Name: flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.

주의 :이 프로토콜에서 사용되는 여러 가지 화학 물질을 자극하고 피부 접촉시 유해 있습니다. 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하고이 프로토콜을 수행하기 전에 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 단계 (1.1.1)에서 사용 피라냐 용액은 부식성이고 교반하면서 산에 서서히 과산화물을 첨가함으로써 제조한다. 흄 후드에서 극단주의와이 솔루션을 처리합니다. 적절한 눈 보호 및 부식 방지 장갑을 사용합니다. 트리메틸 클로로 실란 (TMCS)는 (1.1.6) 후 선택 단계에서 사용, 부식성, 인화성 화학 물질이다. 흄 후드에서이 화학 물질을 처리합니다. 주 : 입자상 물질에 의한 오염을 최소화하기 위해 클린 룸 바코드 슬라이드 제조 및 임계 유동 패터닝 과정을 수행한다. 먼지 입자는 포트와 PDMS 몰드의 마이크로 블록 및 플로우 패턴을 방해 할 수있다. 한 - dimensiona 1. 건설L DNA 바코드 슬라이드 <ol><li> 바코드 흐름 패턴의 SU-8 마스터의 준비 주 : 수직 흐름 패턴위한 도면 (도 1A-B)은 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 생성된다. 이러한 패턴은 크롬 포토 마스크에 렌더링됩니다. 마스크의 투명 영역은 SU-8 마스터의 기능에 해당합니다. <ol><li> 96 ° C로 가열 한 30 % H 2 O 2 (피라냐 용액) : 완전히 3 H 2 SO 4의 혼합물에, 실리콘 웨이퍼 (100mm 직경)를 청소한다. 탈 이온수 및 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 세척 질소 블로우 총 건조 하였다. </li><li> 웨이퍼에 SU-8 2,025 포토 레지스트의 약 4 ml에 붓고. 균일 한 다음 3000 rpm에서 30 초, 500 rpm에서 10 초 동안 웨이퍼 상에 포토 레지스트를 확산 프로그램을 스핀 코터를 사용한다. 이는 ~ 25 ㎛의 두께를 갖는 포토 레지스트 층을 생성한다. 점차적으로 중지하기 전에 천천히 회전 허용 -이 마이입니다웨이퍼의 표면에 균일 한 피막을 ntain. </li><li> 다음 65 ℃에서 1 분 핫 플레이트에 코팅 된 웨이퍼, 빵을 95 ℃에서 5 분. 이 단계는 코팅이 응고 할 수 있습니다. 5 분 동안 실온으로 냉각. </li><li> 포토 레지스트 코팅에 크롬 마스크 (그림 1C)을 놓습니다. 20 초 동안 근 자외선 (350-400 nm의, 노광 에너지 150-160 엠제이 / ㎠)에 마스크 기능을 노출. 참고 : 크롬 마스크의 디자인은 50 μm의 피치 20 μm의 넓은 각각 20 개의 채널이 포함되어 있습니다. 채널은 대향 단부에 패턴의 일단으로부터 권취된다. 요컨대, 채널 20 ~ 40mm의 길이 ~ 20mm의 폭을 갖는 직사각형의 영역을 커버한다. 각 채널은 입구 및 출구에 해당하는 두 원형 특징 어귀된다. 입구와 출구는 교환 할 수있다. </li><li> 95 ° C에서 5 분 동안 핫 플레이트상에서 노광 된 웨이퍼를 굽는다. 서서히 실온으로 냉각. </li><li> 교반 SU-8 개발자의 웨이퍼를 담가5 분. 이소 프로필 알콜이어서 신선한 SU-8 현상액의 작은 부분으로 웨이퍼를 세척 하였다. 질소 블로우 건을 이용하여 웨이퍼를 건조. 하드 베이크 30 분 동안 200 ℃로 열판에서 웨이퍼 및 웨이퍼를 실온으로 서서히 냉각되도록. 주 : 백색 필름이 단계에서 세척 후에 관찰되면 발전은 더 긴 시간 동안 수행 될 수있다. 선택적 : 10 분 동안 폐쇄 된 배양 접시에 트리메틸 클로로 실란 증기에 노출에 의해 SU-8 마스터 silanization합니다. </li></ol></li><li> 바코드 PDMS 몰드의 제조 <ol><li> 4.0 g 경화제와 40.0 g의 실리콘 엘라스토머 기재를 결합한다. 10 분 동안 격렬하게 예비 중합체 혼합물을 교반한다. 진공 하에서 20 분 동안 드가. 주 : 1 (기본 : 경화제) 질량비 일반적으로 10을 사용합니다. </li><li> 바코드 형 패턴의 SU-8 마스터와 실리콘 웨이퍼를 함유하는 페트리 접시로 프리폴리머를 붓는다. PDMS 혼합물의 높이는 약 7.5 mm 이상이어야한다. 