이 연구는 교육 과학 기술부 (NRF-2013R1A1A2012159 및 NRF-2013R1A1A2007561), 건국 대학교의 교육부에 의해 투자 한국 연구 재단 (NRF)과 화학 공학 및 MCubed의 부서를 통해 기초 과학 연구 프로그램에 의해 지원되었다 미시간 대학의 프로그램.

1. 전체 세포 생체 촉매의 제조 참고 : 재조합 E. pET28a- SpNox 31 pET28a- HjLAD 28 대장균 형질 세포 이하 E.라고도 대장균 SpNox 및 E. 대장균 HjLAD, 각각. <ol><li> E.의 단일 식민지의 예방 37 O C, 250 rpm에서 대장균 루리아 - 베르 타니 (LB) 카나마이신 (50 μg의 / ml)로 보충 매체의 3 ㎖에 HjLAD 및 보육 통 O에 품어 / N. </li><li> 1 문화를 희석 : / ㎖ 카나마이신 50 μg의 37 O를 C 부화 포함 신선한 LB의 200ml에 100, 250 rpm으로 외경까지 600 ~ 0.6에 도달한다. </li><li> 배양액에 0.1 mM의 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고 16 O C, 16 시간 동안 180 rpm으로 배양한다. <ol><li> 또한, 25 O C, 200 RP에서 유도을 수행만약 L 생합성 크실 로스 6 HR (하기 단계 2)를위한 m 당일 행한다. </li></ol></li><li> 유도 E. 수확 4 오 ℃에서 20 분 동안 3,200 XG에 원심 분리하여 대장균 HjLAD 세포 뜨는을 취소하고 세포 펠렛을 처리하기 위해 2 단계로 진행합니다. </li><li> E. 1.4 - 병렬로 수행은 1.1 단계 대장균 SpNox. </li></ol> 2. 생합성 커플 링 E.에 의해 L 크실 로스 대장균 HjLAD 및 E. 공동 인자의 재생에 대한 대장균 SpNox <ol><li> E.의 세포 펠렛을 재현 탁 대장균 HjLAD 및 E. 콜라이 SpNox 별도로 5.0 g 건조 세포 무게 (gDCW) / L의 세포 밀도로 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)이다. 참고 gDCW 600 나노 미터 (OD 600)에서 측정 된 광학 밀도 사이의 상관 관계는, 실험을 용이하게 확립 할 수있다. 에 사용되는 수식이 프로토콜은 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 - 다른 분석기에 따라 다를 수 있습니다 0.0965. </li><li> 5.0 gDCW / L E. 600 μl를 혼합 대장균 HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox, 14 mL의 20 mM의 NAD + 100 ㎕, 2 M의 L-아라 비니 150 μL 둥근 바닥 튜브 및 50 mM 트리스 - 염산 550 μL를 첨가하여이 용액에 반응 부피를 가지고 (PH 8.0) . 주 : 두 전체 세포 생 촉매의 양의 비는 제품의 생합성을 향상시키기 위해 최적화 될 수있다. 서술 된 시스템, E.의 비로 대장균 SpNox : E. 대장균 HjLAD 1 = 1이 L 크실 로스 생합성 (그림 1B)를위한 최적의 것으로 밝혀졌다. </li><li> 30의 C O 8 시간 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 4 O C에서 원심 분리 한 후 상등액을 수집 3,200 XG에 10 분 A에 대한차 아래 3 단계에 설명 된대로 L 크실 로스 생산을 정량화로 진행합니다. </li></ol> L 크실 로스 정량 3. 비색 분석 <ol><li> 기음 1.5 ML 튜브로 단계 2.4에서 수집 반응 상층 액 100 ㎕. </li><li> 1.5 % 시스테인 50 μL, 70 % 황산을 900 ㎕의 에탄올에 용해 된 0.1 % 카바 졸 50 μl를 첨가하고, 튜브를 3 회 반전시켜 부드럽게 혼합한다. </li><li> 입출력 37 C, 20 분 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 560 나노 미터 (560)에서 반응 혼합물의 흡광도를 측정한다. <ol><li> 560는 A 기록이 1 이상이면, 반응 액을 희석한다. </li></ol></li></ol> 칼슘 알긴산 비즈에서 재조합 전체 셀 촉매의 고정화 (4) <ol><li> 100 ml의 증류수에 4g의 알긴산 나트륨을 녹인다. 