이 연구는 스웨덴 연구 협의회 (K2008 - 57X - 20 676-01-3)에 의해 재정되었다.

1. Exosome 격리 <ol><li> exosome 무료 혈청 매체 세포를 성장. 따라서, 모든 혈청은 세포 배양 매체에 추가이 4 박 120 000 XG에 ultracentrifugation에 의해 exosomes의 고갈되어야 ° C를 사용하기 전에. </li><li> 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 4 10 분 300 XG에 원심 분리기 ° 펠렛 셀 C. </li><li> 초원 심 분리기 튜브를하고 그렇지 않으면 완전한 추가 PBS로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 4 20 분 동안 16 500 XG에서 샘플을 원심 ° C 추가 세포와 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 200 NM보다 큰 입자를 제거하는 필터 0.2 μm의를 통해 뜨는을 필터링합니다. </li><li> 새로운 초원 심 분리기 튜브에 필터링된 뜨는을 전송 4 70 분 120 000 XG에 초원 심 분리기 전에 튜브를 밀봉 ° C를 펠렛 exosomes 수 있습니다. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 최대한 exosome 검색은 exosome을 풍부하게 resuspend적절한 버퍼의 작은 볼륨 (~ 3 X 50 μl)에 반복 에드 펠릿. 이 버퍼 exosome 절연 다음과 같은 계획 스트림 실험에 따라 달라집니다. 예를 들어, 용해 버퍼는 단백질과 RNA 분리에 사용되는, PBS는 전자 현미경과 유동세포계측법 및 기능 연구 매체가 선호하는 수에 사용됩니다. </li></ol> 참고; exosomes도 세포 배양 매체에 대한 동일한 절차를 사용하는 등 플라즈마와 같은 다른 체액, 격리 수 있습니다. 점성 유체에 대한 그것은 전에 원심 분리와 여과 단계로 PBS와 함께 샘플을 희석해야 할 수도 있습니다. 포인트 위의 5 원심 분리 속도와 관련하여, 그것은 29 500 XG로 증가 수 있으며, 포인트 7 ultracentrifugation은 90분 18 확장될 수 있습니다. 샘플 더 정화해야하는 경우 exosome 펠렛은 자당 기울기에 떠내려 수 있으며 exosomes는 분획 represe에서 주로 발견됩니다1.13-1.19 g / ML 2 밀도를 nting. 2. 전자 현미경에 의해 Exosome 식별 <ol><li> 을 추가, 오염 단백질을 제거 4 70분 120 000 XG ° C로 다시 펠렛 exosomes에서 exosome 풍부한 PBS의 펠렛과 초원 심 분리기를 resuspend. </li><li> 단백질 분리 및 총 단백질 측정을위한 시료의 작은 나누어지는를 가져가라. 샘플의 극히 일부는 단백질 측정 lysed 및 사용되었는지 확인하고 얼음에 별도의 또는 -80 ° C에서 추가 실험 PBS에서 해결 그대로 exosomes을, 유지. </li><li> Parafilm에 드롭, PBS에 resuspended 그대로 exosomes의 exosomal 단백질의 약 10 μg을 넣으십시오. 그런 다음, 집게와 함께 부드럽게 30~60분 각 드롭 위에 formvar 탄소 코팅 니켈 격자 위치. 격자가 exosomes를 포함하는 드롭 직면하고 코팅 면을 위치입니다기만하면됩니다. </li><li> t에 PBS 세 방울, 각 30 μl, 장소그는 Parafilm하고 순차적으로 PBS의 방울 상단에있는 격자를 위치하여 격자를 씻어, 그리고 사이에 흡수 종이를 사용합니다. 