I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

1. 적절한 실험 전략 개발 <ol><li> 응집 과정이 요인 응집에 가장 강력한 효과를 가지고있는 즉, 설립 또는 최적화 될 수 있도록 관련된 환경 및 프로세스 매개 변수를 확인합니다. 일반적으로, 최근 20 인해 기계적 모델의 부족에 필요한 바와 같이 암컷 접근하도록 그러한 몇몇 파라미터들이있다. <ol><li> 문학 데이터 (12), 시스템에 대한 사전 지식과 경험을 바탕으로 선택 매개 변수 (요인). 일반적인 요인 완충액 pH 버퍼 전도성, 배양 시간 및 온도뿐만 아니라 중합체의 종류와 농도 15,16,27을 포함한다. </li><li> 범주 요인에 대한 의미있는 각 숫자 요인에 대한 범위와 수준을 정의하기 위해 동일한 참조 (1.1 참조)를 사용합니다. </li><li> 실험 결과 (응답) 모니터링 응집 효율을 평가하기 위해 사용되는 정의한다. 시스템에 따라, 이것을여과 액 또는 상층 액 탁도, 침강 속도, 골재 크기 또는 후속 필터 16,23,28-30의 용량이 될 수 있습니다. </li><li> 그 결과 고품질의 데이터는 이후 또는 다른 조작자에 의해 수행되는 실험을 보강 할 수 있도록 응답을 측정하기 위해 사용되는 검정 재현 / 정량적 견고하고 반복되도록. </li></ol></li><li> 요인의 수를 조사하고, 지식의 정도가 이미 시스템에 대한 축적 된 양복지 교육청 유형을 선택합니다. 적절한 미상 형 (20)을 식별하는 데 사용할 수 문학을 사용합니다. <ol><li> 매개 변수의 다수의 차폐되어 있거나 약간의 파라미터 범위의 의미에 대해 알려진 조사하는 응집 시스템에 대한 약간의 정보가있는 경우 선별 디자인을 선택한다. 일반적인 선별 디자인은 전체 및 부분 요인 설계이다. 파라미터가, 예를 들면 비선형 영향을 미칠 것으로 예상되는 경우, 설계 중심 포인트를 포함 </em&gt; 특정 임계 값 19 위의 포화. </li><li> 응답 표면 방법론 (RSM), 예를 들어 중앙 복합 디자인 (CCD) 31 또는 최적의 32, 33, 잘 알려진 범위가 단지 몇 요소가 필요하면 정확하게 특징으로 할를 선택합니다. </li></ol></li><li> 교육청 설계 공간의 비율이 20을 충족하는 등의 사전 품질 기준을 보장, 적절한 소프트웨어를 설치합니다. </li></ol> 2. 응집 실험을 준비 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig1.jpg" /> 그림 1 : 식물 추출물의 응집 워크 플로우 : 프로세스 스케일 (왼쪽)과 벤치 탑 규모 (오른쪽). 수성 완충액으로 단백질을 추출 후, 세포 파편의 분산 입자 응집제를 첨가하여 응집된다. 응집체 후 가방 깊이 여과 캐스케이드 이들의 능력에 의해 제거된다여액의 탁도와 함께 응집 필터의 효율을 측정하기 위해 직접 사용할 수있다. <ol><li> 일반 실험 워크 플로우 (그림 1)을 개발한다. <ol><li> 예를 들면 전문화 된 균질 최종 애플리케이션 규모 예상 동일한 입도 분포를 초래한다 (또는 이미 관찰) 추출 장치를 사용한다. 가능하면 담배 균질화 10 잎에서 기술 한 바와 같이, 추출기의 스케일 다운 모델을 설계한다. </li><li> 응집 실험 (여기에 20 ㎖) 중에 사용 된 추출물 볼륨을 정의합니다. 입자의 대표적인 숫자를 반응 용기에 존재할 수있는 양을 선택, 20 ㎖ 씩의 예 응집 실험은 고체 (34)의 입경 ~ 0.5 / V ▼] ~ 7 % 함유하는 담배 추출물 재현성 및 확장 결과를 수득 μm의 ~ 3mm 16. </li><li> 모든 모니터링 및 사후 응집 작업을 디자인하는 일 때문에EY 최종 애플리케이션 규모의 대표적인 생산 규모에서 사용 된 것과 동일한 입자 보유 동작으로 예를 들면 선택 필터. </li></ol></li><li> 추출물이 파생 될에서 식물을 재배. <ol><li> 같은 공장 라인, 여기에 담배 속 tabacum 이력서를 사용합니다. 쁘띠 하바나 SR1, 생산시 사용되는 배양 조건은 이전 33 설명했다. </li><li> 다른 공급 원료를 처리 할 경우, 그들은 예를 들어, 최종 응용 프로그램의 규모를 대표하는 정통 버퍼를 사용하도록 이러한 공급 원료를 준비 고려 모든 희석 단계를 과정과 여기에, 예상 pH와 전도도에 pH가 7.5 스틱 전도성 (30) MS의 cm -1. </li></ol></li><li> 여과 유틸리티, 탁도-모니터링 장치 및 샘플링 용기를 준비합니다. <ol><li> 그렇지 않은 경우, 여기에 필요한 크기 15 X 15cm 2 필터 재료를 잘라 준비 - 투 - 우리전자 모​​듈. 