We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

엑소의 분리 및 정제 과정의 일반적인 그림은 그림 1에 나와 있습니다. 전체 혈액을 건강한 자원 봉사 기증자와에 모리 대학의 희망 클리닉과 그래 디 건강 시스템의 감염증 프로그램에 참석 항 레트로 바이러스 theraoy를 수신하지 HIV 양성 개인로부터 얻은 것 애틀랜타, 조지아. 본 연구는에 모리 대학과 의학의 모어 하우스 대학의 제도적 검토 보드에 의해 승인되었다. 연구에 참여하는 모든 사람은 서면 동의를 통보했다. 혈장에서 엑소 좀 1. 준비 <ol><li> 인간의 혈액 수집 및 처리 <ol><li> (18 mg의 칼륨 EDTA를 함유 함) EDTA 혈액 수집 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 혼합 5 배를 반전. </li><li> 혈액 세포 펠렛을 실온에서 20 분 동안 1,000 XG에서 혈액 수집 튜브를 원심 분리기. 멸균 피펫을 사용하여TE는 25 ㎖ 원뿔형 튜브에 혈장 분획 (4-5 ml)에 전송한다. 1 X PBS 10 mL로 혈장 희석. 생물 폐기물 용기에 적절하게 마킹 (또한 PBMC라고도 적혈구 및 백혈구)의 혈액 세포를 버린다. 주 : 감염되지 않은 공여자의 혈액 샘플의 경우에, PBMC는 상기 사용 (이하, 절차 IV.2 참조)를 위해 예약 될 수있다. </li><li> 단기 (2-3 일간) 또는 장기 저장을 위해 -80 ℃로 4 ℃로 플라즈마 샘플을 저장합니다. 참고 : 추가 처리를하기 전에 4 O C에 어떤 냉동 혈장 샘플을 가져와. </li></ol></li><li> 플라즈마로부터 엑소 분획 제제 <ol><li> 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 플라즈마 세포 파편을 제거합니다. 깨끗한 25 ML의 초원 심 분리기 튜브에 삭제 플라즈마 뜨는을 전송하기 위해 멸균 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 생물 학적 용기에 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 2 10 만 XG에서 삭제 플라즈마를 원심 분리기4 ℃에서 시간은 큰 소포를 제거합니다. 피펫 조심스럽게 100,000 XG 상층 액을 제거하고, 생물 학적 폐기물 폐기합니다. 깨끗한 튜브로 1X PBS 1 ㎖에 100,000 XG 펠렛을 재현 탁하고 부드럽게 이동시키다 분리 입자 소용돌이, 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> PBS의 25 ㎖를 추가하여 중단 100,000 XG 엑소 / 바이러스 펠렛을 씻으십시오. 부드럽게 한 후, 혼합하여 4 ℃에서 2 시간 동안 100,000 XG에서 다시 원심 분리기 튜브 다섯 번 반전. 생물 학적 폐기물 용기에 PBS 세척 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 1 X PBS 1 ㎖에 100,000 XG 펠렛을 재현 탁하고시키다 펠렛을 용해 소용돌이 부드럽게 30 분 동안 RT에서 배양한다. 주 : iodixanol 그라데이션 단계까지 1-2일 4 ℃에서, 엑소 좀과 바이러스 입자를 함유하는, iodixanol 그라데이션 단계로 바로 진행 펠렛을 저장하는 것이 가능하지 않은 경우. </li></ol></li></ol> 엑소 좀 2. 정제 <ol><li> 6 % -18 %의 veloc 생성이중 챔버 구배 전자 장치를 사용 iodixanol 성만의 기울기. <ol><li> PBS에 희석하여 물에서 60 % 용액으로서 공급 iodixanol 시약 6 % 및 18 % 용액을 준비한다. 피펫 5.5 교반 챔버 내로 18 % 용액 ㎖, 및 피펫 저장 챔버에 6 %의 용액 5.5 mL로. , 교반기를 켭니다 마개를 열고 각각의 기울기는 14 ML의 초 원심 분리기 튜브로 유입 할 수 있습니다. 