의를 추가하여 알긴산 용액을 제조물에 대한 비난의 알긴산은 덩어리의 형성을 방지 할 수 있습니다. 필요한 경우 혼합물을 가열한다. </li><li> 5.0 gDCW / L E.의 600 μl를 추가 대장균 HjLAD 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 SpNox 1.2 ml의 4 %의 알긴산 단계 4.1 제조 및 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 알긴산 섞는다. </li><li> 연속 교반하면서 100 ㎖ 비이커에 (염화칼슘 2) 솔루션을 바늘을 이용하여 주사기에 알지네이트 / 세포 현탁액을 대기음 및 0.3 M 염화 칼슘에 적가 혼합물을 추가합니다. 주 : 알긴산 물방울이 완전히 잠길 수 있도록 알긴산 비드 형성을 위해 사용 CaCl2를 용액의 부피가 충분해야한다. 또한, 주사​​기 바늘과 염화칼슘 수용액의 표면 사이의 거리를 균일하게 구상 비드의 형성을 보장하기 위해 최적의 범위로 유지되어야한다. 거리의 최적 범위는 실험을 결정할 수있다아군과 바늘의 내부 직경에 따라 다르다. 예상 된 바와 같이, ~ 15 ± 5 cm의 거리가 0.6 cm (내경) 주사기 바늘에 대해 최적 인 것으로 밝혀졌다. </li><li> 가교 겔 비드를 형성 할 수 있도록 교반없이 실온에서 3 시간 - 2에 대한 염화칼슘 2 용액에 구슬을 둡니다. </li><li> 조심스럽게 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액을 부어 구슬을 방해하지 않고 CaCl2를 용액을 경사 분리하고, 또 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 CaCl2를 용액에 남아있는 비드 옮긴다. </li><li> CaCl2를 과도 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해 50 mM Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎖로 3 회 비드 버퍼 씻는다. 노트: 주어진 단계에서 그들을 파열 것이다 이렇게 같은 구슬을 원심 분리하지 않습니다. 5 분 - 솔루션에서 구슬을 분리하기 위해, 현탁액 3 그대로 방치한다. 비드 바닥에 침전되고 세척 완충액 경사 분리 될 수있다다른 용기에. <ol><li> 사용 된 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 단계 4.5에서 수집 CaCl2를 사용한 용액과 사용하는 트리스 -HCl의 세척 완충액 (30 ㎖)을 풀. </li></ol></li><li> 미 고정 E. 펠렛 풀링 된 CaCl2를 트리스 - 염산 용액을 원심 분리하여 대장균 세포는 20 분 동안 3200 × g으로 46 단계에서 수집. 단계 2.1에 기재된 바와 같이 고정화 효율을 결정하기 gDCW / L의 펠릿 캡슐화되지 않은 세포의 밀도를 계산한다. </li><li> 튜브로 단계 4.6에서 세척 구슬을 전송합니다. 단계 2.2에 따라 - 3.4 세포 펠렛 대신에 세정 비드를 모두 사용하여 L 크실 로스 생합성을 평가. </li></ol> L 크실 로스 생산을위한 고정화 생체 촉매 5. 안정성 분석 <ol><li> 단계 4.8에서 비드를 수집한다 (단계 4.6에 기재된 바와 같이)를 원심 분리없이 50 mM 트리스 -HCl (pH 8.0) 완충액 10 ㎖로 두 번 세척 하였다. </li><li> 모든 사용3.4 - 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세정 비드의 반응을 수행한다. </li><li> 생산 사이클의 원하는 수의 5.2 각 사이클에서, 반응 상층 액 제조 L 크실 로스의 양을 측정 - 반복 단계 5.1. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다. 이 신문은 알긴산 비드에 고정화 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 생성하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신은 이전의 연구 (16)에보고되었다.