모든 모니터링 및 분석 장치가 작동 있는지 확인하고 모든 샘플 튜브 라벨. </li><li> 이러한 간단한 작업 비록 그들이 실제로 응집 실험 중에 중단을 야기되지 않도록하기 위해 시간에 이러한 항목을 준비한다. 그들이 그 응집을 주어진 결과를 방해 할 수 있기 때문에 지연을 방지하는 것은 시간에 따른 프로세스입니다. </li></ol></li><li> 응집제 재고 솔루션을 준비합니다. 주의 : 예를 들면 장갑을 응집제를 처리 할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용 할 것. 재료는 위험 할 수있다 (유럽 UE 67 / 548 / CEE에 따른 위험 라벨, 1999 / 45 / CE는 N, 사이 또는 Xn에 포함). 먼지를 피하고 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다. <ol><li> 여기에 각 응집제에 대한 주식 농도, 80.0 g의 L -1 사용 된 두 PEI의 응집제를위한 선택. 입자를 집중하고 줄일 응집제를 첨가 할 때 샘플의 희석을 피하기 위해 가능한 한 높은 선택 농도기 때문에이 응집 효율에 영향을 미친다. </li><li> 폴리머가 이미 수성 50 % [w / V] 솔루션으로 공급되면 예, 중합체의 제조 업체의 제형을 반영하는 사전 희석을위한 계정. 4~8% 응집제의 스톡 용액 [승 / V] 지금까지 가장 적합한 것으로 밝혀졌다. </li><li> 염두에 상술 점 베어링 응집제의 농도는 최종 농도 응집제가 정확하게 조정되어 있지 않기 때문에 잠재적 오류를 일으키는 피펫을 억제하는 고 점성 용액을 생성하지 않도록. </li><li> 이 때문에 오류의 가능성을 감소시키는 피펫 방식 (2.5)의 설치를 촉진하기 때문에 가능하면 모든 응집제에 대해 동일한 재고 농도를 사용합니다. </li><li> 추출물, 여기에서의 pH 및 전도도 4-10 15-55 밀리 cm -1의 조건에 일치하는 각 응집제 스톡 용액의 pH 및 전도도를 조정한다. m 경우 하나의 응집제에 대한 개별 주식을 준비pH 및 / 또는 전도도 조건 중 하나 세트보다 광석은 ​​고분자에 대한 시험한다. </li><li> 사용하기 전에 48 시간보다 더 이상, 갓 응집제 재고 솔루션을 준비합니다. 응집 이상 4 주간 저장된 중합체 주식으로 유도 될 수 있지만, 효율이 높거나 낮은 pH 값에서 중합체의 가수 분해로 인해 감소 할 수있다. 자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조하십시오. </li><li> 여기, 4 ° C, 20 ° C, 37 °의 C를 배양 온도를 조절 할 수 가열 / 냉각 화장실이 보장 예를 들어, 미상 선택 매개 변수가 실험 기간 동안 각 샘플에 대해 정밀하게 조정할 수 있는지 확인합니다. 응집 동안 혼합하여 실험의 일부인 경우, 상기 혼합 장치는 전원 입력으로 임계 파라미터의 관점에서 최종 프로그램 규모를 나타내는 것을 보장한다. </li></ol></li><li> 피펫 계획에 미상 일정을 변환합니다. <ol><li> TES로 다른 응집제의 농도 변환추출 된 샘플에 첨가한다 원액 볼륨으로 테드 : 재고 농도 최종 농도 응집제 나누어 응집 실험에 사용 된 시료 부피 곱한다. 시료 20 ㎖이 22 ml의 것입니다 2 ml의 응집제 원액의 최대 혼합되어있는 경우 예를 들어, 가장 큰 결과 최종 부피를 식별합니다. </li><li> 응집제 재고 0.75 ㎖를 다음 완충액 1.25 mL를이 유지해야하는 시료에 첨가해야하는 경우 응집제 주식의 큰 부피를 기준으로 모든 응집 분취 동일한 최종 부피를 유지하는 데 필요한 버퍼의 양을 첨가하기 위해, 예를 계산할 22 ml의 최종 샘플 량 (2.5.1). </li><li> 에너지 부에 필요한 원액의 절대 양을 계산하기 위해 각각의 고분자 응집제의 응집 조건 스톡 용액의 양을 요약. </li></ol></li><li> 수확 담배 잎 추출을 준비합니다. <ol><li> 상위 6 레아를 제거이러한 또는 균질로 보이는 군 (또는 처리 지침에 의해 표시된만큼) 적절한 추출 장치에 대한 적절한 연령, 6 주 오래 예를 들어, 및 전송의 담배 공장에서 프레스 나사. </li><li> 100g 당 예를 들어, g 바이오 매스 당 300 mL로 추출 버퍼의 세 권을 추가하고 8 분 동안 혼합. </li><li> 다른 pH 및 / 또는 전도도가 테스트중인 경우 해당 버퍼 개별 추출물을 준비합니다. 