참고 : 즉시 사용하거나 사용하기 전에 4 ° C에서 준비 그라데이션 O / N를 저장 중 하나. </li><li> 신중하게 각 11 ㎖의 구배의 정상에 엑소 / 바이러스 액 1ml 계층. SW40Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ℃에서 2 시간, 250,000 XG에 원심 분리기 그라디언트. </li><li> 12 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 레이블. 구배의 상부로부터 1.0 ㎖의 튜브를 제거하고 1 번에 옮긴다. 순차적으로 튜브 2-12에 남아있는 1ml의 분수를 전송합니다. 참고 : 맨 위 부분은 이렇게 # 1, 바닥 분수, # ​​12이 될 것입니다. 성4 ° C에서 그라데이션 분수 광석. 4 ℃에서 보관시 구배 상단 분획 1-3이어야 정제 엑소 좀은 3-4 주 동안 안정하다. </li></ol></li></ol> 3. 엑소 특성 <ol><li> 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 활동 분석 <ol><li> 1X PBS 1 ml의 아세틸 콜린 요오드화 28.9 mg을 혼합하여 100 mM의 기판 재고를 준비합니다. 1개월에 -20 ° C 최대 스토어 기판 재고. </li><li> 1X PBS 10ml에 벤조산 39.6mg과 탄산 수​​소 나트륨 15 mg을 혼합하여 10 mM의 색상 표시 주식을 준비합니다. 최대 2 주, 4 ℃에서 보관 색 표시 재고. </li><li> (예를 들면 10 ㎖ + 1X PBS 200 ㎕를 기질 + 500 μL 색 표시기)를 5 : 1 : 100의 비율로 혼합 1X PBS, 기판, 및 컬러 표시하여 측정 시약을 제조. </li><li> 96 웰 microtite의 우물로 전송 (프로 시저 III.3에서 1-12로 표시) 각 1.5 ml의 그라데이션 분수 관에서 50 μLR 판. 각 그라데이션 샘플에 대해 중복 우물을 준비합니다. </li><li> 첫 번째 PBS에 2000 μU / ml의 아세틸 콜린의 주식을하여 표준 세트를 준비합니다. 확인 11 개의 2 배 콘텐츠의 연속 희석하고, 마이크로 타이 터 플레이트의 단일 웰에 각 희석액 50 μL를 추가되도록 표준 # 1 = 2,000 μU / ㎖, # 2 = 1,000 μU / ㎖, # 3 = 500 μU / ㎖, 등 # 12 = 0.98 μU / ㎖까지. 열두 시린 표준 따라서 96- 웰 분석 플레이트의 하나의 행을 차지한다. </li><li> 각 측정 시약 혼합물의 200 μL를 첨가하고 잘 착색 반응 생성물의 개발을 허용하기 위해 RT에서 (어두운 곳에서) 20 분 동안 배양한다. 형광 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm의 파장에서의 AChE의 활성을 측정한다. 주 : 엑소 정제 후 남은 출발 물질의 비율은 비 분획 플라즈마의 통증 분석법에 의해 평가된다. </li></ol></li><li> 면역 분석 <ol><li> proced 그라데이션 분수 1-12에서 분리 된 단백질 (100V X 1 시간에 4~20% 트리스 - 염산 프리 캐스트 젤의 SDS-PAGE에 의해 URE 2.1.3). 제조업체의 지시에 따라 전기 블로 팅 전사 셀을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 겔에 옮긴다. 전송이 350V에서 12 ~ 16 시간 (O / N)에 대해시킨다하도록 허용합니다. </li><li> 블로 팅 장치로부터 막을 제거하고 5 분 동안 트리스 완충 염수 (TBS)로 세척 하였다. RT에서 진탕하여 1 시간 동안 (0.1 % 트윈 20과 TBS) TTBS 중 5 % 탈지 우유로 차단. </li><li> 12 ~ 16 시간 (O / N) 4 ℃에서 진탕 5 % 무 지방 우유에 엑소 좀 (CD9, CD45, CD63) 또는 HIV-1 캡시드 단백질 (P24)에 대한 특정 기본 항체와 멤브레인을 품어. 