴 포트 R - 31425). </li><li> 반복 몇 MHz 이상의 속도 (여러 NS 펄스 분리)와 형광 수명 이미징 (FLIM) 실험 충분히 차별화된 평생 특성 fluorophores에서 운영 펄스 레이저를 사용합니다. </li><li> 빔 높이뿐만 아니라 빔 방향을 제어 빔 - 스티어링 거울과 광학을 사용합니다. </li><li> 목적 리터에 레이저 광선을 반영하기 위해 이색성 거울을 사용팔. 이 레이저를 동시에 사용할 경우, 듀얼 밴드 이색성 거울은 두 레이저 빔 (채도 기술 공사에서 z488/633rdc 미러 이상적입니다 488과 633 nm의 광선에 대한 예)의 반사를 허용하도록 설치할 수 있습니다. </li><li> microfluidic 채널 내의 꽉 초점 레이저 빛을 가지고 무한대 - 수정, 높은 수치 개구 (NA) 현미경의 목적 (예 : 올림푸스 60 X / 1.2 NA, 물 침수)을 사용합니다. 키 microchannels (&gt; 100 μm의) 작업을 할 때 사용하는 목적은 적절하게는 작동 거리가 효과적으로 microchannel의 전체 높이를 포함하도록 선택해야합니다. </li><li> 같은 높은 NA 목표와 같은 이색성 거울을 통해 전송을 사용하여 샘​​플 (microfluidic 채널 이내)에 의해 방출되는 형광을 수집합니다. </li><li> 싱글 또는 듀얼 밴드 방출 필터를 (예 : 채도 기술 공사에서 z488/633 필터)를 사용하여 잔여 여기 라이트를 제거합니다. </li><li> 형광 emissio에 초점을N 렌즈 볼록 렌즈 (예 : 50.2 F, 뉴 포트 (주))를 사용하여 75 μm의의 핀홀에. 현미경 목표의 공촛점 비행기에 핀홀를 놓습니다. </li><li> 이 감지기에 형광 신호를 분할하기 위해 다른 이색성 거울 (예 : 630dcxr, 채도 기술 주식 회사)를 사용합니다. </li><li> 방출 필터 (예 : 채도 기술 공사에서 hq540/80 m 필터)와 이색성 거울에 의해 반사 형광을 필​​터 및 렌즈 볼록 렌즈로 초점 (예 : F = 30.0, ID 25.4 mm, Thorlabs) 첫 번째로 ( &#39;녹색&#39;) 검출기. 보조 빨간색 형광단 관련된 실험은 다른 방출 필터 (예 : 채도 기술 공사에서 hq640lp 필터)와 이색성 거울에 의해 전달되는 형광을 필​​터링하고 두 번째 ( &#39;빨간색&#39;) 검출기에 다른 렌즈 볼록 렌즈로 초점을하십시오. </li><li> 형광 광자의 검출을위한 애벌란치 photodiodes (예 : AQR - 141, EG &amp; G, Perkin - 엘머)를 사용합니다. 최종 설정은에서 그림입니다 <str긴 사연이&gt; 그림 2B. </li></ol></li></ol> 3. 비말 생성 및 데이터 수집 <ol><li> 비말 생성 방법 <ol><li> 당신은 방울을 생성하는 microchannels의 두 가지 주요 구성을 사용할 수 있습니다. 흐름이 형성 방울 자체 microchannel처럼 넓은대로 두 가지 방법은 한 동일 형식 (그림 3A 및 3B) 6,7을 집중하거나 T - 교차점. 함께 두 혼합할 체액을 가지고하고 인터페이스 개발 이후 모세관 불안정은, monodisperse의 방울이 (몇 femtoliters만큼 작은) 자발적으로 생성되는 이러한 형상을 사용 발생하는 전단 세력의 결과로. </li><li> 당신은 다른 방법으로 시약을 캡슐 수 있습니다 시약은 준비하고 혼합 칩에서 원하는 혼합물 / 농도, 또는 그들은 이전에 비말 형성 (그림 3C)에 함께 결합 후 칩에 별도로 가져와서 수 있습니다. 이혼합 / 농도가 단순히 상대적인 흐름 속도를 조정하여 변경할 수 있습니다 때문에 마지막 방법은 높은 유연성을 제공합니다. 이것은 세포 캡슐위한 주사기의 세포 현탁액이 실험의 timescale을 통해 세포의 응축을 피하기 위해 만들어 냈다해야한다는 지적이다. </li></ol></li><li> 형광 데이터 수집. <ol><li> 데이터 다기능 DAQ 장치에 애벌란치 photodiode 검출기 (2.2.12에서 설명한)에서 커플이 전자 신호 로깅 (예 : PCI 6602, 내쇼날 인 스트 루먼트), 개인 컴퓨터에서 실행. </li><li> FLIM 실험은 시간 상관 단일 광자 계산에 감지기를 연결을위한 (TCSPC) 카드 (예 : TimeHarp 100, PicoQuant GmbH를) 별도의 PC에서 실행. 각 감지 형광 광자가 입사 레이저 펄스에 상관이며, 따라서 각 방출 형광 광자가 지연 시간을 할당됩니다 :이 카드는 TCSPC 방법론을 사용하여 얻을 수 형광 수명 데이터 수 있습니다. 