최근 기술의 발전은 생명 공학 산업에서의 시장 가치의 점진적인 상승의 결과로, 재조합 biotherapeutics의 상용화에 서지을 사용할 수있다. 하나는 이러한 발전은 확장 성 산업 시스템 (38)을 구축에 큰 약속을 보여 주었다 재조합 미생물의 대사 공학의 출현이다. 대부분의 프로세스에서와 같이, 유전자 조작 된 미생물에 의해 생산 된 재조합 생 분자의 성공적인 상업화는 시스템 (39)의</sup...

3 - 미생물을 이용한 환원 전체 세포의 생체 내 변화는 상업적 및 치료 중요한 생체 분자 하나의 화학 - 효소 합성을위한 광범위한 방법이되고있다. 7 - 그것은 절연 효소의 사용을 통해 여러 장점, 특히 비용 집약적 인 하류 정제 공정의 제거 및 연장 된 수명 (4)의 증명을 제공한다. 보조 인자가 제품의 형성에 요구되는 경로를 생 촉매를 들어, 전체 - 셀 시스템은 저렴 전자공 공동 5,8,9 기질의 첨가를 통해 원위치 팩터 재생에 제공 할 가능성이있다. 13 - 그러나, 이러한 능력은 희귀하거나 고가 공동 기판 (10)의 화학량 론적 농도를 반응에 필요로 감소된다. 함께 전체 세포의 가난한 재사용으로,이 확장 가능하고 연속의 produ의 설립을 방해ction 시스템. 이러한 보조 인자 - 의존 생물 전환을위한 전체 전지 시스템의 전략적 변형은 상기 한계를 극복해야한다. 특히, 협력 작업 전체 세포 생체 촉매의 조합은 상당히 품은 효소 (14)의 생산성 및 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 종종 상업적 제품의 대량 생산을 가능하게하는 중요한 요인은 공동 고정화 미생물 생 촉매 (15)에 의해 더 최적화 될 수있다. 우리는 최근 L 크실 로스 생산 (16)에 대한 보조 인자 재생 및 생 촉매의 고정화를 모두 할 수있는 간단하고 재사용 가능한 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이 연구에서,이 시스템은 개선 된 생물 전환 수율 및 생체 촉매의 재사용을 위해 두 가지 전략을 적용하는 실험 절차를 설명하기위한 예로서 사용되었다. L 크실 로스는 CIA 요원에 속하는생물학적으로 유용한 분자의 SS는 희소 당을 이름. 희귀 설탕은 자연에서 매우 드물게 발생 고유 단당류 또는 당 유도체, 그러나 생리 활성 분자 (17, 18)의 인식 요소로 중요한 역할을한다. 그들은 감미료, 기능성 식품의 잠재적 인 치료제 (19)에 이르기까지 다양한 응용 프로그램이 있습니다. L 크실 로스 여러 α-글루코의 전위 억제제로서 사용될 수 있으며, 또한 간염이나 간경변 17, 20의 지표로서 사용될 수있다. 전체 셀 시스템 L 크실 로스에 자일리톨 고효율 변환 판토 이전에보고되었다 (21, 22)는, 알칼리 게 네스 SP ananatis. 701B 23 바실러스 창백 Y25 24,25 대장균 26. E.에서 대장균은, 그러나, 높은 인해 하나 이상의 초기 자일리톨 농도 전위 억제 효과가 낮은 (&lt;67 mM)을 자일리톨의 농도 (26)를 통해서만 이루어졌다자일리톨-4-탈수소 효소 활성 21,26에서 00 밀리미터. 크실 로스 및 자일리톨 간의 열역학적 평형 강력 자일리톨 25, 27의 형성을 선호하는 것으로 나타났다. 또한, 크실 로스 수율 시츄 팩터 재생 시스템에서의 부재에 제공되어야하는 고가의 보조 인자의 양에 의해 제한된다. 함께, 이러한 요인 L 크실 로스 생합성 지속 시스템에 확장 가능성을 제한한다. 이러한 한계를 극복하고 L 크실 로스 생물 전환 수율을 향상시키기 위해, 보조 인자의 재생 전략은 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 확립함으로써 제를 사용 하였다. 