면역 블롯에 대한 일차 항체의 희석은 1 범위 : 2000 -1 : 5000. </li><li> 1 인큐베이션 20 분 동안 TTBS로 블롯을 세척 : 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 2,000 희석액을 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지 우유, 안티의 IgG (이차 항체)에 π 공역 계. 오에게 TTBS 3 회, 세척 당 10 분을 씻으십시오. </li><l난&gt; HRP 표지 된 단백질은 CCD 카메라로 촬상 한 전자 시스템을 이용하여 화학 발광 신호를 검출에서 화학 발광 신호를 생성하기 위하여, 제조자의 지시에 따라 기판 루미놀 시약 오 부화. </li><li> 어도비 포토샵에서 볼 수있는 TIFF 파일로 이미지를 저장합니다. ImageJ에 소프트웨어 (건강의 국립 연구소, 베데스다, MD)를 사용하여 밴드의 밀도 측정 분석을 수행합니다. </li></ol></li><li> 사이토 카인 분석 <ol><li> 사이토 카인 분석에 앞서, 산해리 의해 인간 혈장에 존재하는 통상 세제 처리하여 엑소 좀을 용균 면역 복합체를 방해. 분석 모두 시작 플라즈마 샘플 및 정제 엑소 좀 준비. <ol><li> 인간 혈장 100 ㎕를 100 ㎕의 0.33 N HCL을 부가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 산 처리 된 플라즈마를 중화하기 위해 100 μL 0.33 N NaOH를 추가합니다. 인터넷에, 트리톤 X-100 중화 플라즈마 및 정제 엑소 모두 샘플을 추가1 %의 최종 농도는 엑소 좀의 분해를 야기한다. </li></ol></li><li> 이 분석 (형광 구슬 기반 절차)의 경우, 자석 구슬은 제조 업체에 의해 항체로 미리 코팅 사용합니다. 안티 - 인간 사이토 카인 항체 코팅 구슬의 맞춤 디자인 패널을 사용하여; 표 1. 30 초간 사이토킨 분석 키트에서, 항체 - 코팅 된 자성 비드 와동 및 분석에 사용되는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 비드를 추가한다. </li><li> 8- 점 표준 곡선을 생성하기 위해, 사이토 카인 분석 키트의 사용 설명서에 기재된 바와 같이 플라즈마 표준 완충액 (사이토 카인 분석 키트에 함유 된 양)의 표준 희석 시리즈를 준비한다. </li><li> 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 물론 각 (키트) 1X 세척 버퍼의 150 μl를 추가하고 자기 비드 와셔를 사용하여 구슬을 씻는다. 각 웰 (키트) 25 μL 플라즈마 분석 버퍼를 추가합니다. 분석에 사용 된 모든 우물에 표준 및 샘플의 25 μl를 추가합니다. 플라즈마의 25 μl를 추가음성 대조군 우물에 샘플 버퍼. 밀봉하고 실온에서 60 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어 4 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 각 웰에 1X 세척 버퍼의 150 μl를 추가하고 (위의 단계 3.3.4에서와 같이) 접시를 씻으십시오. 각 웰, 인감로 검출 항체의 25 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어. 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 각 웰, 인감로 (키트에서 SAPE) 스트렙 타비 딘 용액 50 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어. 3.3.4에서와 같이 반복 플레이트 세척. </li><li> 형광 신호가 발전 할 수 있도록 실온에서 5 분 동안 700 rpm으로 실험실 탁상 통에 각에 (키트) 읽기 버퍼의 120 μl를 잘 추가하고 악수. 