다중 바코드 이미지 분석을 통해 얻은 대량의 생물학적 정보를 통해 과학자들은 종양 미세 환경과 종양 세포 내의 특수 분포를 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 개별 세포의 더 깊은 표현형을 수행 할 수있는 가능성과 함께 동일한 조직 샘플에서 훨씬 더 자세한 정보를 제공한다는 것입니다. 이 방법을 통해 맞춤형 패널은 종양 미세 환경을 연구하여 새로운 표적 치료제로 사용할 암 조직에서 예측 바이오마커를 잠재적으로 발견할 수 있었습니다.
올리고뉴클레오티드 접합 항체 염색을 시작하려면 커버 슬립을 0.1% Poly-L-Lysine 용액에 실온에서 24시간 동안 담가 조직 배치 및 부착을 준비합니다. Poly-L-Lysine 용액을 배출한 후 커버 슬립을 초순수로 30초 동안 세척합니다. 세탁 후 초순수에서 커버 슬립을 제거하고 보푸라기가 없는 수건에 올려 밤새 건조시킵니다.
관심 조직의 5미크론 두께 부분을 Poly-L-Lysine으로 충전된 커버 슬립의 중앙에 놓고 밤새 건조시킵니다. 커버 슬립 홀더를 섭씨 60도의 오븐에서 밤새 예열합니다. 예열된 홀더에 조직 부분이 포함된 커버 슬립을 놓습니다.
섭씨 60도에서 30분 동안 구운 후 파라핀이 조직에서 녹았는지 확인합니다. 샘플이 들어 있는 커버 슬립 홀더를 일련의 용액에 순차적으로 빠르게 배치합니다. 마지막으로 커버 슬립 홀더를 DEPC 처리된 초순수에 각각 5분씩 2회 동안 넣습니다.
빈 피펫 팁 상자의 바닥에 물에 적신 종이 타월을 놓아 습도 챔버를 준비합니다. 압력솥에 50밀리리터 비커 높이의 절반을 덮을 만큼 물을 채웁니다. 섭씨 4도의 비커에 샘플당 5밀리리터의 메탄올을 넣습니다.
필요한 부피의 AR9 완충액을 디에틸 피로카보네이트 또는 DEPC 처리된 초순수로 1X로 희석합니다. 다음으로, 50 밀리리터 유리 비커에 약 40 밀리리터의 희석된 AR9 완충액을 채운다. 비커의 커버 슬립 홀더에 샘플을 담그고 알루미늄 호일로 비커를 완전히 덮습니다.
물이 채워진 압력솥에 알루미늄 호일로 덮인 비커를 넣고 약 15PSI에서 20분간 조리합니다. 그런 다음 비커를 제거하고 알루미늄 호일의 포장을 조심스럽게 풉니다. 비커를 실온에서 약 10분 동안 식히십시오.
1X AR9 버퍼에서 커버 슬립 홀더를 제거합니다. DEPC 처리된 초순수에서 2분 동안 2회 배양합니다. 한편, 다중화 이미징 염색 키트에서 수화 완충액, 항체 희석제 및 차단 용액 N, G, J 및 S를 검색합니다.
커버 슬립 샘플을 5밀리리터의 수화 완충액에 각각 2분 동안 두 번 놓습니다. 그런 다음 커버 슬립 샘플을 5 밀리리터의 멀티플렉스 이미징 항체 희석제 블록에 넣고 실온에서 20 내지 30 분 동안 인큐베이션한다. 배양하는 동안 항체 칵테일을 준비하십시오.
배양 후 덮개 슬립을 미리 준비된 습도 챔버에 놓습니다. 190 마이크로리터의 항체 칵테일을 커버 슬립 샘플 상에 피펫팅하고, 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 다음에, 샘플을 2분 동안 5 밀리리터의 멀티플렉스 이미징 항체 희석제 블록으로 각각 2회 세척한다.
결합된 항체를 조직에 고정하기 위해 커버 슬립을 1.6%로 희석한 16% 포름알데히드에 10분 동안 보관 용액으로 배양하고 PBS로 3회 세척합니다. 커버슬립을 메탄올에서 5분 동안 배양한 후, 섭씨 4도로 미리 냉각한다. 세척 후, 커버 슬립을 PBS로 희석된 5 밀리리터의 고정제 시약에 다시 20분 동안 인큐베이션하고, 보관하기 전에 PBS로 3회 세척한다.
텍스트에 언급된 구성에 따라 리포터 마스터 믹스를 준비합니다. 96웰 플레이트의 웰을 리포터 마스터 믹스와 해당 실험 주기에 대한 특정 바코드 형광단이 포함된 245마이크로리터의 용액으로 채웁니다. 그림은 암종 패널에 사용된 리포터 플레이트 구성을 보여줍니다.
바코드가 부착된 형광단을 보호하려면 96웰 리포터 플레이트 위에 호일 플레이트 덮개를 부착하고 플레이트를 멀티플렉스 이미징 기기 내에 배치합니다. 현미경 스테이지에 샘플 커버 슬립을 놓고 핵 염색 용액의 1:1500 적정 700마이크로리터를 조직에 수동으로 피펫팅하여 DAPI 채널을 사용하여 이미징의 초점을 보정합니다. 다중화 이미징 기기를 준비하려면 DEPC 처리된 초순수를 사용하여 10X 다중화 이미징 버퍼를 1X로 희석하고 시약 병에 적절한 용액이나 용매를 채웁니다.
모든 현미경 매개변수를 설정하고 이미지화할 샘플 커버 슬립에서 관심 영역을 선택합니다. Instrument Manager 소프트웨어에 실험 설계를 입력합니다. 제어 소프트웨어에서 실험 버튼을 클릭하고 실험 설정 및 관리 창에서 새 템플릿 버튼을 클릭합니다.
프로젝트 단추 옆의 공간에 프로젝트 이름을 입력하고 총 주기 수를 입력합니다. 채널 지정 버튼을 클릭하고 각 주기에 대한 올바른 주기, 웰 번호, Z 스택 위치, 마커 이름, 클래스 및 노출 시간과 같은 각 주기에 대한 정보를 열에 입력합니다. 그런 다음 실험 시작을 클릭하여 실험을 시작하고 실험을 저장합니다.
컴퓨터에서 QuPath 아이콘을 클릭하고 소프트웨어를 엽니다. qptiff 파일을 뷰어 창으로 끕니다. 밝기 및 대비 버튼을 클릭하여 밝기 대비 창을 엽니다.
선택한 열에서 마커를 선택하거나 선택 취소하여 마커 신호를 표시하거나 숨깁니다. zoom to fit 버튼을 클릭하여 관심 영역을 확대 또는 축소합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 볼 때 합성 이미지는 원하는 대로 모든 마커 또는 선택된 마커를 표시했습니다.
모든 마커의 신호 강도, 동적 범위 및 공간 분포가 밝혀졌습니다. 이 기술을 사용하면 단일 조직 섹션에서 세포 내 수준에서 26 개의 마커를 모두 분석 할 수있었습니다. 다중화 이미지 분석 과정에 이어 정보학적 접근을 통해 고차원 단세포 데이터를 처리 및 분석하여 생물학적 및 임상적 통찰력을 추론할 수 있습니다.
멀티플렉싱 바코드 이미지 분석은 과학자들이 종양 조직을 프로파일링하고 패널의 마커에 따라 연구 질문에 답할 수 있도록 하는 강력한 방법론입니다.