여기,이 믹서에 3 × 30 초 또는 과즙 (34)의 식물 재료를 균질화 포함한다. </li><li> 대안으로, 조사중인 프로세스의 대표적인 방법으로 추출물을 준비한다. </li></ol></li><li> 추출 나누어지는하고 버퍼를 추가합니다. <ol><li> 수동으로 철저히은 샘플 입자의 균일 한 분포가 균질 보장하기 위해 전체 과정 동안 추출을 자극. </li><li> 정확하게 경사하여 미리 라벨링 반응 튜브 중에서 추출물 배포각 용기 여기에 20 ㎖. 셀프 서 50 ㎖ 튜브 처리를 단순화하고 20 ml의 샘플에 이상적이다. </li><li> 적당한 피펫을 사용하여 각각의 반응 튜브 고정 최종 부피를 유지하는 데 필요한 각 추출 버퍼의 볼륨. </li></ol></li></ol> 3. 응집 플랜트는 다른 폴리머와 추출 <ol><li> 미상의 랜덤 실행 순서로 표시 순차적으로 샘플, 여기, 0.1-2.0 ml의 응집제 원액 필요한 볼륨을 피펫. 철저히 바로 정확히 20 초 동안 진탕 강렬한 설명서 의한 응집제를 첨가 한 후, 각 샘플을 혼합한다. <ol><li> 필요한 경우, 철저한 혼합을 보장하기 위해 다른 공급 원료의 진동 시간을 조정하지만, 엄격하게 모든 샘플에 대한 일관된 혼합 시간을 보장합니다. 플록의 돌이킬 수없는 혼란을 일으킬 수 있습니다 혼합 연장과 일관성 응집 결과를 왜곡 할 수 흔들어 동안 힘을 적용 명심. </li></ol></li><li> 옵션 둘 이상의 응집제의 동시 적용을 위해 상술 된 절차를 수정한다. <ol><li> 옵션 1 : 두 개 이상의 응집제 여기 PEI와 키토산의 혼합물을 추가하는 대신에 단일 중합체. 에너지 부에 정의 된 응집제 조합을 사용합니다. 교육청 설정 (1.1) 동안 비와 개별 매개 변수로 고분자의 절대 농도를 통합. </li><li> 옵션 2 : 추출물에 두 개 이상의 고분자를 순차적으로 추가합니다. <ol><li> 교육청 설치하는 동안 추가 요소로 개별 폴리머 농도, 자신의 유형 및 추출물에 각 추가 사이의 배양 시간을 사용합니다. </li><li> 또한 단일 중합체의 반복 첨가 응집을 향상시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해이 방법을 사용합니다. 응집제 천천히 첨가 시뮬레이션 단계적 첨가를 사용하여, 예를 들어 네 개의 단계 : 20 ㎖의 부피 4 분에 걸쳐 각각 0.25 mL를 첨가 80g L -1 응집제 재고와 응집제의 첨가를 흉내0.25 mL의 분 -1의 유속. </li><li> 모든 경우에, 여기에서 샘플 볼륨으로 여전히 22 ml의 모든 응집제의 최대 양을 추가하여 설치를위한 새로운 최대 최종 샘플 량을 확인하고, 필요한 경우 볼륨 조정 응집제 원액 및 버퍼의 필요한 부피를 계산. </li></ol></li></ol></li><li> 플록 형성 할 수 있도록, 교육청에서 일반적으로 3-30 분 정의 된 시간에 대한 샘플을 품어. 다른 모든 배양 조건 확인, 예를 들어 온도는 미상에 따라 설정된다. </li><li> 관찰 및 문서 플록 형성. 필요 플록 mm의 침전 고형물의 높이를 측정하여 분당 침전으로서 예로 플록 형성의 진행을 기록한다. 필요한 경우, 이러한 밤새 오랜 기간의 응집을 연장. </li><li> 응집 된 추출물을 필터링합니다. <ol><li> 앞서 제조 된 필터 재료를 사용하여 (230) 해당 후에 응집 추출물 명확히필터 재료를 통해 깨끗한 용기 또는 반응 관에 응집 된 샘플을 경사 분리에 의해 배양 시간. <ol><li> 하지 마십시오 여과 전에 정착 플록을 다시 중단하고 20 ml의 샘플에 대해 3 ~ 4 초에 ~ 300의 속도와 ml의 분 -1 필터에 대응 추출물을 적용합니다. </li><li> 상이한 재료 입자 보존의 관점에서 최종 공정에 비해 벤치 탑 실험에서 사용되는 경우 여과 공정의 성능을 확인, 두 종류의 시료 (11)의 입도 분포를 측정하여 예. </li></ol></li><li> 예 탁도계 탁도 및 / 또는 사용에 필요한 적절한 장치로 입자 크기 분포의 측면에서, 여액을 분석한다. </li><li> 옵션 : 불안정한 플록의 형성 또는 개혁을 조사하기 위해, 예를 들어 12 ~ 24 시간, 연장 배양 시간 후 분석을 반복합니다. </li></ol></li><li> 잠 약관에 샘플을 분석전자 정의 응답 (1.1.3). <ol><li> 여과 액에서 샘플을 채취하고 다른 표적 단백질 또는 가치있는 제품의 농도 예를 들어, 추가 응답 매개 변수를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 옵션 : 프로세스의 질량 균형을 닫 같은 매개 변수에 대한 잔류 물 (주로 고체)을 분석합니다. 