제조업체의 지침에 따라 플레이트 리더에 판을 읽어보십시오. </li><li> , 분리 과정 중에 손실 엑소 좀의 양을 설명하기 식을 사용하기 위해 [(원고 판독 / 혈장 부피) = 66.6 조절 사이토 카인 판독 X]. </li></ol></li></ol> 면역 잠재적 4. 분석 <ol><li> 엑소 좀 고갈 태아 소 혈청과 문화 매체의 준비 <ol><li> 원심 분리기 4 ℃에서 20 시간 동안 100,000 XG에 소 태아 혈청 (FBS) 500 ml의 엑소 좀과 마이크로 소포를 오염 펠렛. 조심스럽게 제거하고 엑소 좀 고갈 FBS 상층 액을 저장합니다. 생물 학적 폐기물의 펠렛을 폐기하십시오. </li><li> 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 500 ㎖ (1640 RPMI) 매체와 엑소 좀 고갈 FBS 상층 액의 20 %를 결합합니다. 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 배지를 필터. </li><li> 여과 매체 스트렙토 마이신 (100 U / ㎖), 페니실린 (100 U / ㎖), L- 글루타민 (2 mM)을 HEPES 완충 식염수 용액 (10 μM) 및 IL-2 (20 U / ml)에 추가한다. </li></ol></li><li> 세포 배양 및 엑소 좀 노출 <ol><li> 건강한 지원자 클리닉 기증자로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에 엑소 좀을 노출. 에서 PBMC를 일시 중단배양 배지를 제조하여 (제조자의 표준 방법에 따라) 셀 / 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 주 : PBMC는 (단계 1.2) 상술 한 플라즈마 제조 동안 얻어진다. </li><li> 4.1.3 절차로부터 제조 매체를 이용하여, 공존 배양 3.0 × 106에서 엑소 좀 풀링 1 μg의 / ㎖와 (PBMC) 세 (3) HIV-1 혈청 양성 또는 삼 (3) HIV-1 혈청 음성 개체로부터 총 (뚜껑) 12 웰 배양 플레이트의 웰에 1 ml의 부피. 37 ℃에서 48 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 콘 카나 발린으로 처리 미처리 PBMC 배양 물 및 배양 물 제조 (콘을 5 μg의 / ㎖) (4.2.2) 전술 한 바와 같이, 각각 같은 음성 및 양성 통제를 제공하기 위해. 37 ℃에서 48 시간 동안 모든 PBMC 문화를 품어. </li><li> 형석 알렉사 700 표지 항 CD3 (1 : 400 희석), allophycocy 직전에 세포를 수확하려면 다음, 형광 - 공액 모노클로 날 항체의 희석액을 제조(1 : 400), V450 표지 항 CD8, 바이오틴 : 엽록소 단백질 복합체 표지 항 CD4 (400 1) peridinin : ANIN (APC) / 시아닌 7 (Cy7)는 안티 CD4 (400 1) - 표지 안티 CD45RA (1 : 1,000) 표지, 피코 에리 트린 (PE) / 항 CD62L (1 : 1,000)를 Cy7 - 표지 : PE-텍사스 레드 -, PE는 / 시아닌 5 (Cy5에)는 안티 CD38 (200 1) - 표지 표지 항 streptavidin (1 : 000), 및 PE / Cy5에 표지 된 마우스 IgG1K 아이소 타입 컨트롤 (1 : 200). </li><li> 48 시간의 잠복기 후, PBMC를 수확. PBS에 세척 PBMC는 개인, 형광 표지 된 항체로 4 ℃에서 1 시간에 대한 배양 세포를 엑소 좀을 제거하고 얼룩합니다. (21의 설명 참조) 케모카인의 발현을 정량화하는 유동 세포 계측법에 의해 염색을 분석 PBMC. </li></ol></li></ol>