이 데이터는형광단 / s의 발광 속도 계수 / s의의 평가를 얻기 위해 단일 ​​또는 다중 지수 감쇠 곡선에 장착되어 수 있습니다 검출기의 악기 응답 함수 (IRF)로 원시 데이터를 Deconvolute : 이것은 낮은 농도 Auramine - O 솔루션 (몇 picoseconds의 형광 수명을 전시하는)를 사용하여 얻을 수 있습니다 8. </li></ol></li></ol> 4. 방울 내에서 혼합의 세포 인식 및 매핑 <ol><li> 방울 내에서 혼합의 세포 인식 및 매핑 <ol><li> 대장균 맨에게 생존 분석 실험 10 변형을 사용합니다. 문화 하룻밤 Luria - Bertani 국물에 세포 사전 실험 0.5 광학 밀도를 일치합니다. </li><li> 세포의 생존을 검출 0.4 μm의 SYTO9 1 μm의의 propidium 요오드화물의 사용하십시오. 모두 DNA - intercalating 염료이며, 자신의 형광 강도는 DNA와 결합시 20 폴드에 의해 증가합니다. SYTO9 나에게는 녹색 형광 염료입니다mbrane 투과 및 propidium 요오드화물의 막 스며들지는 빨간색 형광 염료입니다. 죽은 세포가 모두 &#39;녹색&#39;과 &#39;빨간색&#39;배출량을 전시하는 동안 따라서 사는 세포는 &#39;녹색&#39;을 형광. </li><li> 녹색 / 빨간색 형광 검출을위한 2.2에 도입된 설정)을 사용합니다. </li><li> 세포 침전을 방지하기 위해 7mm 자기 저어 바가 장착되어 3mL BD plastipak 주사기 내에서 세포 정지를 저어하는 휴대용 미니 자석 활동가를 (유타 바이오 디젤 공급, 유타)를 사용합니다. </li></ol></li><li> FLIM를 사용하여 혼합 이벤트 매핑 <ol><li> 방울이 흐르는되는 함께 microchannel의 절반 높이의 광학 프로브 볼륨을 중점을두고 있습니다. </li><li> 이 수성 솔루션 (그림 3C에서와 같이) 다른 특성 형광 수명과 함께 (비 상호 작용) 형광단를 포함하는 각 양식 방울. </li><li> 채널의 한쪽에서 시작, 1 μm의 간격으로 채널의 전체 너비를 따라 각각의 실험을 수행합니다. 채널 에드레이저 빔을 그들 가까이에 초점을 맞춘되면 형광 강도가 크게 방울로 릿지 쉽게 확인할 수 있습니다. </li><li> 오일 위상의 소음 배경에서 신호 버스트를 (방울과 관련된) 구분하고 각 버스트의 기간을 설정하는 알고리즘을 구현합니다. </li><li> 실험이 수행되고있는 특정 너비 각 소적의 길이를 따라 지연 시간과 강도 값을 추출하는 두 번째 알고리즘을 구현 9. </li><li> 그런 다음 실험에서 각 비말에 대한 형광 수명을 평가하는 최대 가능성 견적 (MLE) 알고리즘을 사용합니다. 8 실험의 모든 방울에 대한 평생 값을 평균 MLE 계산의 마지막 오류 (더 방울이 탐지를 감소 오류가 작은). </li><li> 평생 궤도 각 너비 획득되면, 2D지도에있는 모든 탄도를 결합. 각각의 평생 가치는 particu와 관련된 있기 때문에고맙다 두 fluorophores의 혼합물은 농도 (또는 혼합)지도함으로써 얻을 수 있습니다. </li><li> 선택, 소적 믹싱의 3D지도는 쉽게 microfluidic 채널의 높이를 따라 다른 위치에서이 프로토콜을 반복하여 얻을 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 원시 실험 데이터 파일에 적절한 컴퓨팅 언어로를 Reinterpret 그래서 그들은 더 이상 분석할 수 있습니다 (시간이지나면서 광자 카운트의 변화를 포함 예를 들어 텍스트 파일, 쉽게 데이터 처리 및 분석을위한 Matlab으로 추출 수 있습니다.) 당신은 MLE 알고리즘을 실행하거나 평생 궤도에서 혼합 패턴의 2D지도를 구축하기 위해 더 복잡한 실험 파일 (예 : FLIM에 대한 것과 같은) 또는 순서에 포함된 데이터에 액세스하기 위해 특정 코드를 작성해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 세포 인식 var에의 전형적인 예입니다세포 기반의 실험 시간의 함수로 계산 광자의 iation는 이백 밀리초의 기간 동안, 그림 4A 및 C에 표시됩니다. 중요한 Luria - Bertani 국물 (LB 매체) 수성 비말 경계를 정의 약하게 fluorescing 배경 역할, 개별 세포의 존재에 해당하는 별개의 광자 파열을 반면이 배경 위에 구분할 수 있습니다. LB 형광 배경이 약 직사각형 단면 (빨간색과 초록색 점선으로 표시)이 특징입니다. 형광 파열의 전체 폭 절반 최대 (FWHM)은 E. 인한 대장균 세포는 상대적 방울의 길이 (30 picolitres의 볼륨에 해당하는 40 미크론)과 E.과 일치 배경 비말 행사보다 30 배 단축됩니다 대장균 세포 (1.5-2.0 미크론) 10. 듀얼 채널 검색을 통해이온 시스템, 라이브 세포 또는 죽은 세포의 존재는 녹색과 빨간색 채널의 분석에서 구별하실 수 있습니다. 