부드럽게 막 코팅 영역과 접촉하지 않고, 격자의 측면에 밀접하게 그것을 잡고하여 흡수 종이를 사용하십시오. </li><li> 보증금으로 Parafilm에 2 % paraformaldehyde의 드롭을 예제​​를 수정하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 놓으십시오. </li><li> 적절한 항체와 immunostaining 전에 포인트 4 세정 단계를 반복합니다. 일반적으로 사용되는 항체 안티 CD63 및 안티 MHC 클래스 II 수 있습니다. 전자 현미경은 또한 exosomes는 전적으로 크기와 형태에 따라 확인할 수 있습니다대로 immunostaining없이 수행할 수 있습니다. 그러나, 우리는 크기, 형태 및보다 확실한 검증을 위해 막 단백질의 존재를 평가하는 것이 좋습니다. </li><li> 선택의 주요 항체의 30 μl 드롭으로 격자를 전송하고 40 분 알을 품다. 포인트 4를 반복하여 씻어지만, PB에서 알부민 0.1 % 소 혈청을 사용대신 PBS 혼자의 S. </li><li> 포인트 7를 반복하지만, 10 nm의 - 골드 라벨 ​​차 항체와 PBS로 세척 혼자와. </li><li> Parafilm 2.5 %의 글루 타 알데히드의 드롭을 추가하여 샘플을 포스트 수정하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 품어. 포인트 4의 세척을 반복하지만, 탈이온수 다섯 방울 대신 PBS 세 방울을 사용합니다. </li><li> Parafilm에 2 % uranyl 아세트산의 드롭을 추가하고 15 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 부화하여 명암 샘플을. </li><li> Parafilm에 0.13 %의 메틸 셀룰로오스의 방울 및 0.4 %의 uranyl 아세트산을 추가하여 샘플을 포함하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 품어. </li><li> 최대 코팅된 면을 종이에 격자를 위치하기 전에, 부드럽게 흡수 종이를 사용하여 여분의 액체를 제거하고 공기를 5 분 건조하자. </li><li> 전자 현미경으로 준비를 검사하거나 향후 작업에 대한 격자 상자에 그리드를 저장합니다. </li></ol> 3.유동세포계측법에 의해 Exosome 특성화 exosomes 현재 유동세포계측법 장치에 의해 감지가 너무 작아 있으므로, 먼저 항체 코팅 비즈 (그림 1)로 exosomes를 바인딩하는 것이 필요합니다. 이 구슬은 어느 준비가 만들어진 제품으로 구입하거나 선택의 항체와 실험실에서 만들 수 있습니다. exosomal 세포 기원에 따라, 서로 다른 항체가 자기 또는 라텍스 문자 중 하나가 될 수 있습니다 구슬에 결합하실 수 있습니다. 우리는 현재이 분석을 위해 안티 MHC 클래스 II 또는 방지 CD63 코팅 구슬을 사용합니다. <ol><li> &quot;수제&quot;항체 코팅 구슬의 사용을 위해, 우리는 안티 CD63 항체로 코팅된 4 μm의 라텍스 구슬을 사용합니다. 두번 100 μl MES 버퍼에 25 μl 4 μm의의 라텍스 비즈 (30 X 10 6 구슬) 15-20분 3 000 XG 씻으 100 μl MES 버퍼의 펠렛을 redissolve. MES 버퍼의 동일한 볼륨 12.5 μg 항체 동등한 볼륨을 포함하는 항체 혼합물을 준비합니다. 