특히, 시료 처리되거나 응집제로 처리되지 않은 후 질량 남은 고형물을 비교하여 액체 회수에 응집제의 효과를 정량화. </li></ol></li><li> 데이터 품질을 확인하고 피해자의 소프트웨어로 결과를 전송합니다. <ol><li> 수집 된 응답 데이터 극단적 인 값, 예를 들어 예기치 않게 높은 값을 찾습니다. </li><li> 모든 응답 데이터가 올바르게 해당 실험 조건과 정렬되어 있는지 확인합니다. </li><li> 교육청 소프트웨어로 결과를 전송하고 표준 및 무작위 실행 주문이 혼합되지 않습니다 있는지 확인하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 평가에너지 부 <ol><li> 이전 20 바와 같이 예측 모델을 개발하기 위해 회절 광학 소프트웨어에 내장 된 데이터를 분석 도구를 사용한다. <ol><li> 모델 구축을 촉진하기 위하여 필요한 경우 적절한 데이터 변환 모드를 선택, 여기에 10를 기록합니다. 큰 대 작은 응답 값에 대한 비율보다 큰 (10)는 데이터 변환이 요구 될 수 있음을 나타낸다. 박스 - 콕스 플롯 (35) 예를 들어, 적절한 통계 도구를 사용하여 가장 적합한 변환을 확인합니다. </li><li> (i)가 선택된 미상 (1.2)에 들어가고 (II)의 예 변동 (ANOVA)의 분석에 기초하여 조사중인 시스템에 대한 이전의 지식 암컷 소프트웨어 툴하는 2 차 다항식에 동의 기본 모델을 선택 종종 일차 다항식보다 배양 시간의 관찰 된 효과에 잘 맞는다. </li><li> 의를 취소하여 반복적으로 중요하지 않은 모델의 요소, 예를 들면 P&gt; 0.05, 또는 요소의 상호 작용을 제거reby 모델의 복잡성을 감소시키고 그것의 예측 능력을 증가시킨다. </li><li> R 2, 조정 R 2를 비교하여 모델의 품질을 확인하고 스튜던트 잔차의 정규 확률 플롯과 함께 R 2를 예측 잔차 - 대 - 실행, 예측 된 대 - 실제와 박스 - 콕스 (36)을 나타내는. 모든 R 2 값은 0.2 범위 내에 있어야한다. </li><li> 최종 모델은 부정적인 농도가 예측되지 않습니다 예를 들어 물리학, 열역학의 기본 가정에 동의해야합니다. </li></ol></li><li> 여기에서 조사중인 시스템, 낮은 탁도에 가장 유리한 조건을 예측하는 모델을 사용합니다. <ol><li> 가장 중요한 반응과 선호 상태를 선택, 최소한의 탁도를 예. 내장 된 몇 가지 미상 소프트웨어 패키지 (36)의 기능 바람직 기능 또는 유사한 도구를 극대화하여 이러한 선택을 결합합니다. </li><li> 의도 한 애플리케이션에 따라 오모델 f를 선택 확인은 조건이 가장 유리한 것으로 예측 후속 실험로를 선택 초기 미상의 일부가되지 않은 경우에는 최적의 조건 및 / 또는 예를 들어, 일반적으로 모델의 예측 능력을 확인하기 위해 실행됩니다. </li></ol></li></ol> 5. 모델을 개선하고 예측 능력을 확인 <ol><li> 가장 바람직한 운전 조건에 초기 설계 공간을 좁힐는 0-1,000 혼탁 탁도 단위 (NTU) 범위의 예를 들어 낮은 탁도는 모델 예측 (4.2)을 기반으로. </li><li> 새로운 미상가 유의 적 또는 관련으로 확인 된 경우에만 그 요인을 포함하여,이 범위 내에서 설정 (4.1.2)). 주 : 인자는 프로세스 모델 분석하지만 무관의 관점에서 중요 할 수 있고, 반응에 미치는 영향은 1 %가 다른 요소에 비해 &lt;즉이다. </li><li> 모델 예측의 품질이 requiremen 일치 할 때까지 반복 1-5.2 단계TS, 즉 소프트웨어에 의해 나타낸 바와 같이, 모델의 표준 편차는 의도 된 애플리케이션에 충분하다. 예를 들면 정제에 하나의 응집제를 사용하여 이러한 반복을 위해 필요한 경우 실험 전략을 수정합니다. </li><li> 전송 및 파일럿 규모 또는 최종 생산 규모로 스케일 다운 모델의 결과를 확인합니다. </li></ol>