페트르의 혼합물을 탈기두 번째는 다음 PDMS는 치료 할 수 있도록 75 ℃에서 1 시간 동안 혼합물을 구워, 남아있는 거품을 제거하기 위해 내가 요리. 참고 :이 단계에서 PDMS 몰드의 구멍을 통해 핀 / 튜브의 삽입에 PDMS 유리 결합에 너무 많은 긴장을 추가하지 위 ~에 7.5 mm의 PDMS의 슬래브의 충분한 두께를 유지하거나하는 것이 중요하다 (1.3.3.1)를 </li><li> 메스를 사용하여 조심스럽게 바코드 금형의 기능을 포함하고 있으며 웨이퍼의 슬래브를 벗겨 PDMS의 슬래브의 주변 잘라. </li><li> 바코드 PDMS 몰드의 원하는 형상을 얻기 위해 슬래브의 가장자리 트리밍. 플런저 생검 펀치를 이용하여 금형 (20)을 통해 구멍 (1.0 mm 직경) 펀치. 구멍이 바코드 패턴의 순환 기능과 정렬되어 있는지 확인합니다. 이 구멍은 입구와 출구 역할을한다. </li></ol></li><li> 폴리 -L- 라이신 일차원 패터닝 (PLL) <ol><li> 질소 블로우 건을 사용하여 폴리 -L- 리신 코팅 된 슬라이드 유리의 표면에 임의의 먼지를 제거한다. ATTACH 깨끗한 유리 슬라이드에 PDMS 몰드. 금형 및 슬라이드의 가장자리가 정렬되어 있는지 확인합니다. </li><li> PDMS 금형 및 PLL 코팅 슬라이드 사이의 결합을 강화하기 위해 75 ℃에서 1.5 시간 동안 굽는다. 한편, (0.5 mm의 내부 지름과 1.5 mm의 외부 직경, 4 인치 조각 3-)가요 폴리에틸렌 튜브 20 개를 준비한다. 주 : 튜브 부분의 개수는 PDMS 몰드 바코드의 입구의 수에 대응한다. 튜브 결합하도록 압력 조절기를 구비 한 질소 가스 탱크 바코드 PDMS 몰드에 채널을 제공. </li><li> 튜브의 각 부분의 일단에, 스테인리스 중공 핀 (직경 1 ㎜)를 부착. 대기음 멸균 여과 튜브의 적어도 1cm가 용액으로 채워질 때까지, 폴리 -L- 리신 핀을 통해 용액. <ol><li> PDMS 바코드 형 (그림 1E)의 입구에 (솔루션 채워진 튜브에 연결) 핀을 고정합니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다압력 조절 질소 탱크 셋업. 용액은 적어도 6 시간 동안 0.5-1 PSI의 압력 범위를 사용하여 주형을 통해 흐르도록 허용한다. 참고 : 모든 흐름 패터닝 절차 (1.3.3) 단계를 참조하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> ssDNA를 14 분의 1 차원 패터닝 주의 : 후속 단계에 사용 된 인산 완충 식염수 (PBS)이 137 mM의 염화나트륨, 10 mM의 나트륨 2 HPO 4, 및 2 mM의 KH 2 PO 4 완충액의 pH가 7.4 인으로부터 제조된다. <ol><li> PBS 2 MM의 비스 (sulfosuccinimidyl) 수베 (BS3) 솔루션을 준비합니다. PBS 또는 초순수에 A, B 및 C ssDNA를 (5&#39;-아민, 80 뉴클레오티드 수정)의 300 μm의 솔루션을 준비합니다. 참고 : N의 -hydroxysuccinimide 에스테르 쉽게 가수 분해를 거쳐 때문에 준비 후 약 30 분 이내에 BS3 솔루션을 사용합니다. </li><li> 2 mM의 비스 2.5 μL (sulfosuccinim 300 μM의 A, B, 또는 C ssDNA를 2.5 μL 수확기각 채널. A, B, 및 C에 대한 DNA의 짧은 서사시 PBS) 수베 각각 채널 1, 2로 지정하고 3된다. 이 순서는 또한 3 채널 (그림 2A)의 나머지 세트에 적용됩니다. </li><li> 수행 단계 (1.3.3). 이번에는, 스테인리스 강 핀 통해 폴리에틸렌 튜브에 5 ㎕의 BS3 / DNA 용액을 흡인, 질소원에 커플 후 PDMS 몰드. BS3 / DNA 용액은 약 40 분 동안이나 채널이 가득에서까지 바코드 금형을 통과하도록 허용합니다. </li><li> 한 번에 모든 채널이 가득 흐름을 중지 한 후 2 시간 동안 실온에서 바코드의 BS3 / DNA 용액을 품어. 용액을 건조하는 것을 허용하지 마십시오. 75 ° C에서 1 시간 동안 부착 된 바코드 슬라이드와 PDMS 몰드 구워. 주의 : 후속 흐름 패터닝 단계의 정렬을 용이하게하기 위해, 바코드 슬라이드 채널 패턴의 가장자리에 설명 될 수있다. 