추가항체 혼합물과 실온에서 하룻밤 동안 교반에 따라 부화 구슬. PBS (20 분 3 000 XG)와 항체 코팅된 비즈 세 번이나 씻고 (300 000 구슬 / μl의 최종 농도)를 저장 버퍼의 100 μl의 펠렛을 디졸브. </li><li> 각 샘플에 대한 (각 항체) ~ 100 000 항체 코팅 비즈 당 exosomal 단백질 30 μg의 최소 (PBS에서 해결 그대로 exosomes의)에 동일한 볼륨을 계속합니다. </li><li> 4 박 이상, 300 μl PBS의 총 볼륨에 exosomes와 구슬을 품어 ° C 부드러운 움직임에 따라. </li><li> 30 분 200 MM 글리신과 부화 300 μl를 추가하여 차단합니다. </li><li> 두 번 씻어 버퍼에있는 exosome - 구슬 단지 (PBS에서 1-3% 혈청), 10 분 동안 600 XG 씻으십시오. </li><li> 4시 50 μl IgG 항체와 exosome - 비드 단지 ° C.를 품어 5 단계에서 설명한대로 세척 버퍼에 두 exosome - 비드 단지 씻으십시오. </li><li> 90 μl 세척 버퍼와 10 μl를 추가부드러운 움직임에 따라 40 분 exosome - 비드 단지와 부화 선택의 항체 (이상적으로, 안티 - 안티 - CD9 CD63 또는 항 CD81). 로 5 단계에서 설명한 세척 버퍼에있는 exosome - 비드 단지 두 번 씻으십시오. </li><li> 300 μl 세척 버퍼를 추가하고 유동세포계측법을 사용하여 데이터를 취득. </li></ol> 설명한대로 위에서 다른 구슬들은 다음과 같은 프로토콜이나 자기 구슬에 설명​​된 라텍스 구슬로 사용할 수 있습니다. 자석 구슬 대신 사용하는 경우 프로토콜이 약간 다르다는 것을,주의하시기 바랍니다. 차단 단계 (4 점)가 필요되지 않고 세척 대신 원심 분리의 자기 스탠드에 튜브를 삽입하여 수행됩니다. &quot;수제&quot;항체 코팅 비즈에 사용되는 저장 버퍼는 0.1 % 글리신 및 7.2의 산도와 PBS에 azid 0.1 %의 나트륨이 포함되어 있습니다. 중요한 것은 어떤을 피하기 위해, 유동세포계측법 세척 버퍼 (PBS에 혈청 1-3%)에 대한 exosome 고갈 혈청을 사용해야합니다분석을 오염 혈청 exosomes. 참고; 항체 결합 구슬을 사용하여 exosome 특성화를 수행할 때 그것은 격리 및 특징입니다 사용되는 항체에 대한 구체적인 특정 subpopulation,임을 인정하는 것이 중요합니다. 4. 서양 얼룩으로 Exosome 검출 서양 얼룩은 물론 기존의 방법이며 우리는 그 방법 자체에 관한 세부 사항에 들어가지만, 서양 얼룩 및 사용 다른 항체 전에 적당한 단백질 분리의 중요성에 초점을하지 않습니다. <ol><li> 선택의 단백질 용해 버퍼에 exosome 펠렛을 해산하고 와동 - 믹싱 다음, 철저 pipetting. 더욱 exosomes을 lyse하려면 물 목욕 3 샘플을 sonicate 사이에 와동 - 믹싱과 X 5 분 거리에 있습니다. 마지막으로 상온에서 5 분, 13 000 XG를 샘플을 원심, 새로운 eppendorf 튜브에 뜨는을 전송. </li><li> 현 대 적 인선택의 방법에 의해 총 단백질을 다시하고 당 잘 단백질의 20-50 μg을로드합니다. </li><li> 별도의 겔 전기 영동과 electroblotting하여 단백질을 전송합니다. </li><li> 블록과 exosomes에 풍부한 단백질에 대한 immunostaining를 수행하기 전에 막을 씻으십시오. </li><li> chemiluminescence, 디지털 이미징 시스템 및 분석 소프트웨어에 의해 특정 단백질을 감지합니다. </li></ol> 모든 다른 세포 기원부터 exosome 특정 마커, exosomes에 풍부한 아르 단백질은 없습니다로서, 일반적으로 exosome 감지에 사용됩니다. 이들은 같은 tetraspanins (예 : CD9, CD63과 CD81), cytoskeleton 연결 단백질 (예 : ezrin) 및 multivesicular biogenesis (예 : Tsg101 및 alix)에 관여 단백질로 단백질입니다. 