그림 4 B와 D는 소적 당 세포의 숫자를 설명하는 확률 분포를 보여줍니다. FLIM를 사용하여 혼합 이벤트 매핑 분자 형광 수명은 자사의 화학적 환경에 영향을받습니다 개별 형광단의 본질적 속성입니다. 따라서 그 성능은 같은 농도, 여기 강도, 광학 모음으로 실험적인 요소 (에 의존 시간을 통합 형광 측정,보다 우수한 해상도와 정밀도와 환경 정보 (예 : 솔루션 산도, 온도, 극성과 점도 등)을 구하는 데 사용할 수 있습니다 효율성). 9,11 마찬가지로 다른 제공, 8 디 두 fluorophores을 사용하여 방울 내부의 혼합 패턴을지도하는 것이 가능fferent 평생 값. 등식 1에 표시된대로 두 (비 상호 작용) 형광 종을 포함하는 혼합물에서 부패가 biexponential 양식에 걸릴 것입니다 : <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq1.jpg" alt="등식 1" /> 각각의 수명은 τ1 및 τ2로 정의하며, 각 구성 요소의 진폭은 각각 α1과 α2에 의해 주어진다. 평균 수명은 다음 다음과 같이 정의할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq2.jpg" alt="방정식이" /> β1과 β2는 각 구성 요소의 분율이며 다음과 같이 정의됩니다 장소 : <img src="/files/ftp_upload/3437/3437eq3.jpg" alt="등식 3" /> 프로브 볼륨이 고정되어 있으며 방울이 그 자리에 걸쳐 흐르는 때문에, 일생 일대의 궤도가 특정 너비의 방울의 길이를 따라 값을 따라서 얻을 수 있습니다. averag 특정 넓이에 대한 특성 궤도,6000 방울 중 에드는 그림 5A에서 볼 수 있습니다. 채널의 전체 너비에 걸쳐 궤도를 결합하는 것은 2D 농도 (또는 혼합)지도의 형성에 이르게한다. 전형 결과는 그림 5B에 표시됩니다. 방울 많은 가운데 그 결과를 평균하여 얻은 결과의 표준 오류는 크게 (그림 5A에 대한 95 % 신뢰 구간과 표준 오차 1 %) 줄일 수있다. 평생 궤도의 결정 방법은 모든 방울들이 실질적으로 동일하다고 가정합니다. 방울이 크게 달랐다면, 얻은 평균 수명의 탄도는 (그리고 평균 방울의 길이를 따라 평생 날카로​​운 차이를 지속적으로 감지), 덜 diverging 프로필을 아첨 것이다 : 이것은 두 가지 이유로 대부분 올바른 것으로 입증됩니다. 또한, 결과에 관계없이 개인의 재현성 아르방울은 분석이나 방울의 크기가 계산에 사용 8. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig1.jpg" alt="그림 1" /> microfluidic 칩 제조의 그림 1. 프로세스 흐름. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 비말 형성을위한 microfluidic 칩에 연결된 주사기 펌프와 주사기, 대표) 다이어그램, 두 레이저에 대한 전형적인 광학 설치의 B) 도식 표현 - 두 형광단 (녹색과 적색) 여기와 감지.. DC = 이색성 거울, EM = 방출 필터, L = 렌즈, PH = 핀 홀, APD = 애벌란치 photodiode 검출기. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 온칩 비말 형성 전략 :) 흐름 초점을 구성, B) T - 접합 구성.. C) 박사의 칩 캡슐에이 원래 별도의 수성 시약의 oplets. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 광학 (가) 죽은 기록된 0.2의 흔적을 판독하고 (C) 라이브 셀 (세포 현탁액에 대한 유동 속도 : 1 μl 분 -1, 기름 : 2 μl 분 -1).. 각 아치 모양의 신호는 점선 라인으로 표시 비말 경계와 수성 비말을 형성 약하게 형광 LB 매체에 해당합니다. 녹색 신호는 633 나노미터 파장 633nm 이상의 붉은 신호에 따라 기록을 나타냅니다. 세포는 DNA intercalating 염료로 인해 발생하는 수직 스파이크로 구분할 수 있습니다. (B) 죽은 세포 및 (D) 라이브 셀 하나의 방울 내에서 세포 인에 대한 확률 분포. <img src="/files/ftp_upload/3437/3437fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5 특정 너비의 비말의 길이를 따라) 전형적인 평균 수명 궤도;. B)모든 평균 궤도의 결합의 전형적인 표현 (%의 FITC / % STR - AF488으로 표현 또는 농도) 2D 평생지도에 방울의 전체 너비를 따라 탐지.