이 신중 다이아몬드를 사용 scrib 유리 표면을 긁 의해 이루어진다E는 유리 슬라이드의 하부에 정렬 마커를 생성한다. 프로토콜의 나중 단계에서 정렬 현미경으로 확인할 수있다. </li><li> 바코드 슬라이드에서 PDMS 몰드를 제거합니다. 초순수와 SDS는 한 번 세 번 0.01 %로 부드럽게 슬라이드를 씻으십시오. <ol><li> 현미경 슬라이드 스피너를 사용하여 바코드 슬라이드를 건조. 이후 사용을 위해 깨끗한 50 ML의 원심 분리 관에 바코드 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 바코드 슬라이드에 한 차원 패턴 2. 검증 주 :이 검증 프로토콜은 후속 흐름 패터닝 공정의 품질을 평가하는데 사용하기 위해 적응 될 수있다. <ol><li> 슬라이드 블로킹 <ol><li> PBS에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비한다. 사용하기 전에 0.45 μm의 주사기 필터를 통해이 솔루션을 필터링합니다. 겔 로딩 팁을 사용하여, 바코드 슬라이드의 한쪽 모서리에 1 % BSA 용액 50 μL를 적용. </li><li> 1 % BSA의 오디오 솔루션을 품어RT에서 1 시간 동안 이온. </li></ol></li><li> 시아닌 3 (Cy3에)와 배양 보완 DNA를 π 공역 계 <ol><li> 일단 Cy3에 접합의 칵테일 &#39;, B&#39;및 C &#39;올리고 뉴클레오티드를 준비합니다. &#39;B&#39;및 C &#39;의 서열은 각각 A, B, C 및 이들의 상보 적이다. Cy3에-DNA의 작용 농도는 0.1 % BSA 0.05 μM이다. </li><li> 피펫으로 슬라이드에서 BSA 솔루션을 제거한 다음 슬라이드의 같은 가장자리에있는 DNA 칵테일 용액 30 μl를 적용합니다. 1 시간 동안 실온에서 슬라이드를 Cy3-DNA 칵테일을 품어. photobleaching에에서 Cy3에 부분을 보호하기 위해 어둠 속에서이 배양 단계를 수행합니다. </li></ol></li><li> 형광 강도의 분석 <ol><li> 희석 PBS에 마지막으로 Cy3에-DNA 칵테일을 피펫하고, 1 % BSA의 PBS를 슬라이드를 씻어 (1 페이지50 부품 초순수 예술 PBS). 스피너를 사용하여 슬라이드를 건조. </li><li> 형광 현미경 또는 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 형광 (도 2B)를 관찰한다. 마이크로 어레이 스캐너를 사용하는 경우, 532 nm의, 5 마이크론 픽셀 크기, 15 %의 광전자 증 배관 (PMT) (450)에서의 이득 및 전력의 레이저 발광 파장을 설정한다. </li></ol></li></ol> 2 차원 (3 × 3) DNA 어레이 (14)의 제조 3 <ol><li> 바코드 PDMS 몰드의 제조 <ol><li> 다른 SU-8 마스터를 구성하는 방법 (1.1)을 수행하지만,이 시간은 수직 제 설계의 그것에 흐름 패턴과 크롬 마스크를 사용한다. 수직 패턴으로 새로운 PDMS 몰드를 구성하는 절차 (1.2)을 수행합니다. </li></ol></li><li> ssDNA를 이차원 흐름 패터닝 <ol><li> 3 × 3 배열의 경우, A&#39;-I, B&#39;-II의 150 μm의 재고 솔루션, C&#39;-III, A&#39;-IV, B&#39;-V, C&#39;-VI, A&#39;-VII, B를 제조3 % BSA / PBS에서 &#39;-viii 및 C&#39;-IX DNA. 이러한 올리고 뉴클레오티드는 &quot;브리징 시퀀스&quot;(그림 2A)의 역할을한다. 올리고 뉴클레오티드 용액 (솔루션 1~3) 워킹 농도가 각각 50 μM 올리고 뉴클레오티드가되도록 조합. 표 1에서 제공하는 가이드를 사용합니다. </li><li> 0.5 psi에서 1 시간 동안 20 개의 채널로 3 % BSA / PBS 차단 용액을 흐른다. </li><li> 유동 한 솔루션 각각 2, 채널 1, 2, 3으로, 3,. 3 채널의 다음 세트의 순서를 따릅니다. 흐름은 일반적으로 약 40 분에 완료됩니다. DNA가 혼성화 할 수 있도록하기 위해 2 시간 동안 실온에서 DNA 용액을 배양한다. </li><li> 혼성화되지 않은 DNA를 제거하기 위해 0.5 psi에서 1 시간 동안 20 개의 채널로 3 % BSA / PBS 차단 용액을 흐른다. PDMS 슬래브 벗기고, 그리고 3 % BSA로 유리 슬라이드를 디핑에 의해 얻어진 DNA 마이크로 어레이 슬라이드를 세척 / PBS 일단과 PBS 배 희석 PBS (1 부, PBS 50 부 초순수) 하였다. 