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F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins.">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li><li>Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Flocculation+of+Lignocellulosic+Hydrolyzates+by+Polymers.">Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers.</a> Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).</li><li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Design and Analysis of Experiments. , (2007).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach:+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study.">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216 (2014).</li><li>Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-down+characterization+of+post-centrifuge+flocculation+processes+for+high-throughput+process+development.">Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development.</a> Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).</li><li>Rathore, A. S., Sofer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , (2012).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+and+Efficient+Cell+Culture+Flocculation+Process+Using+a+Stimulus+Responsive+Polymer+to+Streamline+Antibody+Purification+Processes.">Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).</li><li>Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+selection+as+a+downstream+strategy:+Polyelectrolyte+precipitation+of+beta-glucuronidase+from+plant+extracts.">Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).</li><li>Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+precipitation+versus+anion+exchange+chromatography+in+fractionating+recombinant+beta-glucuronidase+from+transgenic+tobacco+extract.">Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract.</a> J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+polymers+are+more+effective+than+natural+flocculants+for+the+clarification+of+tobacco+leaf+extracts.">Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts.</a> J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).</li><li>Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zeta+potential+as+a+measure+of+polyelectrolyte+flocculation+and+the+effect+of+polymer+dosing+conditions+on+cell+removal+from+fermentation+broth.">Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth.</a> Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).</li><li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco.">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li><li>Wang, S., Liu, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+polymer+flocculants+on+coagulation-microfiltration+of+surface+water.">Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water.</a> Water Res. 47, 4538-4546 (2013).</li><li>Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyelectrolyte+flocculation+of+grain+stillage+for+improved+clarification+and+water+recovery+within+bioethanol+production+facilities.">Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities.</a> Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).</li><li>Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+functional+properties+during+preparation+of+cowpea+protein+concentrate.">Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate.</a> Food Chem. 154, 32-37 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+transient+protein+expression+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+can+optimize+process+time,+yield,+and+downstream+costs.">Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).</li><li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter/5'UTR+combination.">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers.">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, (2000).</li><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methods Simplified. , (2005).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants.">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li><li>Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , (2009).</li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