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 microfluidic 장치의 제조, 실험 설치 및 microdroplet 형성 및 시약의 캡슐화 및 처리 방울의 광학 검출을위한 관련 프로토콜을 설명합니다. (물방울에서 단일 세포의 탐지 및 흐르는 방울 내부 믹싱 프로세스의 매핑)을 선택 두 예제는 현재의 비말 microfluidics로 조사되고 일반적인 응용 프로그램을 나타냅니다. 제시 실험 설명으로, 비말 microfluidic 플랫폼의 사용하지만, 그러한 높은 처리량, 유사 완벽한 감금, 높은 재현성 ... 생산 정보의 대량이 정보가 생성되는되는 고속 같은 특정 매력적인 특성을 제시 전체 장점이 소형 플랫폼에서 얻은 수있다면 높은 spatiotemporal 해상도로 빠르게 감지 방법의 사용을 필요로합니다. 이 경우 우리는이 것을 입증가능한 매우 정밀한 형광 spectroscopic 기법을 사용합니다. 특히, FLIM 검색 기술은 (몇 NS로 짧은 같이 반복 기간을 가진 펄스 레이저를 사용합니다)을 빠르게 흐르는 방울 (초당 200의)에서 매우 빠르게 정보를 얻을 수있는 용량을 나타낸다. 이 경우에는 검색 이벤트의 시간 해상도는 1 μs만큼 낮았다. 소적 크기와 농도 한계의 측면에서 큰 수치 조리개 렌즈와 큰 파워 레이저의 사용은 쉽게 5 μm의 (작은 물방울의 크기에 제한이 photolithographic의 결의에 의해 부과되는만큼 작은 방울 이내 NM의 농도의 검출을 허용 것입니다 submicron의 위치 단계의 제조 공정과). Microfluidic 방울 내려 하나의 대상 / 이벤트, 시약 소량 관련된 대규모 실험을 수행하기 위해 적합한 후보입니다. 이 기술의 현재 한계 박사를 생성하는 어려움을 포함높은 처리량 방법으로 다양한 소스의 대형 다양한 (수십 또는 수백)에서 oplets. 또한 생성된 각 단일 비말를 타겟으로하고 조작하는 어려움이 기술의 실제적인 적용에 심각한 제한을 부과. 따라서, 이러한 문제는 높은 처리량 어플 리케이션에서 연구와 분석의 표준 참조 방법이 될 microfluidic 비말 플랫폼을 가능하게 필요한 기술 솔루션을 개발하기위한 중요한 연구 노력의 중심에 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 플루오레신 5 isothiocyanate (FITC) </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidin - 알렉사 형석 488 </td><td> 시약 </td><td> 분자 프로브 </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 상반기, 상반기, 2 시간, 2 시간 - perfluorooctanol </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 370,533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 시약 </td><td> 프리미어 Farnell 영국 LTD </td><td> 1,673,921 </td></tr><tr><td> auramine - O </td><td> 시약 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 861,030 </td></tr><tr><td> 485 NM은 다이오드 레이저를 펄스 </td><td> 장비 </td><td> PicoQuant </td><td> LDH - PC - 485 </td></tr><tr><td> TCSPC 카드 </td><td> 장비 </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> 이색성 거울 </td><td> 장비 </td><td> 채도 기술 주식 회사 </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> 현미경의 목적 </td><td> 장비 </td><td> 올림포스 산 </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> 눈사태 photodiode </td><td> 장비 </td><td> AQR - 141, EG &amp; G, Perkin - 엘머). </td><td> AQR - 141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidium 요오드화물의 </td><td> 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> 대장균 상위 10 변형 </td><td> 셀 </td><td> Invitrogen </td><td> C4040 - 10 </td></tr></tbody></table>

fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

화학 및 생물학을 수행하기위한 microfluidic 플랫폼의 개발은 많은 부분에서 시스템 소형화를 수반하는 잠재적인 혜택의 범위에 의해 주도되었습니다. 장점 효율적 샘플, 기능 구성 요소의 손쉬운 통합, 대규모 멀티플렉싱, 향상된 처리량 분석, 향상된 제어 및 감소 기악 발자국 대한 본질적인 소인의 femoto 리터 볼륨 투 나노를 처리하는 능력을 포함합니다. 1 최근에 많은 관심 비말 기반 (또는 세그먼트 흐름) microfluidic 시스템과 높은 처리량 실험에서 플랫폼으로서의 잠재력 개발에 초점을 맞춘 있습니다. 여기 2-4 물 인 석유 emulsions가 저절로 microfluidic 채널 형태로 만들어진다 두 혼합할 단계 사이의 모세관 불안정의 결과로. 중요한 것은 정확하게 정의된 볼륨 작곡의 microdroplets는 주파수에서 생성할 수 있습니다몇 kHz에서 중. 또한, 지속적인 혼합할 위상, 샘플 교차 이야기 모두와 분산 (확산 및 테일러 기반)로 구분하여 격리된 구획 이내에 관심 시약을 캡슐로 제거 할 수있는 최소한의 교차 오염 및 시간 분석 프로세스를 수있는 능력으로 연결 아주 정확하게. 또한, 방울의 내용과 채널 벽 (지속적인 단계에 의해 침수되는) 사이에 접촉이 없기 때문에 채널 벽에 시약의 흡수 및 손실 방지합니다. 이런 종류의 방울이 생성되고 처리되면, 그것은 필요한 분석 정보를 추출하는 것이 필요합니다. 이러한 측면에서 선택의 검출 방법은 빠른 될 높은 감도와 검출의 낮은 한계를 제공하고, 분자 종의 범위에 적용되어야 비 파괴하고 손쉬운 방식으로 microfluidic 장치와 통합 될 수 있습니다. 우리가 같이 개발한이 요구를 충족시키기 위해실험 도구와 작은 볼륨 환경에서 photophysical 정보의 대량의 추출을 활성화하고, 물리적, 화학적 및 생물 학적 매개 변수의 다양한 범위의 분석에 적용되는 프로토콜 uite. 여기에 이​​러한 방법 중 두 예제는 소개와 단일 세포 및 picoliter - 볼륨 방울 내부 믹싱 프로세스의 매핑의 감지에 적용됩니다. 우리는 microfluidic 칩 제조, 광학 설치 및 비말 생성 및 검출 과정을 포함한 전체 실험 과정을보고합니다.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.0K 조회수.  Imperial College London. 그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

연구

생체공학

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

단백질 접기 유학을위한 Microfluidic 믹서

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

높은 처리량 마이크로 유체 신속하고 저렴한 비용으로 프로토 타입 포장 방법

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 &#181;L of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

판막 다층 미세 유체 장치에 대한 여러 단계의 변수 높이 포토 리소그래피

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...