디현미경 슬라이드 스피너를 사용하여 슬라이드를 RY. </li><li> 내가 Cy3에 접합 된 것을 &#39;은 9&#39;섹션 2. 올리고 뉴클레오타이드에 유사한 두 번째 검증 단계 (그림 2C)을 수행합니다. 이후 사용을 위해 50 ML의 원심 분리 관에 3 × 3 배열 슬라이드를 저장합니다. 주 : DNA 마이크로 어레이 달 동안 데시 케이 터 내에서 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 항체 배열에 3 × 3의 DNA 배열 4. 변환 <ol><li> 항체 올리고 뉴클레오티드 (DEAL) 복합체의 제조 <ol><li> 200 MM의 숙신 -4- 포르 밀 (S-4FB) 및 무수 N 40 mM의 숙신-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic), N- 디메틸 포름 아미드 (DMF)의 솔루션을 준비합니다. </li><li> PBS에서 캡처 항체의 7 별도의 솔루션 (1 ㎎ / ㎖)까지 준비합니다. 주 : 항체 원액 나트륨 아 지드 정균제가 포함되어 있으면, 스핀 탈염 C를 이용하여 PBS로 완충액 교환을 수행7 kDa의 분자량 컷 - 오프 (MWCO)와 olumns. </li><li> 필자가, &#39;II&#39;III &#39;IV&#39;V &#39;VI&#39;와 VII &#39;의 DNA를 별도의 400 μm의 솔루션을 준비합니다. 하나 올리고 뉴클레오티드 서열에 각각 캡처 항체를 할당합니다. 마이크로 원심 튜브에 DMF의 12.25 μL 400 μm의 DNA를 40 μl를 결합하고 철저하게 혼합 스핀 다운. <ol><li> 각각의 DNA / DMF 용액에, DMF 200 mM의 S-4FB의 2.3 μl를 추가합니다. 캡처 항체의 매 100 μg의 경우, DMF에서 40 mM의 S-HyNic의 2.25 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 실온에서 4 시간 동안 항체 / S-HyNic 및 DNA / S-4FB 솔루션을 품어. </li><li> 항체 DNA 커플 링 반응에 대비하여, pH를 6에서 구연산 버퍼를 세척하여 새로운 스핀 탈염 열 (각 항체에 대한 각각의 DNA 용액에 대해 하나 하나)를 준비합니다. </li><li> 배양 4 시간 후, 각 항체 / S-HyNic 및 DNA / S-4FB 솔루션에 대한 버퍼 교환을 수행합니다. S-4FB 접합 결합 <stroNG&gt; 난 &#39;, II&#39;, III &#39;IV&#39;V &#39;VI&#39;와 항체-S-HyNic 접합체와 VII &#39;올리고 뉴클레오티드. RT에서 2 시간 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> 반응 O / N에서 4 ° C를 품어. </li></ol></li><li> 항체 올리고 뉴클레오티드 (DEAL) 복합체의 정제 참고 : 항체 올리고 뉴클레오타이드 복합체를 정화 수퍼 로스 6 300분의 10 GL 열이 장착 된 표준 FPLC 시스템에서 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)을 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 280 ㎚에 FPLC 시스템의 UV 검출기 파장을 설정한다. 과량 S-4FB-DNA로부터 항체 - 올리고 뉴클레오티드 복합체를 분리하는 0.3 ㎖ / 분으로 PBS (PH 7.4)의 등용 매 유동을 사용한다. </li><li> 접합체를 함유하는 분획을 풀 및 10 kDa의 MWCO으로 스핀 필터를 사용하여 150 μL의 부피 분획을 농축시킨다. </li></ol></li><li> 항체의 이차원 패터닝 <ol><li> microchambers 또는 마이크로 웰 우리에게 또 다른 PDMS 몰드를 준비단계에서 보내고 제조 절차 (1.2). PDMS 몰드는 면역을위한 나노 리터 우물에 마이크로 리터를 포함 할 수있다. 참고 : 유체 샘플 일반 바이오 마커 검출을위한 여러 우물와 PDMS 몰드는 배열 슬라이드와 결합된다. PDMS 몰드의 특징은 시스템이 연구되고에 의존한다. 