Name: sirna transfection and emsa analyses on freshly isolated human villous cytotrophoblasts
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts at JoVE.com

이 작품은 캐나다의 국립 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) (# 298527) (BB)에서 교부금에 의해 지원되었다. CT는 기관 FARE 장학금에 의해 지원되었다. AV는 NSERC 그레이엄 벨 박사에 의해 지원되었다 장학금. BB는 인간 Retrovirology에서 캐나다 연구 의장에게 (2 단계)을 개최했다. 텍스트를 수정에 도움을 베아트릭스 Beisner 감사합니다.

UQAM 윤리위원회는 센터 Hospitalier Universitaire 드 몬트리올의 세인트 루크 병원 (몬트리올, 캐나다)의 윤리위원회의 지침에 따라 이들 프로토콜을 승인했습니다. 참가자는 동의서에 서명했다. 1. 중간 준비 및 기본 산모 Cytotrophoblasts의 분리 <ol><li> 25 mM의 HEPES, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)을 보완하여 인간의 기본 융모 cytotrophoblasts에 대한 문화 매체를 준비합니다. A의 멸균 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 준비된 매체 필터 -20 50 ㎖의 분취에서 C 냉동고 °. </li><li> 표준 프로토콜 3 다음 신선한 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts을 분리합니다. <ol><li> 융모 조직을 제거하지 않도록주의하면서 플라이어를 사용하여, 그것을 떨어져 긁는 부드럽게하여 조직에서 태아 막을 제거합니다. 잘라메스와 가위를 사용하는 방법에 대한 3 × 3cm의 큐브에 태반 융모 남아. 철저하게 산모의 혈액을 제거하기 위해 0.9 % NaCl을 함유하는 물에 씻는다. <ol><li> 펜치와 각각의 큐브를 잡고 조심스럽게 남아있는 혈관과 섬유 조직하여 가위에서 융모 조직을 제거합니다. </li><li> 및 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase를 I) (, 융모 조직이 15 내지 30 mg의 내용 (최종 농도 1.2 ㎎ / ㎖에서 9.6 × 105 내지 1.8 × 106 U) 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 함유하는 트립신 4 회 다이제스트 연속 진탕 수욕에서 37 ° C에서 30 분 동안 최종 농도 200 μg의 / ㎖). 두 번째 소화 100ml로하고 나머지 두 digestions 75 ml의 첫 번째 소화 150 ml의 전체 볼륨을 사용합니다. </li></ol></li><li> 브레이크없이 15 분 동안 1,250 XG에 분산 세포와 원심 분리기를 포함하는 상층 액을 수집합니다. 데워진 함유 DMEM 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포를 분리1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유. </li><li> 브레이크 없음 507 XG에서 23 분 동안 70 %의 폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 실리카 경사 (구배 제조 표 1 참조) 및 원심 - 불연속 5 % 위에 분산 셀 층을 포함한다. 흡인 1.033로 1.017의 밀도 층을 제거하고 새 피펫으로 그라데이션 40 %와 50 % 사이의 계층을 수집합니다. 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함 데워진 DMEM 10 ml의 광범위 세포를 씻으십시오. 참고 : 수집 된 부분은 trophoblasts을 품고 1.048과 1.062 사이에 밀도에 해당한다. </li><li> 혈구 세포를 사용하여 계산. 간단히, 세포를 혼합하여 새로운 microcentrifuge 관에 10 μl를 추가합니다. 트리 판 블루의 10 μl를 추가하고 부드럽게 다시 섞는다. 세포 현탁액을 작성하고 혈구 챔버를 입력합니다. 10X 목표 아래에있는 세포를 계산합니다. </li><li> 1 × 106 4.5 × 10 섹션 1.3 및 2에서 사용하기 위해 별도의 튜브에 6 셀, 각각의 장소LY. 다른 실험 4 일 최대 CO 2, 37 ℃ / 웰 첨가 DMEM 배지 및 배양에 1.5 × 106 세포의 밀도로 잔존 세포를 시드 및 5 %. </li></ol></li><li> 고립 된 차 융모 cytotrophoblasts의 순도 평가 <ol><li> 스핀 300 X g에서의 microcentrifuge 튜브에서 갓 격리 cytotrophoblasts의 1 × 6. 뜨는을 취소하고 데워진 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖를 추가합니다. 원심 분리기 세포 300 XG에 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. </li><li> 세포에 차가운 메탄올 1 ML을 추가하고 20 분 동안 -20 ° C에서 품어. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포와 열망에 의해 메탄올을 제거합니다. 