We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. 플라스미드 건설 <ol><li> 이전 1,6 설명 된대로 기술을 복제하여 구조를 생성합니다. <ol><li> 제 BASL의 ​​코딩 서열을 증폭하기 위하여 적절한 프라이머 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하고 YDA MPK6와 입력 벡터에 그들을 서브 클론. 7 상세한 프로토콜을 찾을 수 있습니다. </li><li> (각각 DNmpk6 8 DNyda 4) MPK6 및 YDA 지배적 음수 버전을 생성하기 위해 주형으로 MPK6 및 YDA의 엔트리 플라스미드를 사용하여 부위 특이 적 변이 법 9 점 돌연변이를 도입. </li></ol></li><li> pH35CG (10)에 BASL를 통합하는 표준 LR (attL X의 ATTR 재조합) 반응 (7 자세한 절차)를 실시, 담배 과도 분석을위한 구조를 구축하기 위해, DNyda 및 pXNGW에 DNmpk6 및 pXCGW은 각각 11 벡터. <ol><li> 효소 분해 및 시퀀싱에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. 일단이야uccessful, 아그로 박테 리움이 변형 GV3101 12 투메 파시 엔스로 진 구조를 변화시키고이 28 ° C에서 선택 접시에 그들을 성장 - 삼일. </li></ol></li></ol> 아그로 박테 리움 침투 솔루션의 2. 준비 <ol><li> 구축 pH35CG, pXNGW 및 pXCGW 100 ㎍ / ㎖의 루리아 - 베르 타니 (LB) 적절한 항생제 배지 10 ml의 몇 가지의 갓 변환 아그로 박테 리움의 식민지를 접종 (겐타 마이신 25 ㎍ / ml의 리파 마이신 25 ㎍ / ml의 스펙 티노 마이신, 같은 농도 P19에 대한 카나마이신 50 μg의 / ㎖와 겐타 마이신과 리파 마이신 (유전자 침묵에 대한 단백질을 표현) 13. </li><li> 약 16 시간 동안 200 rpm으로의 속도로 28 °의 C 통에 아그로 박테 리움 문화를 성장 후 (1.5 도달 할 것으로 추정 - 1.8)을 OD (600) 측정 (그림 2A-B)를. 10 분 동안 2,500 XG에 문화를 스핀 다운. 다시 중단하고 워싱턴의 MgCl 2 10 밀리미터 (침투 솔루션)와 세포 펠렛을 쉬. </li><li> 다시 배양을 스핀 다운하고, 최종 OD = 0.5 (600) (도 2C-D)에 도달하는 침투 용액의 적당량 펠릿을 다시 일시. 3 시간 - 식물에 침투하기 전에 1 시간 동안 실온에서 세포 혼합물을 떠난다. 이 단계는 세포의 항상성을 유지하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 3. 담배 공장 및 리프 주입 <ol><li> 잎 주입 (16 시간 조명 / 8 시간 - 어둠의 사이클 23 ° C) 표준 식물 성장 챔버 5 주령 14-4 성장 담배 식물 (담배 속의 benthamiana)를 사용합니다. 참고 :이 단계에서 담배 식물은 일반적으로 6 잎 (2 대 2, 중, 2 작은)가 있습니다. 두 개의 중간 크기의 잎은 잎 주입합니다 (두 개의 작은 사람들은 종종 너무 젊은있는 동안 두 개의 큰 것들, 너무 오래)에 대한 최적이다. </li><li> 침투 하루 전에 tobac 물을공동 식물은 토양을 포화합니다. </li><li> 3 시간 - 침투 날, 1 어둠 속에서 식물을 사전 품어. 이 단계는 잎 표피 세포 내로 관통 할 때 크게 아그로을 용이하게 표피에 기공이 넓게 열 수있다. </li><li> , 잎을 날짜로 표시된 색 테이프를 플래그를 사용하는 것은 침투합니다. 마크 영역은 검은 색 두꺼운 샤피 침투한다 (선택하며 침투 지역은 감염 후 볼 수 있습니다.). </li><li> 아그로 박테 리움 재 현탁액의 동일한 볼륨을 가지고 부드러운 소용돌이 (그림 2E)에 의해 100 × 15mm 페트리 접시에서 그들을 섞는다. 주 : 우리의 경우에는 CFP-BASL 1 ㎖, 1-DNyda nYFP ml의 DNmpk-cYFP 1 ㎖와 P19 1 ㎖를 혼합 하였다. </li><li> 침투하는 과정에서, 침투 혼합물은 3 ㎖의 무 바늘 주사기를 충전 (1-2 ㎖) 및 담배 잎 (도 2F)의 바닥면 (축외)로 누른다. 