예를 들어, 단일 세포 실험에서 단백질의 검출은 0.15 NL 볼륨으로 microchambers 함유 PDMS 몰드로 행할 수있다. </li><li> (선택 사항)의 패턴 표면의 친수성을 렌더링하는 데 1.5 분 동안 플라즈마에 PDMS 몰드 청소 (18 승) 될 수 있습니다. 이전 플라즈마 세정에 직접 3 × 3 배열 슬라이드에 결합 할 다른 모든면을 차단하는 접착 테이프를 사용합니다. 참고 : 단계 (4.3.2)는 선택 사항이지만 PDMS 몰드가 단일 세포 실험에서 사용하기위한 것입니다 때 일반적으로 수행됩니다. </li><li> 3 × 3 배열 슬라이드와 PDMS 몰드 메이트, 다음 PBS에 1 % BSA와 슬라이드를 차단합니다. 실온에서 1 시간 동안 품어. Meanwhi제작은, 항체 올리고 뉴클레오타이드 복합체의 칵테일 (200 μL 최종 볼륨)을 준비합니다. 각 접합체의 작동 농도는 1 % BSA / PBS에 10 ㎍ / ml 인 것을. </li><li> 다음시켜 항체 배열 DNA 배열을 변환 접합체의 뉴클레오티드 잔기는 3 × 3 어레이에 관한 특정 지점으로 혼성화 할 수 있도록 37 ° C에서 1 시간 동안 배양, 항체 - 올리고 칵테일을 추가한다. </li><li> 청소하고 슬라이드를 건조하는 단계를 반복합니다 (3.2.4). 항체 배열을 즉시 사용하는 경우 가장 높은 감도를 달성 할 수있다. 장기간 보관 감도의 손실이 발생할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 단백질의 검출 <ol><li> 재조합 단백질을 재구성 또는 필터링 된 세포 샘플을 준비합니다. </li><li> 맞춤 설계된 칩 마이크로 어레이 메이트, 1 시간 동안 PBS에서 3 % BSA와 표면을 차단합니다. 그런 다음 BSA 솔루션을 제거하고 샘플을 적용하고 2 시간 동안 품어. </li><li> PBS에서 3 % BSA를 사용하여 샘​​플을 씻어 세 번다음 제품 시트가 제공 농도로 검출 된 항체를 추가 거라고. 2 시간 동안 품어. </li><li> PBS로 세 번 3 % BSA에 의해 검출 항체를 씻어하고 1 시간 동안 인큐베이션 1 ㎍ / ㎖의에 -streptavidin 시아닌 5 (Cy5에)를 추가한다. </li><li> 청소 및 검사 용 슬라이드를 건조하는 단계를 반복합니다 (3.2.4). </li></ol></li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells.">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells.">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499 (2014).</li><li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density,+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications.">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications.">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li><li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-encoded+antibody+libraries:+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins.">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li><li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+protein-protein+cross-linking.">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li><li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density,+microfluidics-based+DNA+microarrays,+with+applications+to+single+cell,+multiplex+assays+of+secreted+proteins.">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