또한 일반적으로 exosomes에서 검색된 다른 단백질이 Flotillin, Hsc70 및 다른 rab 단백질 등을하는 것은 그러나, A33 (창자 상피 세포)로 exosomes에서 발견 세포 특정 단백질, 인 경우에는 3 번 CD도 있습니다(T 세포)와 MHC 클래스 II (항원 제시 세포). 따라서 exosomes이 검출을위한 마커에서 출시된 어떤 휴대폰 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 세포의 다른 구획도 vesicles를 생산 수 있듯이, 그것은 더 이상 이러한 endoplasmic reticulum (예 : calnexin 및 Grp78)와 잠돌군 Zz 장치 (예 : GM130) 이러한 구획에서 단백질의 존재를 확인하는 것이 좋습니다. 따라서, 이러한 단백질 부족은 연구 샘플에있는 다른 구획의 vesicles 전혀 또는 거의 오염을 나타냅니다 없습니다. 5. exosomal RNA 및 RNA 분석의 분리 <ol><li> 선택의 RNA의 용해 버퍼에 exosome 펠렛을 분해 및 RNA 추출을 수행합니다. 다른 RNA 분리 키트는 하류 실험에 따라 사용하지만, 컬럼 기반의 방법은 RNA의 넓은 스펙트럼과 샘플을 제공하실 수 있습니다. 현재 Exiqon로 miRCURY RNA 격리 키트를 사용하고 있지만, 다른 키트는 SC에 따라 적절한 수 있습니다손을 ientific 질문입니다. </li><li> RNA 분리를 수행할 때 그것은 RNase가없는 환경에서 작업하는 것이 중요합니다. 따라서 핵산과 nuclease 무료 피펫 팁을 사용하여 오염 물질과 RNases에서 무료로 벤치와 장비 모두를 닦으십시오. </li><li> RNA 분리에 대한, miRCURY RNA 격리 키트를 사용하여 용해 용액 350 μl의 exosome 펠렛을 해산하고 15 초 동안 와동 - 혼합을 수행합니다. </li><li> 95 %의 에탄올과 10 초 와동 - 혼합 200 μl를 추가합니다. </li><li> 컬렉션 튜브에 열을 놓고 열 lysed exosomes을 전송 14 000 X G.에서 1 분 원심 </li><li> 14 000 X G.에서 1 분 exosomal RNA와 원심 분리기를 포함하는 컬럼에 씻으 솔루션 400 μl를 추가하여 세 번 씻으십시오 </li><li> 컬럼이 건조하고 RNase없는 eppendorf 튜브의 건조한 열을 곳이 있는지 확인하기 위해 XG 14 000에서 2 분 동안 열을 원심. </li><li> 2 열 및 원심 50 μl 용출 버퍼를 추가합니다<html> 200 XG에 분 14 000 X G.에서 일분 뒤에 </li><li> 분리된 RNA를 계속하거나 -80에 저장 ° C. </li></ol> 압축을 푼 총 exosomal RNA의 검출 및 분석, RNA 6000 나노 또는 RNA 6000 피코 키트와 애질런트 2100 Bioanalyzer를 사용합니다. 분석 exosomal RNA 수율 및 크기 분포를 보여줍니다. 6. 대표 결과 Exosomes 사용할 수 유동세포계측법 방법에 의해 감지가 너무 작아 있으며, 따라서 (그림 1) 분석되기 전에 항체 - 코팅 구슬에 붙어 있습니다. exosome - 구슬 단지가 집계 가능한 유동세포계측법의 분산형 줄거리는 싱글, 더블, 트리플 구슬의 다른 인구 (그림 2A)을 포함할 수 있습니다. 화살표는 더 분석하는 하나의 구슬을 나타냅니다. 의 isotype 제어에 비해 CD63 양성 단일 비드 - exosome 인구는 그림 2B에 표시됩니다. e_content은 &quot;exosomes의 작은 크기로&gt; 때문에, 그들은 그저 가벼운 현미경에 의한 전자 현미경 직접 시각되고, 수 없습니다. exosomes의 전형적인 형태학의 특성이 원형 모양 30-100 nm의 크기의 멤브레인 vesicles 있습니다. 