침투 있지만, 그것은 도움이됩니다푸시 한 손을 사용하고, 다른 한편으로 부드럽게 (가압력 대해 향축) 상부 측을 지원한다. 주 : 침투 혼합물을 성공적으로 주입되면, 감염된 지역 표피에서 쉽게 인식 될 것이다. 그러나, 침투로 인해 거친 주입 (조직 손상) 또는 불충분 한 푸시 (액체가 침투)에 실패 할 수 있습니다. 각 테스트를 위해, 우리는 (다른 식물에서) 두 개의 독립적 인 잎에 두 개 이상의 주사를 제안한다. </li><li> 다시 성장 챔버에 감염된 식물을 배치합니다. 일반적으로 단백질 표현은 48 시간 다음 침투 후 검출된다. </li></ol> 4. 공 촛점 이미징 <ol><li> (- 4 디스크 / 영역이 생성 될 수 일반적으로 3) (그림 2G) 48 시간 포스트 침투에서 주입 된 지역에서 잎 디스크를 절제하는 홀 펀칭기를 사용합니다. 부드럽게 물 방울을 슬라이드 (위쪽 배축 측)에 잎 디스크를 전송하고 마운트 핀셋을 사용합니다. 너무하겠다 눌러 피커버 슬립에 d를 압착 / 손상된 세포는 공 초점 현미경 (그림 2H)에서 잘 표시되지 않습니다 때문이다. </li><li> 촛점 촬상 전에, 발현 수준을 확인하기 위해 에피 형광 화합물 현미경에 장착 된 시료를 검사한다. 참고 : 우리의 경험에 기초하여, 중간 발현 표시 셀 가장 공 초점 현미경으로 표현된다. </li><li> 공 초점 현미경에 40X (NA 1.3) 렌즈로 시작합니다. 형광 단백질의 중간 레벨을 발현하는 세포를 중심으로 유지되도록 슬라이드를 원하는 위치로 조정한다. CFP와 YFP의 여기 / 발광 스펙트럼은 458 nm의 /이다 480-500 nm의 514 나노 미터 / 520 - 각각 540 nm의,. </li><li> 이미지가 다음 가장 균형 잡힌 형광 강도 / 노이즈 비율에 대한 레이저 강도 및 스마트 게인을 조정 미리 볼 수있는 &quot;라이브&quot;버튼을 활성화합니다. 이미징 품질을 향상 주사 픽셀 및 / 또는 프레임 / 라인 평균 증가한다. 마지막으로, 정말이에요에 초점 노브를 조정채널 중간 초점면과 이미지를 데리고 &quot;캡처&quot;를 클릭합니다. 참고 : CFP와 YFP 이미지 또는 각각 &quot;순차적&quot;스캔 모드의 옵션을 해제 확인하여 순차적으로 또는 동시에 캡처 할 수 있습니다. </li><li> Z-돌기 세포의 심층보기를 원할 때, 주사 범위의 깊이를 정의하고, &quot;XYZ&quot;촬상 모드를 선택 (10-15 μm의)과 타겟 셀의 상단과 하단까지의 이미지를 수집 할 . 선택 .TIFF 파일로 &quot;이름 바꾸기&quot;수출 이미지에 이미지 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 라이카 소프트웨어를 사용하여 얻은 이미지를 컴파일합니다. </li><li> 이미지 30 - 정량 분석​​을위한 40 세포. </li></ol> 5. 이미지 처리 및 정량 분석 <ol><li> 이미지를 처리​​하고 정량을 실시 피지 소프트웨어 (http://fiji.sc/Fiji)를 사용합니다. <ol><li> 형광 강도의 그래프를 플롯. <ol><li> 더 CFP / YFP 표현인지 여부를 시각화하는 방법균일 분포, 셀 주변을 따라 CFP 및 YFP의 신호 강도를 보여 피지를 사용한다. 이를 위해 먼저 피지는 다음 이미지를 시작하려면 &quot;파일&quot;및 &quot;열기&quot;를 선택하여 실행합니다. 도구 메뉴에서 &quot;라인&quot;을 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 해 &quot;분단 라인&quot;을 선택합니다. 관심 영역을 결정하고, CFP 또는 YFP 신호 (그림 3A-C)를 추적하는 셀 주변을 따라 선을 그립니다. 주 : 피지가 분할 선을 따라 절대 형광 강도 값을 측정한다. </li><li> 분할 선을 따라 CFP / YFP의 수준을 나타내는 위치와 강도 값으로 그래프를 생성하는 드롭 다운 메뉴 &quot;분석&quot;과 &quot;플롯 프로필&quot;을 선택합니다. 