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<li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li>
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</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

만성 면역 활성화 (CIA) 및 CD4 + T 세포 고갈은 HIV-1 감염의 두 가지 중요한 특징이다. 그들은 중앙 정보국 (CIA)이 가장 좋은 예측 인자 인 상태, 발병 기전에 대한 예측 인자로 설립되었다. 그러나, 만성 전신성 면역 활성화와 CD4 + T 세포의 감소를 구동 기전은 아직 완전히 규명되지 않았다. 우리와 다른 연구소는 HIV-1에 감염된 세포에서 분비되는 엑소 좀은 모두 특징에 중요한 역할을한다는 확고한 ?...

HIV-1 전염병은 세계에 걸쳐 상당한 영향을 계속. 2013 년으로, 전 세계적으로 약 35 만 명이 HIV에 살고,이 중 210 만 새로 감염된 사람 1이었다. 예방 전략과 항 레트로 바이러스 치료에 증가 접근은 HIV의 전체 인수를 줄이는데 도움이되고있다. 그러나, 개인의 인구는 여전히 HIV 1의 인수에 상승을 경험하고있다. 따라서,이 전염병을 해결하기 위해 계속 노력이 필요하다. 에이즈 질병 진행의 가장 강력한 예측 인자 중 하나는 만성 면역 활성화 (CIA) 2-10이다. 검출 사이토 카인 및 T 림프구의 표면에 높은 표현 마커의 지속적으로 높은 수준의 정의, 중앙 정보국 (CIA)은에 기인하고있다 : 나는 11 IFN 유형 I) 연속 수지상 세포 생산; HIV 단백질 문신, 네프와 gp120의 (12)에 의해 구동 (II) 직접 면역 활성화; (III장 관련 면역 세포 6 박테리아 단백질) 전좌. 그러나, 정확한 메커니즘은 만성 하부는 HIV 감염에 전신성 면역 활성화는 완전히 밝혀지지 남아있다. 우리의 연구 그룹과 다른 사람은 에이즈 발병 15 ~ 18의 엑소 좀의 역할을 증명하고있다. 우리 그룹 네프 단백질 엑소 좀 15에 감염된 세포로부터 분비되는 것으로 판정하였으며, exosomal 네프 (exNef)은 나노 그램 수준 18 HIV 감염자의 혈장에 존재한다. 우리는 또한, 단핵구 / 대 식세포가 exNef에 의한 세포 사멸에 반응했다. exNef에 노출 된 CD4 + T 세포가 CXCR4 통로 (19), (20)에 따라 활성화 유도 된 세포의 죽음을 초래하는 방관자를 표시하지만, 변형 된 세포 기능 및 사이토 카인의 발현을 전시했다. HIV에 감염된 사람의 혈장에서 분리 된 가장 최근에, 우리 그룹이 보여 주었다 엑소 좀은 염증성 사이토 카인의 다양한 포함되어 있습니다. 부rther, 메모리 및 중앙 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포상에서 CD38의 발현을 유도하는 HIV 감염 환자에서 혈장 유래 엑소 좀에 노출 나이브 말초 혈액 단핵 세포. 이 가능성이 전신 염증과 방관자 세포 활성화 (21)를 통해 바이러스 전파에 기여하고, 엑소 좀은 에이즈 발병 기전에 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. HIV의 병인에서 엑소 좀의 역할을 조사하고, 하나의 도전은 HIV 입자로부터 효율적으로 분리 된 엑소 좀 exosomal 콘텐츠를 유지하면서,뿐만 아니라 면역 조절 성 기능적 능력에 기술들을 개발하고있다. 몇몇 방법은 세포 배양 물 및 생물학적 유체 (22, 23)에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 낮은 밀도 (엑소 좀은 1.15의 밀도 부동 - 1.19 g / ㎖), 차동 초 원심 분리 및 / 또는 한외 여과가 엑소 아이솔레이션 (23)이 가장 일반적으로 사용되는 기술이다.그러나 HIV에 감염된 세포 배양 상층 액과 환자의 혈장은 엑소 좀과 HIV-1 바이러스 입자를 모두 포함되어 있습니다. 엑소 좀과 HIV-1 입자 크기와 밀도 모두에서 매우 유사합니다. 대안 적으로, CD63, CD45 및 CD81와 같은 고유 exosomal 마커의 발현을 활용 엑소 좀은 면역 캡처 방법 (23)을 사용하여 분리되었다. 이 절차는 엑소 좀에서 바이러스를 분리 할 수​​ 있습니다. 그러나,이 기술의 단점은 배양에서 엑소 좀의 면역 가능성을 방해 할 수있는 평가 엑소 좀 정제, 항체의 단단한 부착이다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Iodixanol 속도 구배를 사용하여 HIV의 Cantin에서 변성 인간 혈장 내의 입자 및 동료 엑소 좀 (22)로부터의 정제 방법을 개발 하였다. 바이러스 입자는 높은 반면에 편석 엑소 좀은 저밀도에서 iodixanol 구배 / 상부 분획을 분리하는 것으로 나타났다밀도 / 낮은 분수. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 식별하고, 엑소 좀은 아세틸 콜린 엑소 마커, CD9, CD63 및 CD45를 사용하여 확인 하였다. 수집 상단 저밀도 분수는 HIV-1의 P24 오염에 대한 음성이었다 엑소 좀을 포함. 인간 혈장에서 HIV 입자로부터 엑소 좀의 효율적인 정제 및 분리는 인간 혈장뿐만 아니라 면역 조절 성 전위의 조사 및 HIV-1 발병 엑소 좀의 진단 및 예후 유래의 엑소 좀의 컨텐츠에 대한 정확한 검사를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>pink top tubes</td></tr><tr><td>Lymphoprep Ficoll reagent</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep iodixanol reagent</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14ml ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>ultraclear tubes</td></tr><tr><td>Gradient Former Model 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Acetylthiocholine iodide</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Benzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Cholinesterase</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear microtiter plate</td><td>Medical Supply Partners</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190 microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>190</td><td>Fluorescent plate reader</td></tr><tr><td>Criterion Gel Electrophoresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Cell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Criterion precast gels</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antibody (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antibody (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAb p24 HIV-1&amp;nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Goat-Anti-Rabbit</td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Goat-Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td><td>Affymetrix&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Custom immunoassay panel</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-labeled anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>V450-labeled anti-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled anti-CD45RA</td><td>BD Bioscience (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled anti-CD38</td><td>Biolegend (HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td><td>Biolegend (L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