흐름 패턴 디자인은 2-D 마이크로 어레이를 제조하는데 중요한 첫 단계이다. 유리 기판 상에 겹치는 두 DNA 패턴을 생성하기 위해, 제 디자인의 채널 특징은 초 (도 1A-B)들에 수직이어야한다. 디자인은 또한 마이크로 어레이의 다운 스트림 응용 프로그램을 고려합니다. 단일 세포 분석의 경우, 마이크로 어레이는, 따라서 채널 치수는 2-D 어레이에 정렬 microchambers 양립되어 m...

항체 Microarrays 널리 생체 단백질 1-3 비롯한 표적 단백질의 존재를 조사하기 위해 수십 년간 단백체 연구에 사용되었다. 이 필드는 현재와 같은 질량 분석기 (MS) 등의 높은 처리량 기술에서 큰 도전에 직면하고 있지만, 이러한 장치는 다른 분석과 간단한 데이터 해석과 쉬운 인터페이스를 여유가 주로 때문에, 여전히 항체 마이크로 어레이의 유틸리티의 여지가있다. 최근 몇 년 동안, 마이크로 칩의 발판으로 마이크로 어레이의 통합은 항체 마이크로 어레이에게 4-7 번창 할 수있는 새로운 기회를 제공하고 있습니다. 예를 들어, 단일 - 셀 마이크로 칩에 통합 바코드 마이크로 어레이는 휴대 통신 8,9 연구에서 사용되어왔다. 이 기술은 다른 사용 가능한 마이크로 어레이 기술에 비해 독특한 장점이 있습니다. 그것은 기존의 마이크로 어레이 elemen에서 사용되는 전형적인 150 μm의 크기보다 훨씬 작은 10 ~ 100 μm의에서 배열 요소를 갖추고 있습니다TS. 작은 어레이 요소의 구성은 체계적 흐름 패터닝 방법을 이용하여 달성되며, 이는 단일 세포 분비 된 단백질과 세포 내 단백질을 검출 할 수있는 소형 마이크​​로 어레이를 일으킨다. 또 다른 장점은 간단한기구가없는 설정의 사용이다. 대부분의 실험실 및 작은 기업이 마이크로 어레이 코어 설비에 액세스 할 수 없을 수 있기 때문에, 특히 중요하다. 이러한 바코드 항체 마이크로 어레이 분석 처리량의 개선 된 특성과 종래의 샌드위치 효소 면역 분석법의 것과 유사한 높은 민감도와 특이도 (ELISA 8)를 가지면서 단일 세포에 높은 다중 분석법을 수행하는 데 사용될 수있다. 이 기술은 종양 세포를 13 아교 모세포종 단백질 9-11에서, T 세포 (12)를 검출하고, 순환하는 수많은 응용 분야를 발견하고있다. 또한, 바코드의 DNA 마이크로 어레이는 혼자 해내는 대한 신경과 성상 세포의 정확한 위치에 사용되어왔다뇌 조직 (14)의 생체 어셈블리를 보내고. 이 프로토콜은 단지 실험 단계와 유체 샘플에서 바이오 마커의 검출에 응용 가능성을 갖는 2 차원 (2-D) 바코드 항체 마이크로 어레이의 빌드 업 블록과 하나의 셀에 초점을 맞추고있다. 기술 어 드레서, 단일 가닥 일 차원 (1-D) DNA 마이크로 어레이에 기반을 유리 기판 상에 공간적으로 패터닝 직교 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 구축 하였다. 평행 유동 채널이 플로 패터닝 공정에서 사용되는 경우 1-D 패턴을 형성하고, 이러한 패턴은 1-D 제품 코드 (Universal Product Code, UPC) 바코드 비슷해 이산 밴드로 나타난다. 2-D (n × m) 개의 항체 어레이의 건설 - 2-D 빠른 응답 (QR) 매트릭스 코드 연상 - 더 복잡한 패터닝 전략을 필요로하지만, 높은 밀도 8,15에서 항체의 고정화를 허용한다. 제조둘째 직교 1 패턴 두 DNA 패터닝 단계를 필요로한다. 이 두 가지 패턴의 교차점 어레이의 N × M 소자를 구성한다. 전략적 유동 패터닝에서 사용될 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 시퀀스를 선택함으로써, 주어진 배열의 각 요소는 특정 주소가 할당된다. 이 공간 참조는 마이크로 어레이 슬라이드에 형광 신호를 구별 필요하다. ssDNA를 어레이 (DEAL 16)로 인코딩 된 DNA 항체 라이브러리라는 플랫폼을 형성하는 상보 적 DNA 항체 컨쥬 게이트의 혼입을 통해 항체 배열로 변환된다. 이 비디오 프로토콜은 두 방향에서 제조 포함 N × M 개의 항체 배열 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 바코드 금형, 유동 패터닝 ssDNA를를 생성 항체 올리고 뉴클레오티드 DEAL 접합체를 제조하고, (3)에 3 × 3 DNA 배열을 변환하는 주요 단계를 설명× 3 항체 배열입니다.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer base</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafers&amp;nbsp;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine adhesive stock solution</td><td>Newcomer Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) suberate&amp;nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate buffered saline, pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&amp;nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Capture antibodies</td><td>various</td><td>various</td><td>*Antibody selection depends on application</td></tr><tr><td>Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid, anhydrous</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Diamond scribe (Style 60)</td><td>SPI supplies</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Trimethylchlorosilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.