원하는 경우, 유사한 강도 그래프를 생성하는 엑셀이나 다른 그래픽 소프트웨어에 (메뉴 &quot;복사&quot;를 선택하여) 강도 값을 중복. </li></ol></li><li> 극성의 정도를 정량화. <ol><li> 약 20 represen를 수집3 복제 실험에서 tative 세포는 담배 세포에서 CFP와 YFP의 극성의 정도를 평가합니다. (L로서 정의) 낮은 형광 강도 이상 (H로 정의)이 높은 형광 강도의 비에 기초하여 극성도를 계산한다. 주 : 정량 방법은도 3에 설명한다. <ol><li> 가 H와 L 값을 측정하기 위해, &quot;측정&quot;을 드롭 다운 메뉴에서 &quot;분석&quot;을 선택한 후, 선택, 클릭 (전술) 셀 주변의 관심 영역에 따라 분할 선을 그립니다. 는 &quot;결과&quot;창이 뜨면, 사용 정량을 수행하기 위해 값을 &quot;평균&quot;. </li><li> 예를 들어, CFP와 YFP의 비교적 균일 한 표현을 표시하는 세포에서, CFP-BASL (그림 3A) 또는 YFP는 측정하여 H와 L의 값을 구 DNyda-nYFP 및 DNmpk6-cYFP (그림 3B)의 공동 발현에서 보완 이 무작위로 동일한 길이로 주변 세그먼트를 선택했습니다. </li> &lt;리&gt;이 경우, 형광 단백질의 명확한 극성 축적을 나타내는 세포로부터, CFP-BASL, DNyda-nYFP 및 DNmpk6-cYFP (도 3c)의 공동 발현은 농축 된 형광 신호와 상기 주변 영역에서 H 값을 수집 저 / 아니오 형광 축적 지역에서 LS. </li><li> 정규 분포에 대한 (20) 함께 세포 시험에서 H / L의 결과 비율 수영장. (정규 분포의 경우) 학생 t 테스트에 의해 P 값 또는 (비 정규 분포의 경우) 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 (KS) 테스트를 계산합니다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

일반 사용 및 신호 전달에 대한 담배 과도 식 시스템의 가능한 수정 : 형광 단백질의 과발현 (FP)는 성공적으로 식물 세포에서 단백질의 세포 내 지역화의 빠른 검사를 위해 사용 된 담배 표피에있는 단백질을 -tagged. 그러나, 란타 단백질 복합체의 동적 시그널링 분포를 연구하기 때문에 복잡한 세포 내 컨텍스트 과도 단백질 - 단백질 상호 작용 및 신호 전달 사건 어려운 주제이?...

단백질은 예측할 수없는 셀룰러 환경에서 발생하는 거의 모든 생물학적 과정에서 중추적 인 역할을 복잡한 계층 적 네트워크와 양식 단지 내에서 상호 작용한다. 그러나 성장 반응에 공장 개발에서, 단지 신속뿐만 아니라 효율적으로 세포 내 수준에서 이러한 동적 신호 이벤트를 식별하고 모니터링 할 수 없습니다 편리한 도구의 부족이 있었다. 담배 잎 표피에 과도 단백질 발현 시스템은 살아있는 세포에 형광 단백질을 시각화 장점을 호소하고있다. 이 시스템은 번역 후 단백질 수정 및 단백질 지역화의 빠른 검사를 수 반 생체 조건을 제공합니다. 보완적인 YFP 신호를 조사함으로써, 이분자 형광 상보성 (BiFC) 분석은 식물 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 가능성을 알린다. 다른 방법, 예를 들어, 효모 두 하이브리드 (Y2H)와 공동 비교-immunoprecipitation은 (주-IP), BiFC는 단백질 - 단백질 상호 작용이 세포 내 수준에서 발생할 수있는 구획을 시각화하는 강력한 수단을 제공한다. 비대칭 세포 분열 (ACD)는 조직 / 기관의 형성을위한 새로운 유형의 세포를 생성하는 동안 세포 집단 줄기 유지 때문에 진핵 다세포 촉진하는 필수 불가결 한 장치이다. 애기 기공 발전 플랜트에서 ACD 연구를위한 모델 시스템으로 사용되고있다. 전구체 세포 meristemoid 머더 셀은 비대칭 나누고로 분화 할 수있다 (그리고 기공 계통 접지 셀 (SLGC) (가드 셀의 쌍으로 종료하기 전에 셀 형상 분열 줄기 겪게)와, meristemoid 두 가지 딸세포를 생산 제산 포장 셀), 각각 (그림 1). 