그림 3, 전자 현미경에서 사진 exosomes은 CD63에 대한 골드 라벨 항체 (화살표로 표시)과 비 immunostained exosomes (B)와 (A) immunostained 보여줍니다. 격리 vesicles 실제로 exosomes 것을 확인하고 더욱 exosomal 단백질을 특성화하기 위해 서양의 얼룩은 일반적으로 사용됩니다. 그림 4 calnexin, endoplasmic reticulum의 마커의 부재를 보여줍니다. 이것은 endoplasmic reticulum에서 vesicles 거의 오염을 나타냅니다. 또한, 그림 4는 일반적으로 exosomes의 풍부한 tetraspanin입니다 exosomes에서 CD81의 presences를 보여줍니다. 세포 RN​​A는 주로 포함되어 있습니다Bioanalyzer 분석 (그림 5A)에서 18S rRNA와 28S subunits에 대한 두 눈에 띄는 봉우리로 볼 수의 ribosomal RNA (rRNA). exosomes는 두 rRNA의 봉우리 (18S와 28S)을 부족과 같은 mRNA와 miRNA (그림 5B)로 짧은 RNA에 풍부한 아르 그러나 exosomal RNA 자신의 프로필에서 다릅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" /> 그림 1. 유동세포계측법로 분석하면 exosomes (30-100 nm의)의 작은 크기로 인해, 그들은 소음과 배경에서 구분할 수 없습니다. 따라서 다음 레이저로 시각 수있는 exosomes가 분석되기 전에 항체 코팅 구슬로 그들을 첨부할 필요가 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" /> 그림 2. 복잡한가 서로 양식을 더블, 트리플 구슬로 집계 수 exosome - 구슬 (A). 화살표는 단일 비드 - 엑소을 보여주는 것입니다<html> 문이 추가적인 분석에 사용되는 몇 가지 인구. 이 인구는 직접 exosomes의 멤브레인 분자의 존재를 확인하기 위해 isotype 제어 (채워진 회색 피크)에 비해 것입니다. CD63 양성 exosomes는 (블랙 오픈 피크) 그림 B에 표시됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" /> 그림 3. 일반적인 형태 및 크기 (40-80 nm의) (A와 B)과 exosomes의 전자 micrographs. 그림에서 화살표는이 exosome는 막 표면에 CD63이 있는지 확인, 보조 항체의 황금 입자를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" /> 그림 4. endoplasmic reticulum 단백질 calnexin의 부재하지만, 일반적으로 exosomes, tetraspanin CD81에 풍부한 단백질의 존재를 보여주는 서양 얼룩 결과입니다. ve_content &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" /> 그림 5. 전지 (A)과 exosomes (B)에 존재 RNA를 보여주는 Bioanalyzer 결과입니다. 화살표는 18S와 28S를 나타냅니다 rRNA의 subunits는 세포에 존재. exosomal RNA 남성이 작은 RNA를 포함하는으로 아무거나 작은 rRNA는 exosomes에서 확인되지 않습니다.

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JL은 세포에 RNA의 전송을위한 벡터로 exosomes의 활용에 관한 특허의 공동 소유자이다.