PDMS 금형 (그림 1A-1B)에 대한 설계는 CAD 프로그램 (의 AutoCAD)를 사용하여 그려진. 흐름 패턴, 수평 하나는 수직에 대한 기능 채널을 보여 두 디자인. 각각의 디자인의 좌우 대칭 인 부분; 그 중 하나는 입구 또는 출구 수 있습니다. 20 채널들 각각은 줄곧 일단에서 타단까지 권취된다. 각각의 디자인은 크롬 포토 마스크 (그림 1C)에 인쇄되어 있습니다. ...

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Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

flow-pattern-guided-fabrication-high-density-barcode-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.5K 조회수.  University at Albany, State University of New York.  이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다. 

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Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

연구

암 연구학

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

검출 실험 프로토콜<em&gt; 시아 노 박테리아</em&gt; 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

환경과학

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

고밀도 DNA 및 RNA 마이크로어레이 - 광소학 합성, 하이브리드화 및 대형 핵산 라이브러리의 제조

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

유전학

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

생물학

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

면역학 및 감염병학

Detecting Circulating Anti-Glycan Antibodies with a Printed Glycan Array

Source: Olivera-Ardid, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57662">Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video demonstrates printed glycan array technology for analyzing circulating anti-glycan antibodies in mouse serum. The antibodies in the serum interact with specific glycans on the chip, which is confirmed by immunostaining followed by fluorescence scanning.

Printed Glycan Array를 사용한 순환 항글라이칸 항체 검출

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Glycochips Production

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

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