엑소 좀은 세포 유형의 다양한 구성 적 자극 모두에 릴리스이 30 nm 내지 100nm 범위의 크기에 작은 소포이다. 이들은 생물학적 유체의 번호에서 발견되는 단백질, 지질, 핵산 분자의 다양성을 수행하는 것으로 알려져있다. 원래 세포 파편을위한 저수지보다 더 작은, 생물학적 과정을 조절하는 엑소 좀과 질병의 역할이 점점 더 감사합니다 것으로 생각했다. 방법은 여러 세포 배양 배지, 생물학적 유체에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 저밀도, 초 원심 미분 및 / 또는 한외 엑소 격리를위한 가장 널리 사용되는 기술들이다. 그러나, HIV-1에 감염된 개인의 플라즈마는 크기와 밀도 비슷 두 엑소 좀과 HIV 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 따라서, 인간 혈장에서 HIV 바이러스 입자에서 엑소 좀을 효율적으로 분리하고있다도전. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Cantin 등으로부터 변성 과정을 개발 하였다. 알., 인간 혈장에서 HIV 입자에서 엑소 좀 정화용 2008. Iodixanol 속도 구배는 HIV-1 양성 개인의 혈장에서 HIV-1 입자에서 엑소 좀을 분리 하였다. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 확인되었다. 엑소 좀은 엑소 마커 아세틸 콜린 에스 테라 제의 기초 (아세틸 콜린), 및 CD9, CD63 및 CD45 항원을 동정 하였다. 우리 구배 절차는 바이러스 입자의 자유로운 엑소 제제를 수득 하였다. 인간 혈장에서 엑소 좀의 효율적인 정제 혈장 유래 엑소 좀의 내용을 검사하고, 면역 조절 성 전위 및 기타 생물학적 기능을 조사 할 수있었습니다.

엑소 좀을 효율적으로 HIV-1 긍정적 인 인간 혈장에서 정제된다. 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 활동에 의해 식별 고립 된 엑소 좀을, HIV-1 항원 P24에 의해 확인 된 바이러스 입자 반면, iodixanol 그라디언트의 상단에 낮은 밀도 분획 1-3에서 분리 (하단, 10-12) 고밀도 분획으로 분리. 엑소 좀의 존재는 상기 마커 아세틸 콜린 엑소, CD9, CD45 및 CD63, 및 전자 현미경에 의해 <...