주의 : 메탄올을 처리하는 동안 용기 마스크, 보안경과 고무 장갑을 사용합니다. </li><li> 300 XG에 세포를 원심 분리기를 재수 흡인에 의해 PBS를 제거하고 실온에서 1 ml의 PBS를 추가합니다. </li><li> FBS (1시 50분 [V / V] 희석)과 FcRγ 쇄를 포함하는 PBS에서 세포를 품어실온에서 45 분 동안 시약 (1:10) 차단하는 비특이적 결합을 제거한다. </li><li> 5 분 300 XG에 실온 PBS 500 μL, 원심 분리기 세포로 두 번 세척하고, 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 100 ㎕를 실온 PBS에 재현 탁 세포. </li><li> 또는 실온에서 45 분 동안 0.2 % BSA를 함유하는 PBS에서 제어 이소 타입 정합 비특이적 항체 : 마우스 단일 클론 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)로 세포를 인큐베이션은 항 - 인간 사이토 케라틴 -7- 항체 클론 LP5K (200 1) π 공역 어두운. PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 유동 세포 계측법 (3)에 의해 세포를 분석한다. 상기 실험 유동 세포 계측법에 의해 96 % CK-7 양성 세포 최소 보여 세포 제제를 사용한다. </li></ol></li></ol> 인간의 기본 산모 Cytotrophoblasts 2. siRNA를 형질 <ol><li> microporation 장치를 사용하여 인간의 기본 융모 cytotrophoblasts의 형질 <ol><li> 포함 된 6 웰 플레이트를 준비microporated 세포 배양을위한 보충 DMEM 배지 2 ㎖. </li><li> 주 cytotrophoblasts (1.2 절 참조)의 분리 후 정지 세포의 나누어지는을 가지고 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 microcentrifuge 관과 펠렛 세포를 1.5 × 106 세포를 옮긴다. 1 ml의 둘 베코 PBS (DPBS) (의 Mg 2 +, 칼슘 -free)으로 세포를 세척하고, 실온에서 5 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 세포를 펠렛. </li><li> 상층 액을 제거하고 재 부유 버퍼 100 ㎕에 부드럽게 세포를 재현 탁. 실온에서 이상 15-30 분 동안 세포 현탁액을 유지하는 피 세포 생존하고 형질 전환 효율을 극대화 참고. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 Syncytin-2의 siRNA (또는 제어 스크램블 된 siRNA)의 300 NG를 추가하고 100 ㎕를 형질 전환 피펫을 사용하여 세포의 siRNA 혼합물을 대기음. 끼워 넣다역에 피펫 (재료의 목록 참조) 30 밀리의 1300 V 단일 펄스로 세포를 대상으로 할 수 없다. </li><li> 즉시 세포의 손상을 방지하기 위해 37 ℃의 예열 된 배지를 포함한다 (단계 2.1.1에서 제조 됨)을 6- 웰 플레이트에 세포를 옮긴다. </li><li> 반복 나머지 샘플 2.1.5와 2.1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 세포의 고른 분포를 보장하기 위해 30 초 동안 판 바위. 24 ~ 48 시간 동안 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 접시를 품어. 배지를 형질 전환 후 24 시간을 새로 고칩니다. </li><li> 웨스턴 블롯 분석에 의한 형질 전환 효율을 평가한다 (단계 3~6 참조). </li></ol></li><li> 인간의 기본 cytotrophoblasts에서의 siRNA의 리포 펙 <ol><li> 융모 cytotrophoblasts 단리 후, 배지 2 ml를 6- 웰 플레이트에서 웰 당 1.5 × 106 세포의 밀도로 세포를 시드 및 18 시간 동안 배양한다. </li><li> Syncytin-2 특이 적 siRNA를 300 ng의 희석 (또는 제어-스크램블siRNA의) 및 antibiotic- 및 무 혈청 배지 10 ㎕의 총 부피 1.5 ㎖의 별도의 튜브 지질 계 형질 감염 시약을 5 μL. 5 분 동안 품어. </li><li> 희석 시약을 혼합하고 형질 감염 복합체를 형성하고, 실온에서 추가로 20 분 동안 배양한다. 100 μL의 최종 볼륨 믹스에 antibiotic- 및 무 혈청 배지 90 μl를 추가합니다. </li><li> 6 웰 플레이트 (단계 2.2.1)에서 배지를 제거합니다. 이 새로운 배지 ㎖의 각 웰에 100 ㎕를 형질 믹스를 추가합니다. 24 ~ 48 시간에 대한 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 배지를 형질 전환 후 24 시간을 새로 고칩니다. </li><li> 웨스턴 블롯 분석에 의한 형질 전환 효율을 평가한다 (단계 3~6 참조). </li></ol></li></ol> 전체 세포 배양에서 해물 3. 준비 <ol><li> 용지를 제거하고 미리 예열 DPBS를 사용하여 (단계 2.1.8과 2.2.4에서) 각 웰 린스 (2 + 마그네슘 칼슘 무료). DPBS를 대기음 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)의 500 μl를 추가합니다. 공동 인큐베이터에서 37 ℃에서 1-3 분 동안 인큐베이션. 혈청을 함유하는 성장 배지 500 μl를 첨가함으로써 트립신 처리를 중지. 