돼지 난모세포의 캡슐화를 위한 이 프로토콜은 COC의 구형 조직을 유지할 수 있게 합니다. 이것은 난모세포와 주변 여포 세포 사이 간격 접합의 그들의 평평하고 그 결과로 중단을 방지합니다. 두 설명 된 프로토콜의 주요 장점은 사용자 친화적이며 oocyte 및 화학 세포 생존모두의 효과적인 제어를 허용하는 것입니다.
두 배양 시스템은 생식 생물학의 기본 연구를 위한 귀중한 도구이며, 향상된 불임 처리를 위한 임상 관련성이 있을 수 있습니다. 또한 새로운 생명 공학 방법 개발 및 가축 개선을 위해 신청할 수 있습니다. 난소를 헹구고 HM 매체로 채워진 비커로 옮기고 후속 조작 중에 섭씨 38도의 인큐베이터에 보관하십시오.
큰 돼지 여포에서 여포 액을 흡습하고 원심분리기는 실온에서 10 분 동안 100 배 G로 흡입합니다. 이어서, 0.2마이크로미터 멤브레인 모공 필터에 부착된 멸균 주사기를 사용하여 상체를 걸러내고, 음의 80°C로 동결한다. 중형 여포에서 COC를 분리하려면 2~3개의 난소를 HM으로 채워진 멸균 10센티미터 페트리 접시로 옮기습니다. 돌출난소 여포의 표면을 멸균 수술 번호 15 블레이드로 부드럽게 잘라 여포 액과 COC가 페트리 접시로 흘러 나갑니다.
일회용 주사기에 부착된 28 게이지 바늘로 여포 내용을 흡인하고 다른 페트리 접시로 옮킨다. IVF 페트리 요리를 준비하려면 중앙 우물에 HM 1 밀리리터를 추가하고 외부 고리에 3~4방울의 HM을 배치합니다. 그런 다음 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하여 손상되지 않은 COC를 외부 고리에 HM을 떨어 뜨리고 3~4회 간단히 헹구는 다.
완료되면 개별적으로 중앙 우물로 옮기. 인큐베이터에 IVF 플레이트를 저장합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 혈소판 및 피브리노겐 솔루션을 준비합니다.
시술 당일, 얼음에 피브리노겐 용액을 천천히 해동하고 사용하기 직전에 실온으로 가져옵니다. 0.5% 알자네이트 용액과 피브리노겐 용액을 1 대 1 비율로 혼합하여 최종 부피 2 밀리리터를 원량화하고 혼합물을 부드럽게 소용돌이시다. 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 필름의 얇은 스트립을 적용하여 배양 챔버를 복구합니다.
파이펫 7.5 마이크로리터 는 분리 스페이서와 파라핀 필름 코팅 유리 슬라이드에 FA 혼합물의 7.5 마이크로 리터 방울, 두 행에 배치 8 ~ 10 방울을 배치. 마이크로파이프를 사용하여 3~5개의 COC를 FA 드롭의 중심으로 전송하고 최소 용량의 성숙 배지를 사용합니다. 각 FA 드롭 위에 7.5 마이크로리터의 혈소판을 추가하여 커버합니다.
젤이 거의 즉각적으로 형성되기 때문에 혼합 할 필요가 없습니다. 이전에 준비된 유리 슬라이드로 인큐베이션 챔버를 덮은 다음 챔버를 거꾸로 뒤집어 촉촉한 필터 종이가 늘어선 100mm 페트리 접시에 놓습니다. 페트리 접시를 5~7분 동안 섭씨 38도의 이산화탄소5%에 넣습니다.
인큐베이션 후 각 FA 캡슐을 성숙 배지 100마이크로리터를 함유한 96웰 플레이트의 우물로 옮기다. 매 2일마다 매체의 절반을 신선한 미리 평형된 성숙 매체로 교체하십시오. 이미지 COC는 10배배율로 반전된 광 현미경을 사용하고 있다.
4일 동안 COC를 배양한 후, 우물에서 성숙 배지를 제거하고 DMEM에서 밀리리터 대지 용해물당 10개의 국제 유닛 100마이크로리터를 추가합니다. 배양판을 인큐베이터에 25~30분 간 둡니다. 용존 된 캡슐에서 COC를 제거합니다.
DMEM에서 여러 번 세척한 다음 PBS가 함유된 IVF 접시의 내부 링으로 옮겨 넣습니다. 30mm 페트리 접시에 FEP 파우더 5그램을 신는다. FEP 분말에 3~5개의 COC를 함유한 성숙 배지의 단일 액자를 분배한다.
입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 액체 대리석을 형성하도록 원형 동작으로 부드럽게 회전하거나 LM. 60mm IVF 페트리 접시를 몇 개 준비하고, 외부 고리에 멸균 물의 3 ~4 밀리리터를 추가하여 습도 챔버를 만듭니다. 1000 마이크로리터 파이펫으로 형성된 LM을 집어 중앙 우물에 놓습니다.
5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 38도에서 4일간 구슬을 배양합니다. 매체를 변경하려면 각 LM에 성숙 배지 30 마이크로리터를 적용하여 확산됩니다. 대리석 내용이 녹으면 바이오 반응기에서 방출된 COC를 페트리 접시에 신선한 성숙 매체 한 방울로 옮기습니다.
성숙 배지에서 3~4개의 세차후, COC를 신선한 배지 30마이크로리터와 함께 FEP 파우더 침대에 옮겨 보세요. 분말 입자가 액체 낙하의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전시키고 LM을 IVF 페트리 접시로 옮킵니다. 두 시험관 성숙 시스템은 서로 단단히 부착된 과립세포와 적혈구의 손상되지 않은 층을 가진 COC를 생산하였다.
COC 생존 가능성 분석은 두 캡슐화 시스템에서 최적의 성장 조건을 달성했다는 것을 확인했습니다. 두 그룹 모두에서 높은 생존성 난모세포 사이트만 관찰되었습니다. 난모세포는 전염 전자 현미경으로 이미지되었다.
미토콘드리아는 고르게 분포되어 껍질 모양이 있었다. 그들 중 극소수만이 길었고, 그들의 군집은 산발적으로 관찰되었다. 내피 성 망상은 미토콘드리아와 연관되었거나 난소 세포질에서 무료였습니다.
액체 방울은 작고 어둡고 둥근 구조물로 나타났으며 골기 장치는 팽창 된 시스테네로 나타났습니다. 배양실에서 배양판으로 FA 캡슐을 옮길 때와 형식 LM을 집어 들고 IVF 페트리 접시로 옮길 때 정확하고 주의해야 합니다.