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Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

isolation-of-exosomes-from-the-plasma-of-hiv-1-positive-individuals

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17.3K 조회수.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

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Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

연구

생화학

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

The healthy gastrointestinal tract is physiologically colonized by a large variety of commensal microbes that influence the development 
	of the humoral and cellular mucosal immune system1,2. 
 Microbiota is shielded from the immune system via a strong mucosal barrier. Infections and antibiotics are known to alter both the normal 
	gastrointestinal tract barrier and the composition of resident bacteria, which may result in possible immune abnormalities3.
HIV causes a breach in the gastrointestinal barrier with progressive failure of mucosal immunity and leakage into the systemic circulation of bacterial bioproducts, such as lipopolysaccharide and 
	bacterial DNA fragments, which contribute to systemic immune activation4-7. Microbial translocation is implicated in HIV/AIDS immunopathogenesis and response to therapy 4,8.
We aimed to characterise the composition of bacteria translocating in peripheral blood of HIV-infected patients. To pursue our aim we set up a PCR reaction for the panbacteric 16S ribosomial gene 
	followed by a sequencing analysis.
Briefly, whole blood from both HIV-infected and healthy subjects is used. Given that healthy individuals present normal intestinal homeostasis no translocation of microflora is expected in 
	these patients. Following whole blood collection by venipuncture and plasma separation, DNA is extracted from plasma and used to perform a broad range PCR reaction for the panbacteric 
	16S ribosomial gene9. Following PCR product purification, cloning and sequencing analyses are performed.

Our experiment will show how to perform a sequencing analysis of bacterial species translocating in peripheral blood of HIV positive patients.

주변 혈액에 세균 Microflora의 시퀀싱 : HIV에 감염된 환자 경험

The healthy gastrointestinal tract is physiologically colonized by a large variety of commensal microbes that influence the development 
	of the humoral ...

의학

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

단백질 소화, 한, 및 크기 배제 크로마토그래피 인간의 혈장 및 혈 청에서 Exosomes의 절연을 최적화 하

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

생물학

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

고도로 정제 된 고밀도 지단백질에서의 miRNA의 높은 넣어 관통 분리에 대한 신속하고 단순화 된 방법

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can modulate the cellular status of other cells locally in tissue microenvironments or through liberation into peripheral blood. Adipocyte-derived EVs are elevated in the peripheral blood and show alterations in their cargo (RNA and protein) during metabolic disturbances, including obesity and diabetes. Adipocyte-derived EVs can regulate the cellular status of neighboring vascular cells, such as endothelial cells and adipose tissue resident macrophages to promote adipose tissue inflammation. Investigating alterations in adipocyte-derived EVs in vivo is complex because EVs derived from peripheral blood are highly heterogenous and contain EVs from other sources, namely platelets, endothelial cells, erythrocytes and muscle. Therefore, the culture of human adipocytes provides a model system for the study of adipocyte derived EVs. Here, we provide a detailed protocol for the extraction of total small EVs from cell culture media of human gluteal and abdominal adipocytes using filtration and ultracentrifugation. We further demonstrate the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for quantification of EV size and concentration and show the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101) in the gluteal and abdominal adipocyte derived-EVs. Isolated EVs from this protocol can be used for downstream analysis, including transmission electron microscopy, proteomics, metabolomics, small RNA-sequencing,&#160;microarrays and can be&#160;utilized in functional in vitro/in vivo studies.

<meta charset="utf8"></head><body>Filtration and Ultracentrifugation을 사용한 Human Adipocyte-derived Extracellular Vesicles의 분리 및 특성화

We describe the isolation of human adipocyte-derived extracellular vesicles (EVs) from gluteal and abdominal adipose tissue using filtration and ultracentrifugation. We characterize the isolated adipocyte-derived EVs by determining their size and concentration by Nanoparticle Tracking Analysis and by western blotting for the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101).

Filtration and Ultracentrifugation을 사용한 Human Adipocyte-derived Extracellular Vesicles의 분리 및 특성화

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can ...

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요약

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Filtration and Ultracentrifugation을 사용한 Human Adipocyte-derived Extracellular Vesicles의 분리 및 특성화

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