분자 컨텐츠 및 / 또는 exosomes의 기능을 공부하면 적절한 수율 및 오염의 가장 낮은 가능한 학위를 제공하는 우수한 품질의 절연 방법을 사용하는 데있어 매우 중요합니다. 이 문서에서 설명하는 방법론 exosomes를 분리하고 RNA 내용 및 생물 학적 기능을 연구하기 위해 설립 잘 접근이다. 또한, 전자 현미경, 유동세포계측법, 그리고 서양의 얼룩을 포함하여 서로 다른 방식의 조합에 의해 격리 exosomes의 특성의 중요성이 강조 표시됩니다. exosomes를 분리하면, 최초의 원심 분리 단계 (300 XG)은 세포 현탁액 또는 공부 생물 학적 액체에 존재있을 펠렛 전지하는 데 사용됩니다. 16 500 XG의 요구에 두 번째 원심 분리는 펠렛 죽은 세포, 큰 파편, apoptotic 기관 및 기타 organelles 충분히 강해 져야합니다. 이 원심 분리 후, 일부 프로토콜은 나노 여과 단계지만, 몇 가지 인보이스를 포함estigators이 단계를 제외했습니다. 그러나, 우리는 근절 파편 200 NM보다 크고 따라서 강력하게 여과 단계를 포함시키는 것이 좋습니다 vesicles의 중요성을 강조. 더 엄격한 격리가 필요한 경우, 100 nm의 필터를 사용하지만, 점성 유체를 사용하는 경우 이러한 필터가 쉽게 차단하고 exosomal 자료가 손실 될 수 있습니다 수 있습니다. 또한, 100 nm의 여과는 exosomes의 형태에 영향을 미칠 수 있으며 exosomes가 큰 규모로하는 경우뿐만 아니라 그들은 손실될 수 있습니다. 따라서 200 nm의 필터는 exosome 격리에 적합한 것 같습니다. 여과 후, 120,000 XG에서 필수 ultracentrifugation는 펠렛 exosomes하는 데 사용됩니다. exosomes는 더욱 항체 코팅 구슬에 바인딩하고 씻어, 또는 오염 물질의 단백질을 제거하는 자당 기울기에 위치, PBS로 씻어하실 수 있습니다. 시작 샘플 볼륨이 작은 및 / 또는 RNA 내용 O 특히 경우에는, 이것은 우리가 필요하지 않는 주장은 매우 리소스를 소모 과정 수추가 단계가 실질적으로 더 자료를 저하되므로 F exosomes가 낮습니다. 그러나, 다시 절연 vesicles의 특성은 특정 단백질의 존재와 부재에 의해 입증되어야합니다. 지금까지 exosomes에 대한 절대적으로 고유한 단백질 마커는 샘플 exosomes 진통제가 포함되어 있는지 확인하기 위해 확인되지 않았습니다. 따라서, 방법의 조합은 크기와 전자 현미경에 의해 exosomes의 형태의 결정을 포함하여 exosomes을 특성화해야합니다. 이 방법은 같은 microparticles, apoptotic 기관이나 세포 파편으로 큰 vesicles와 예를 들어 샘플의 오염 수준의 개요를 제공할 수로 또한, 시료의 순도는 전자 현미경에 의해 결정하실 수 있습니다. 또한 exosomes의 단백질 내용은 유동세포계측법과 서양 얼룩에 의해 결정 될 수 있으며, 모두 막의 분석에서 이러한 두 가지 방법 결과의 조합 (예 : CD63을 구속하고exosomes의 CD81)와 내면 단백질 (예 : Tsg101 및 alix). 이러한 CD63, Tsg101 및 alix, 그리고 endoplasmic reticulum 단백질 calnexin로 단백질의 부재로 exosomes에 풍부한 단백질의 탐지, exosome 풍부한 펠렛은 실제로 exosomes과 세포의 다른 구획에서하지 오염 vesicles는 것을 나타냅니다. exosomes에서 감지되는 RNA의 프로필이 손상 세포에서 발견 RNA의에 근본적으로 다릅니다. 따라서 Bioanalyzer 또는 겔 기반의 RNA 분석 방식에 분석 exosomal RNA는 세포의 RNA 분석 저명한있는 18S rRNA와 28S subunits에 대한 두 봉우리 부족합니다. 따라서 샘플에서 rRNA의 상당한 양의 검출은 절연 방법 개선과 품질을 보장​​해야 할 것을 따라서 추출한 총 RNA 혼자 exosomal 원산지되지 않았음을 나타냅니다, 그리고 주장한다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Exosome 격리 </td></tr><tr><td> Optima L - 90K의 초원 심 분리기 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 65,670 </td><td></td></tr><tr><td> 빠른 시일 초원 심 분리기 튜브 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td> 회전자에 따라 사용하는 다른 튜브가 필요합니다. Ti70 (342414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> 빠른 - 인감 무선 튜브 토퍼 키트 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 358,312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur 주사기 필터, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> 에 대한 VWR 인터내셔널에서 viscose 유체 및 / 또는 대용량, 진공 여과 시스템, 0.2 μm의은 (514-0600) 대신 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 전자 현미경 </td></tr><tr><td> Formvar / 탄소 코팅 니켈 그리드 </td><td> 테드 펠라 Inc의 </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD63 </td><td> Bioscience BD </td><td> 556,019 </td><td> 최종 conc : 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotype 제어, IgG1κ (MOPC 21) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M9269 </td><td> 최종 conc : 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG 골드 공액, 10 NM </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7777 </td><td> 최종 conc : 1 % </td></tr><tr><td> LEO 912AB 오메가 전자 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 국세청 </td><td></td><td> 또는 동급 장비. </td></tr><tr><td> 유동세포계측법 </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / 황산염 라텍스 비즈 </td><td> 계면 역학 </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 라텍스 구슬 코팅에 대한 항체 </td><td></td><td></td><td> Bioscience BD (556019)에서 예를 들어 안티 CD63에 대한 </td></tr><tr><td> Intelli - 믹서 RM - 2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> 또는 동급 장비. </td></tr><tr><td> 인간의 혈청에서 IgG </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> 검출에 대한 항체 </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> 예를 들면 다음과 같습니다 PE 방지 CD63 (556020) PE 안티 CD9 (555372) PE 안티 CD81 (555676) Isotype 제어 (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 서양 얼룩 </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> 앨마 </td><td></td><td> 또는 동급 장비. </td></tr><tr><td> exosomal RNA 및 RNA 분석의 분리 </td></tr><tr><td> miRCURY RNA 격리 키트 </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300,110 </td><td></td></tr><tr><td> 애질런트 2100 Bioanalyzer </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

exosome 연구 분야는 급속하게 최근 몇 년 동안 출판에 극적인 증가, 확장됩니다. endocytic 원산지 이러한 작은 vesicles (30-100 NM)는 첫번째 적혈구 한으로 자라고있는 동안 reticulocytes는 트랜스페린 수용체를 근절하기위한 방법으로 함수를 제안했고, 나중에 exosomes를 선정되었습니다. Exosomes는 multivesicular 기관 (MVBs)를 생산, endosomes 후반의 신진 안쪽에 의해 형성되며, 플라즈마 막 2 MVBs의 융합에 의해 환경에 발표됩니다. exosomes의 첫 발견 이래, 세포의 광범위한 이러한 vesicles 발표 보여왔다. Exosomes 또한 플라즈마, 코와 세척 유체, 타액과 모유 3-6 포함한 여러 생물 학적 체액에서 발견되었습니다. 또한, 그것은 exosomes의 내용과 기능은 원래 세포와 그들이 생산되는 아래의 조건에 따라 해당 증명되었습니다. 기능의 다양한 귀신을했습니다이러한 알레르기 항원 7,8, 마우스 9, T 세포 규제 13, T 세포 증식 14 자극으로 자연 킬러 세포의 억제 및 활성화 10-12, 분화 촉진 설립 종양의 근절에 대한 내성의 유도로 exosomes, 그리고 대한 trated 15 apoptosis T 세포의 유도. 2007 년 우리는 마스트 세포에서 발표 exosomes 메신저 RNA (mRNA)와 microRNA (miRNA)를 포함하고 RNA는 세포 하나에서 exosomes를 통해 다른 shuttled 수있다는 것을 보여주었다. 받는 사람 세포에서 exosomes로 shuttled mRNA는 RNA 양도 16 규제 기능을 제안, 단백질로 번역되는 표시했다. 또한, 우리는 또한 산화 스트레스가 성장 세포에서 파생된 exosomes받는 사람 세포에 대한 스트레스에 대한 내성을 유발하기 때문에 exosomal 셔틀 RNA 17 생물 학적 기능을 제안할 수 것으로 나타났습니다. 세포 배양 매체와 생물 학적 유체의 공동vesicles의 혼합물을 ntain과 조각을 창고. exosomes을위한 고품질의 절연 방식은, 특성화 및 exosomes과 콘텐츠의 식별 다음, 따라서 다른 vesicles과 입자의 exosomes를 구별하는 데있어 매우 중요합니다. 여기, 우리는 세포 배양 매체와 체액 모두에서 exosomes의 고립을위한 방법을 제시한다. 이 분리 방법은 exosomes이 pelleted하는 최종 ultracentrifugation 단계 다음 반복 원심 분리 및 여과 단계에 따라 달라집니다. exosomes를 식별하고 exosomal 형태 및 단백질 함량을 특성화하는 것이 중요합니다 방법은 전자 현미경, 유동세포계측법 및 서양 얼룩을 포함하여 강조 표시됩니다. 전체 exosomal RNA의 정화는 스핀 칼럼 크로마 토그래피에 기반하고 exosomal RNA 수율 및 크기 분포는 Bioanalyzer를 사용하여 분석합니다.

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Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

99.0K 조회수.  University of Gothenburg. 본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

연구

생물학

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

시아노박테리아의 피코빌리좀의 격리 및 특성화