기공 ACD에서, 기공 리니지에서 비대칭의 신규 단백질 속보 (BASL은)의 inc하는 분할 비대칭를 구동하기 위해 premitotically 편광lude 물리적 비대칭 세포 운명 비대칭 1. MAPKKK 요다와 MAPKs, MPK3 6로 구성된 MAPK 캐스케이드는 기공 분할 패턴과 운명 채택 2, 3, 4, 5에 대한 핵심이다. 최근 장 등. ACD 6 기공 애기 장대에서 YDA-MAPK 신호 전달 경로에 극성 단백질 BASL를 연결. 정규 요다-MAPK 경로는 MPK3 / 6를 통해, BASL을 인산화 및 편광을 활성화합니다. 인산화 BASL 발판으로 기능과 요다 (YDA) 및 MPK3 / 6 모집은 단백질 복합체를 형성하고 세포 피질 (6)의 신호를 집중합니다. MAPK 구성 요소 및 BASL과 YDA-MAPK 경로 사이의 긍정적 인 피드백 루프의 양극화는 식물 세포에서 단백질 편광위한 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 로컬 풍부한 MAPK 신호 밀접 기공 ACD 6 셀 운명의 분화 (그림 1) 연결되도록 가설된다. k 개의 중 하나이 모델을 지원 EY 실험 데이터는 BASL 6의 발현에 의해 유도 MAPKs의 공간 재배포을 보여 담배 분석에서왔다. MAPK 분자는 종종 셀 내부의 도처 발견 되었기 때문에 MAPK 신호가 발생하는 위치를 일반적으로, 모니터링하는 것은 용이하지 않다. 본 연구에서 우리는 신호 중계 발생 여기서 제안하는 상류와 하류 키나제들 사이의 상호 작용을 시각적으로 분할 YFP 시스템을 이용했다. 우리는 추가로 BiFC 시스템의 사용을 확장 공동 발현 (단백질 - 단백질 상호 작용을 암시) 스플릿 YFP 쌍이 제 단백질 (CFP는 태깅)를 갖추고 YFP 공간적 코에 의해 변조 될 수 있는지 여부를 어떻게 시각화 CFP 단백질을 표현했다. 그렇게함으로써 우리는 담배 epiderm의 셀 피질에서 편광 패턴에 균일하게 분포에서 YDA과 MPK6, 사이의 상호 작용의 공간 재구성을 유도 CFP-BASL의 ​​공동 발현을 보여 주었다알 세포. 이 시스템은 따라서 세포 내부 또는 외부 자극에 의해 도전시 조건 하에서 식물 세포의 동적 시그널링 이벤트를 모니터링하기 위해 개발 될 가능성이있다 (예를 들면, 다른 단백질, 화학적 응용 병원체 공격 또는 환경 변화 등의 공동 발현. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

살아있는 세포의 동적 신호 이벤트의 시각화 도전하고있다. 우리는 식물 세포 내에서 신호 전달의 공간 분포를 모니터링하기위한 시험 단백질 - 단백질 상호 작용에서 설정된 일시적 발현 시스템 담배 표피 세포에 생체 분자 형광 상보성 (BiFC) 분석을 확대. 이러한 프로토콜에서는, 상호 작용 및 애기 MAPKKK 요다와 MAPK6 간의 시그널링은 세포막에서 발생한다는 표시하도록 BiFC 분석을 사용 하였다. 골격 단백질 BASL이 공동 발현되면 요다-MAPK 상호 작용 공간적 재분배 CFP-BASL와 공동 편광. 이 변형 담배 발현 시스템은 자국어 동적 변경 (이하 4 일) 및 형광 단백질 색 (적어도 3 개)의 복수를 수용 할 수있는 신호의 신속한 시험을 허용한다. 우리는 또한 단백질 분포 (비대칭 공간 지역화, 또는 &quot;양극화&quot;를 정량화하는 자세한 방법을 제시) 담배 세포입니다. 이 고급 담배 발현 시스템은 살아있는 식물 세포의 동적 시그널링 이벤트 퀵 테스트 널리 사용될 가능성을 가지고있다.

과민 MAPK 신호에 의해 유도되는 세포 사멸을 방지하기 YDA (DNyda) 및 MPK6 (DNmpk6)의 키나아제 비활성 버전 담배 세포에서 공동 발현 분석에 사용 하였다. 어느 BiFC도 CFP-BASL 자체 생성 된 불균일 한 분포 패턴 (그림 3A-B)에 의해 밝혀 DNyda과 DNmpk6 사이의 상호 작용. CFP-BASL가 DNyda-DNmpk6 상호 쌍에 도입 하였다 그러나, CFP와 YFP 신호 모두 높은 편광 방식 (도 3C)에</st...

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K 조회수.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

비디오: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.