참고 : 사용 적절한 미디어 볼륨 플라스크 / 요리의 종류에 따라 : 10 7 세포 / 100mm 요리 / 150cm 2 플라스크 당 1 ml의; 5 × 10 6 세포 / 60mm 접시 당 0.5 ㎖ / 75cm 2 플라스크. </li><li> 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송 세포 펠렛 세포. 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 DPBS로 마그네슘 (Mg 2 +, 칼슘 -free)과 펠렛 세포를 세포를 세척 하였다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 50 ~ 200 ㎕의 얼음처럼 차가운 라디오 - 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼 (완충 성분 표 2 참조) 갓 추가 함유하는 펠렛을 재현 탁배속 최종 농도에서 에드 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제. 간략하게, 튜브를 와동 30 분 동안 얼음에두고. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에 스핀. 조심스럽게 얼음에 튜브를 배치합니다. 피펫을 사용하여 얼음에 보관 신선한 사전 냉각 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. </li></ol> 배양 된 세포에서 핵 추출물 4. ​​준비 <ol><li> 각 웰 (단계 1.2.5)의 경우, 미리 예열 DPBS 마그네슘 (Mg 2+, 칼슘 무료) 1 ㎖로 두 번 배양 cytotrophoblasts을 씻는다. 기음 DPBS와 0.25 % 트립신 / EDTA 500 μl를 추가합니다. 공동 인큐베이터에서 37 ℃에서 1-3 분 동안 인큐베이션하고, 혈청 함유하는 성장 배지 500 μl를 첨가함으로써 트립신 처리를 멈춘다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 300 × g으로 원심 분리하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 전송 세포 펠렛 세포. 원심 분리하여 DPBS 마그네슘 (Mg 2+, 칼슘 - 무료) 및 펠릿 세포와 세포를 씻으실온에서 2 분 동안 300 XG에. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 모든 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 핵 단백질을 추출합니다. 단백질 정량 분석​​ (브래드 포드 또는 bicinchoninic 산 분석 (BCA))를 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 5. 샘플 준비 및 전기 영동 <ol><li> 단백질 정량 분석하여 각 세포 추출물, 단백질 농도를 결정한다 (예를 들어, 브래드 포드 8 BCA 9). </li><li> (항체 감소 및 변성 조건에서 사용할 수있는 경우) 제조업체의 지침에 따라, 총 단백질의 20 ~ 30 μg의에 배 램 믈리 샘플 버퍼 (표 2)의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 100 ° C에서 삶아의 세포 용 해물. 반복 된 동결 / 해동 사이클을 피하고 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 나머지 튜브를 저장할 해물 나누어 50-100 μL. </리&gt; <li> 샘플이 가열되는 동안, 버퍼 (표 2)를 실행 1 배 1 L를 준비합니다. </li><li> 몇 초 동안 16,000 XG에서 샘플을 스핀과 얼음에 배치합니다. </li><li> 분자량 마커와 함께 12 % SDS-PAGE 겔 (겔 조성은 표 2 참조)의 각 웰에 동일한 양의 단백질을로드. 100 V.에서 2 시간에 1 젤을 실행 </li></ol> 6. 막 겔로부터 단백질 전송 <ol><li> 1 분 동안 메탄올로 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 1X 전송 버퍼 / 10 % 메탄올 수용액으로 씻어. 제조업체의 지시에 따라, 단백질을 크기에 따라 1 시간 30 분 동안 옮긴다. 주 : 전사 효율이 차단 공정 전에 개양귀비 빛 레드 염색을 이용하여 평가 될 수있다. </li></ol> 7. 항체 염색 <ol><li> (1) 상온에서 시간 또는 밤새 4 ℃에서 5 %의 블로킹 용액을 이용해 박막을 차단. </li><li> 6 안티 - 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH; 0.4 μg의 / ㎖; 1 : 500)으로 5 %의 차단 용액 중에서 밤새 :; 항 Syncytin-2 항체 (5000 1-4 μg의 / ㎖)과 함께 막을 인큐베이션 39 ° C (항 Syncytin-2) 상온에서 45 분 동안. TBS 버퍼 트윈에 멤브레인을 세 번 세척 (TBST, 버퍼 컴포지션 표 2 참조) 5 분. </li><li> 적절한 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)와 함께 막을 인큐베이션 공역 계 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 항체 (1 : 10,000) 5 % 실온에서 1 시간 동안 TBST 버퍼에서 차단된다. 5 분 동안 멤브레인을 TBST에 세 번 세척 한 후 TBS에 헹군다. 화학 발광 계 블롯 기판을 이용하여 신호를 검출한다. </li></ol> 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 8. 