구체적으로, L- 아라 비니 -4- 탈수소 Hypocrea의 jecorina 행 (EC 1.1.1.12) (HjLAD) 진균의 L-아라비 이화 경로의 효소, L-크실 로스 (28, 29)에 L-아라 비니의 전환을 촉진하기 위해 선택된 . 많은 생합성 효소와 같은 주요 limitatioHjLAD의 N은 상기 전환을 수행하기 위해 고가의 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 보조 인자 (NAD +, NADH의 산화 된 형태)의 화학량 론적 양을 필요로한다는 것이다. 연쇄상 구균 화농 (SpNox)에서 발견 된 NADH 산화 효소는 높은 보조 인자 - 재생 활동 (30, 31)를 표시하는 것으로 나타났다. SpNox, E.의이 속성을 활용 L 크실 로스의 제조 HjLAD를 발현하는 대장균 세포와 결합 된 E. NAD +의 재생에 SpNox 발현 대장균 세포는도 1a에 도시 된 커플 링 반응에 의해 도시 된 L 크실 로스 생산을 촉진한다. 최적의 조건 150 mM의 L-아라 비니의 초기 농도를 사용에서 최대 L 크실 로스 수익률은 훨씬 더 효율적으로 문헌에보고 된 것보다이 시스템을, 96 %에 달했다. 전 세포 고정화 전략은 상기 결합 biocatalyt의 재사용을 향상시키기 위해 다음의 이용했다IC 시스템. 전체 세포 고정화 일반적으로 사용되는 방법은 고체 매트릭스, 고분자 네트워크 (32)의 가교 / 함정 수사 및 캡슐에 연결 흡착 / 공유를 포함한다. 이러한 방법 중, 세포 고정화에 가장 적합한 방법은 칼슘 알기 네이트 비드에 캡슐화된다. 그들의 가벼운 겔화 특성, 불활성 수성 매트릭스와 높은 다공성 캡슐화 된 생물학적 (33)의 생리 학적 특성과 기능을 보존하는 데 도움이. 따라서, 결합 된 생 촉매 시스템은 E. 모두 포함 HjLAD 또는 SpNox 은닉 대장균 세포는 7 일주기 이후에 첫 번째 사이클의 전환 수율 65 %를 유지 국지적 고정화 생체 촉매 시스템이 잘 작동 안정성을 입증 L 크실 로스 생산의 다수의 사이클을 사용하는 칼슘, 알기 네이트 비드에 (도 2) 고정화 연속 재사용 자유 전지 시스템은 거의 그 촉매 활성을 잃고있다.

<table><tbody><tr><td>LB broth&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7004-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3506-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320501-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Carbazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5132</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium alginate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Excella E24 shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendrof</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beakers</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immobilization of multi-biocatalysts in alginate beads for cofactor regeneration and improved reusability