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential biotechnology models. Recent work has demonstrated that both marine and freshwater cyanobacteria produce extracellular vesicles -&#160;small membrane-bound structures released from the outer surface of the microbes. While vesicles likely contribute to diverse biological processes, their specific functional roles in cyanobacterial biology remain largely unknown. To encourage and advance research in this area, a detailed protocol is presented for isolating, concentrating, and purifying cyanobacterial extracellular vesicles. The current work discusses methodologies that have successfully isolated vesicles from large cultures of Prochlorococcus, Synechococcus, and Synechocystis. Methods for quantifying and characterizing vesicle samples from these strains are presented. Approaches for isolating vesicles from aquatic field samples are also described. Finally, typical challenges encountered with cyanobacterial vesicle purification, methodological considerations for different downstream applications, and the trade-offs between approaches are also discussed.

The present protocol providesdetailed descriptions for isolation, concentration,and characterization of extracellular vesicles from cyanobacterial cultures. Approaches for purifying vesicles from cultures at different scales, trade-offs among methodologies, and considerations for working with field samples are also discussed.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can indirectly shape brain function. At the interface between the brain and the systemic circulation, the choroid plexuses (CP), which constitute the blood-cerebrospinal fluid barrier, have been highlighted as a key site of periphery-to-brain communication. CP produce the cerebrospinal fluid, neurotrophic factors, and signaling molecules that can shape brain homeostasis. CP are also an active immunological niche. In contrast to the brain parenchyma, which is populated mainly by microglia under physiological conditions, the heterogeneity of CP immune cells recapitulates the diversity found in other peripheral organs. The CP immune cell diversity and activity change with aging, stress, and disease and modulate the activity of the CP epithelium, thereby indirectly shaping brain function. The goal of this protocol is to isolate murine CP and identify about 90% of the main immune subsets that populate them. This method is a tool to characterize CP immune cells and understand their function in orchestrating periphery-to-brain communication. The proposed protocol may help decipher how CP immune cells indirectly modulate brain function in health and across various disease conditions.

This study uses flow cytometry and two different gating strategies on isolated perfused mice brain choroid plexuses; this protocol identifies the main immune cell subsets that populate this brain structure.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

The brain is no longer considered as an organ functioning in isolation; accumulating evidence suggests that changes in the peripheral immune system can ...