가장 중요한 점은 입자의 응집을 특징 암컷을 설정할 때 디자인은 원칙적으로 예를 들면 pH가, 폴리머 계 중합체의 농도 (16)의 영향을 예상하거나 가능한 효과 (36, 38)을 검출하고 설명 할 수 있어야한다는 것이다 고려한다. 따라서, 실제의 실험을 시작하기 전에 설계 공간 (FDS)의 비율을 평가하는 것이 중요하다. FDS는 예 250의 혼탁도의 차이를 검출하는 공지의 변동 시...

식물은 널리 과일 주스와 같은 음식 상품을 생산하는 데 사용되지만, 그들은 또한 높은 값 1-3 바이오 제품의 제조를위한 플랫폼으로 개발 될 수있다. 두 경우에서, 다운 스트림 프로세싱 (DSP)는 종종 입자 함유 추출물 -4,5-의 설명 다음에 그러한 잎 나 과일 등의 조직으로부터의 액체의 추출과 함께 시작된다. 의약품의 제조를위한, DSP의 비용이 전체 제조 비용 -6,7-의 80 %를 차지할 수 있고, 이것은 부분적으로는 블레이드 기반 호모 -8,9- 같은 파괴적 방법에 의해 제조 된 추출물의 높은 입자 부담 본 반영 . 필터층의 합리적 선택은 필터의 용량을 증가시키고 비용을 10,11 줄일 수 추출물의 입도 분포를 일치하지만, 개선 당 유지되어야 입자의 수에 의해 정의 된 절대 용량의 한도를 초과 할 수 없다필터 영역의 단위는 설명을 달성했다. 더 적은 입자가 여과 트레인에서 최고의 필터의 표면에 도달하면 천장이 해제 될 수 있고, 분산 입자가 큰 플록 (12)를 형성하도록 응집을 촉진 응집제라고도 중합체와 혼합 된 경우이 달성 될 수있다. 이러한 응집물은 미세하고 고가 깊이 필터 도달 입자의 부담을 줄이고, 거친 저렴 백 필터에 의해 상기 상류 유지 될 수있다. 중합체는 좋은 제조 관행 (GMP)을 준수해야합니다 바이오 의약품에 대한 예 애플리케이션에 적합한 안전성 프로파일이 있어야하며 일반적으로 그들은 몰 질량&gt; 100 kDa의가 있어야하며 중립적 또는 (13)를 충전 할 수 있습니다. 중성 응집제는 일반적으로 그 직경 응집 플록의 형성을 일으키는 분산 입자를 가교 결합하여 작용하는 반면 1mm 11 하전 중합체 (D)의 전하를 중화&gt;ispersed 입자는 용해도를 감소시키고 따라서 침전 14하게한다. 응집은 추출물 15, 16의 특성과 일치하도록, 예컨대 완충액 pH 또는 전도도, 중합체 종류 나 농도 등의 파라미터를 조정함으로써 개선 될 수있다. 담배 0.5 내지 5.0 g의 L -1 폴리에틸렌 이민 (PEI)으로 전처리 추출물 깊이 필터 용량에서보다 2 배 증가 100 L 파일롯 스케일 공정에서보고되었다. 이 폴리머의 비용 미만 € 10kg 그렇게하는 과정에 도입 일괄 16 당 필터 및 소모품에 대한 € 6,000 비용 절감의 결과 또는 더 많은 경우 셀룰로오스 기반의 필터 보조기구 (17)와 결합 -1이다. 그럼에도 불구하고, 예측 모델은 포함이 15 ~ 30 분 (16, 18)의 유지 단계가 필요할 수 있기 때문에 저장을위한 추가 투자 비용의 결과로, 응집제의 사전 경제적 이익을 평가하는 데 필요한탱크. 그러나, 응집의 복잡한 특성으로 이러한 실험의 결과를 예측할 수있는 가능한 기계적인 모델은 현재 존재하지 않는다. 이 문서에 설명 된대로 따라서,보다 적절한 디자인의-실험 (미상) 접근 (19)는 개발되었다. 일반 교육청 절차에 대한 프로토콜은 최근 20 게시되었습니다. 소규모 장치 해주기 응집 조건 (21)의 고 처리량 스크리닝 할 수있다. 반응 용기 (~ 96 웰 플레이트에 웰 7 ㎜) 및 입자 또는 플록의 크기는 간격 크기 순서보다 작을 수 있기 때문에,이 장치가 현실적으로 식물의 응집 동안 조건을 시뮬레이션 할 수는 추출한다. 이 때문에 패턴과 모델의 예측 능력을 혼합에 영향을 줄 수 있습니다. 또한,이 때문에 혼합 침전물 행동 역 비선형 변화 침전 관련된 프로세스를 확장 어렵다부 합성 (22). 따라서이 문서는 100 L 파일럿 규모의 공정 (16)에 초기 20 ㎖ 반응 볼륨에서 확장 성 결과를 산출, 하루에 50-75 샘플의 처리량 벤치 탑 규모의 스크리닝 시스템을 설명합니다. 암컷의 접근 방식과 함께 사용하면이 예측 모델은 품질별로 디자인 개념의 일환으로 공정 최적화 및 문서에 사용 할 수 있습니다. 아래 설명 된 방법은 또한 응집제 또한 비용 절감 수단 (23)으로 간주되는 세포 배양 기반 프로세스, 의약품 제조에 적용 할 수있다. 카놀라유, 옥수수 및 대두 (24, 25)에서 생산 된 β 글루 쿠로니다 아제에 대한 입증 된 바와 같이 또한, 정제 전략의 일환으로 조 추출물로부터 표적 단백질의 침전을 모델링하는데 사용될 수있다. 응집제 군데의 상세한 설명은 다른 16,26 발견 될 수 있으며 확인하는 것이 중요하다 중합체 CONCENTR관리 포인트는 비 독성 또는 최종 제품 (11)에 유해한 수준 이하 중 하나입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td style="width:195px;">Hach</td>
			<td style="width:119px;">4650000</td>
			<td style="width:272px;">Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2G12 antibody</td>
			<td style="width:195px;">Polymun</td>
			<td style="width:119px;">AB002</td>
			<td>Reference antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">BP-410</td>
			<td style="width:195px;">Furh</td>
			<td style="width:119px;">2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Catiofast VSH</td>