우리는 최근 개선 된 생산 수율 및 지속적인 합성을위한 보조 인자 재생 및 생 촉매 고정화의 능력으로, 간단한 재사용과 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이것과는 E. 설명이 이루어진 상기 시스템의 발전을위한 실험 절차 기능적으로 보완 효소를 발현 대장균 균주. 함께,이 두 효소는 생물 반응의 제품 수율 향상을위한 고가의 보조 인자의 재생을 중재하기 위해 공동으로 작동 가능하게 작동 할 수 있습니다. 또한, 칼슘, 알긴산 비드의 전체 세포의 밀봉하여 결합하는 생 촉매 시스템의 고정 된 형태를 합성하는 방법이보고되어있다. 예를 들어, 우리는 E. 결합하여 L-아라 비니에서 L 크실 로스의 개선을 제시 생합성 효소 L-아라 비니 NADH 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 발현하는 대장균 세포. 최적의 조건에서 (150)의 초기 농도를 사용하여밀리미터 L-아라 비니는 최대 L 크실 로스 수율은 문헌에보고 된 것보다 높은 96 %에 도달. 자유 전지 시스템은 거의 완전하게 촉매 활성을 상실하는 동안 결합​​ 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태는 연속적으로 재사용 7 사이클 이후 첫 번째 사이클에서 얻어진 수율은 65 %로 유지하는 우수한 작동 안정성을 보여 주었다. 따라서, 여기에보고 된 방법은 L 크실 로스의 산업 생산뿐만 아니라, 일반적으로 보조 인자의 사용을 요구하는 다른 부가가치 화합물을 향상시킬 수있는 두 가지 전략을 제공한다.

보조 인자의 재생을 가능하게하기 위해, L 크실 로스 합성 E. 함유 결합 전체 세포 생 촉매 시스템 행했다 대장균 HjLAD 및 E. 대장균 SpNox 세포. 다양한 파라미터의 최적화에 따라,이 시스템의 재사용 칼슘 알기 네이트 비드에 (도 2)를 고정함으로써 개선되었다. <stron...

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Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

We have recently developed a simple, reusable and coupled whole-cell biocatalytic system with the capability of cofactor regeneration and biocatalyst ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

17.2K 조회수.  Konkuk University.  예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다. 

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

연구

화학

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

발생학

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel cells.1-3 In most bioelectrochemical applications, enzymes or organelles are immobilized onto an electrode surface with the use of some type of polymer matrix. This polymer scaffold should keep the enzymes stable and allow for the facile diffusion of molecules and ions in and out of the matrix. Most polymers used for this type of immobilization are based on polyamines or polyalcohols - polymers that mimic the natural environment of the enzymes that they encapsulate and stabilize the enzyme through hydrogen or ionic bonding. Another method for stabilizing enzymes involves the use of micelles, which contain hydrophobic regions that can encapsulate and stabilize enzymes.4,5 In particular, the Minteer group has developed a micellar polymer based on commercially available Nafion.6,7 Nafion itself is a micellar polymer that allows for the channel-assisted diffusion of protons and other small cations, but the micelles and channels are extremely small and the polymer is very acidic due to sulfonic acid side chains, which is unfavorable for enzyme immobilization. However, when Nafion is mixed with an excess of hydrophobic alkyl ammonium salts such as tetrabutylammonium bromide (TBAB), the quaternary ammonium cations replace the protons and become the counter ions to the sulfonate groups on the polymer side chains (Figure 1). This results in larger micelles and channels within the polymer that allow for the diffusion of large substrates and ions that are necessary for enzymatic function such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). This modified Nafion polymer has been used to immobilize many different types of enzymes as well as mitochondria for use in biosensors and biofuel cells.8-12 This paper describes a novel procedure for making this micellar polymer enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The synthesis of the micellar enzyme immobilization membrane, the procedure for immobilizing enzymes within the membrane, and the assays for studying enzymatic specific activity of the immobilized enzyme are detailed below.

This article will describe the procedure for synthesizing a hydrophobically modified Nafion enzyme immobilization membrane and how to immobilize proteins and/or enzymes within the membrane and test their specific activity.

효소 고정 및 안정화를위한 소수성 소금으로 바뀌었 Nafion

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

생체공학

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

의학

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Synthesis of Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive Beads Using Electrospraying Technique

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in the context of colon cancer. Its active compound, thymoquinone, may help inhibit cancer cell growth and induce apoptosis in colon cancer cells. Additionally, black seed oil's anti-inflammatory and antioxidant effects could contribute to a healthier gut environment, potentially reducing cancer risk. Therefore, this study synthesized pH-sensitive alginate beads to deliver BSO into the colon in a controlled-release manner without releasing the drug at pH 1.2 (stomach), thus providing a well-defined release pattern at pH 6.8. The use of electrospray technology improves process performance by making it easier to formulate small, homogeneous beads with a higher rate of swelling and diffusion in the gastrointestinal medium. 
The formulated beads were characterized by an ex-vivo mucoadhesive strength test, bead size, sphericity factor (SF), encapsulation efficiency (EE), scanning electron microscope (SEM), in vitro swelling behavior (SB), and in vitro drug release in acidic and buffer media. All these manufactured beads demonstrated modest sizes of 0.58 &plusmn; 0.01 mm and spherical shape of 0.03 &plusmn; 0.00 mm in this testing. The formulation showed promising floating and releasing properties in vitro. With a very low cumulative percentage of beads, the oil EE of 90.13% &plusmn; 0.93% was high, and the release study demonstrated more than 90% in pH 6.8 with good floating nature in the stomach. Additionally, the beads were evenly spaced throughout the intestine. The electrospraying approach used in this protocol can be reproducible, yielding consistent outcomes. Therefore, this protocol can be used for large-scale production for commercialization purposes.

A technique employing high electric voltage and a targeted, active ingredient-loaded emulsion to fabricate pH-responsive, uniform microbeads is presented.

Black seed oil (BSO), derived from the seeds of the Nigella sativa plant, has garnered attention for its potential anti-cancer properties, particularly in ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic amyloid-&#946; (A&#946;) fragments, eventually leading to the classical features of the disease: amyloid plaques, neurofibrillary tangles and synaptic and neuronal loss. The lack of relevant non-transgenic preclinical models reflective of disease progression is one of the main factors hindering the discovery of effective drug treatments. To this end, we have developed a protocol for the fabrication of alginate microbeads containing amyloid-secreting cells useful for the study of the effects of chronic A&#946; production.
Chinese hamster ovary cells previously transfected with a human APP gene, secreting A&#946; (i.e., 7PA2 cells), were used in this study. A three-dimensional (3D) in vitro model for the sustained release of A&#946; was fabricated by encapsulation of 7PA2 cells in alginate. The process was optimized to target a bead diameter of 500-600 &#956;m for further in vivo studies. Optimization of 7PA2 cell encapsulation in alginate was performed altering fabrication parameters, e.g., alginate concentration, gel flow rate, electrostatic potential, head vibration frequency, gelling solution. Levels of secreted A&#946; were analyzed over time and compared between alginate beads and standard cell culture methods (up to 96 h).
A concentration of 1.5 x 106 7PA2 cells/mL and an alginate concentration of 2% (w/v) buffered with HEPES and subsequent gelation in 0.5 M calcium chloride for 5 min were found to fabricate the most stable microbeads. Fabricated microbeads were 1) of uniform size, 2) with an average diameter of 550 &#956;m, 3) containing about 100-150 cells per microbead and 4) able to secrete A&#946;.
In conclusion, our optimized method for the production of stable alginate microbeads containing amyloid-producing 7PA2 cells might enable the modeling of important aspects of AD both in vitro and in vivo.

This protocol illustrates a cell encapsulation method by rapid physical gelation of alginate to immobilize cells. Obtained microbeads allow controlled and sustained secretion of amyloid-&#946; over time and can be used to study the effects of secreted amyloid-&#946; in in vitro and in vivo models.

알츠하이머 병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드-β-분비 알긴산 마이크로비드 의 제조

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

생물학

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...