			<td style="width:195px;">BASF</td>
			<td style="width:119px;">79002360</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">2017106</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Chitosan</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">5375.1</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">K700P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">KS50P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Miracloth</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">475855-1R</td>
			<td>Filter cloth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">MultiLine Multi 3410 IDS</td>
			<td style="width:195px;">WTW</td>
			<td style="width:119px;">WTW_2020</td>
			<td>pH meter / conductivity meter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Polymin P</td>
			<td style="width:195px;">BASF</td>
			<td style="width:119px;">79002360</td>
			<td>Flocculating agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">POLYTRON PT 6100 D</td>
			<td style="width:195px;">Kinematica</td>
			<td style="width:119px;">11010110</td>
			<td>Homogenization device with custom blade tool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Protein A</td>
			<td style="width:195px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10-1006</td>
			<td>Antibody binding protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">TRIS</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">4855.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Tween-20</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9127.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">VelaPad 60</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
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			<td>DLS particle size distribution measurement</td>
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procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

다른 중합체와 담배 추출액 응집 상기 방법은 성공적으로 모노클로 날 항체 (에이즈 중화 항체 2G12)와 형광 단백질 (을 DsRed) (도 1) (16)의 제조시 담배 추출물 응집하는 방법을 개발하는 데 사용하고, 이후 전사 된 렉틴, 말라리아 백신 후보와 융합 단백질 (게시되지 않은 데이터)를 포함하는 다른 단백질. ?...

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Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

절차 식물 추출물에서 분산 된 입자의 제거를위한 응집제의 효율성을 평가하는

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.8K 조회수.  Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.. The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

비디오: Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

씹는 곤충에 A.의 thaliana의 저항을 테스트하기 위해 선택과 노 - 선택 Assays

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

연구

생물학

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Microinjection을 사용 Aphids에 바이러스성 전송 생리 장벽을 테스트

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Murine 신장 이식 절차

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...