방사성 표지 <ol><li> 인산화 반응 <ol><li> 미세 원심 분리 관에, 1 배속 U T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제 완충액 순방향 올리고 뉴클레오티드 (50)를 따라 추가 NGT4 폴리 뉴클레오티드 키나제 20 μCi를 (γ- 32 P) ATP와 클레아없는 물 20 μL의 반응 볼륨을 구성합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 0.5 M EDTA의 5 μl를 추가하여 반응을 중지합니다. 클레아없는 물 50 μL에 볼륨을 확인합니다. </li></ol></li><li> 올리고 뉴클레오티드에서 비법 인 뉴클레오티드의 제거 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 TE 버퍼 (표 2)으로 평형화 G-25 컬럼을 준비합니다. 신선한 DNase의 프리 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 열을 놓습니다. </li><li> 천천히 지층을 방해하지 않도록주의, 수지를 통해 (단계 8.1.2에서) 프로브의 50 μl를 추가합니다. 350 XG에 2 분 동안 스핀은 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 정제 된 샘플을 수집합니다. microcentrifuge 관에를 수집하기 위해 350 XG에 2 분 동안 뉴 클레아없는 물과 스핀의 36 μL와 G-25 컬럼을 씻으십시오. </li></ol></li><li> 상보 가닥 올와 하이브리드igonucleotide <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 방사성 표지 된 프로브 (86 μL)를 전송하고 (200) 역 올리고 뉴클레오티드의 NG 및 어닐링 버퍼의 1 배 (표 2)를 추가합니다. 열 95 ° C에서 5 분, 냉각, 실온에서 밤새두고. </li><li> 앞으로 레이블이없는 50 NG를 추가하여 비 방사성 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 올리고 뉴클레오티드 및 어닐링 버퍼의 1 배 역. 클레아없는 물 100 μL에 볼륨을 확인합니다. 열 단계 8.3.1에 ​​기술 된 바와 같이 실온에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> EMSA에 대한 비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 9. 준비 <ol><li> 1.5 mm의 공간 빗 (겔 조성물 표 2 참조) 4 % 기본 겔 (10 × 12cm)를 준비합니다. 증류수를 사용하는 모든 유리 접시를 청소합니다. 참고 :이 판 SDS와 같은, 이온 성 세제를 완전히 무료 것이 중요합니다. </li><li> 즉시 페이지와 플레이트 사이에 우리의 아크릴 아미드 용액 중합 (약 30 분)를 진행 할 수 있습니다. </li><li> 전기 영동 장치를 조립하고 0.5 배의 TBE와 탱크를 채우십시오. 샘플 로딩하기 전에 150 V에서 1 시간 30 분 동안 젤을 사전 실행합니다. </li></ol> 10. DNA 결합 반응 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 1 배 젤 시프트 바인딩 버퍼 (표 2) 핵 추출물 (단계 4.3)의 10 μg의 추가 및 뉴 클레아없는 물 10 μL에 최종 볼륨을 구성합니다. 대조군으로, 아니 핵 추출물 튜브를 준비합니다. 경쟁 반응에, 차가운 비 특정 또는 특정 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 (단계 8.3.2) 1 μl를 추가합니다. </li><li> 각 반응 단계 8.3.1에서 방사성 프로브의 1 μl를 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 반응을 부화. 반응 당 10 배 겔 로딩 버퍼 1 μl를 추가하고 섹션 9에서 제조 된 겔의 각 샘플을로드합니다. </li><li> 15에서 2 시간에 1 1/2의 젤을 실행마이그레이션 후 0 V.은 형광면 아래 노광 카세트 플라스틱 랩 위치 겔 유리 랩. 24 시간 동안 4 ° C에서 카세트를 남겨주세요. </li><li> 노광 카세트 화면을 제거하고 스캐닝 형광 촬상 장치에 삽입한다. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoplex+morphologies+and+their+influences+on+transfection+efficiency+in+gene+delivery.">Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery.</a> J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).</li><li>Freeley, M., Long, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+siRNA+delivery+to+T-cells:+potential+clinical+applications+for+inflammatory+disease,+cancer+and+infection.">Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection.</a> Biochem. J. 455, 133-147 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

인간의 태반 기능과 개발에 관한 연구는 매우 다양한 태반 세포 집단의 분리를 최적화하기위한 프로토콜이 향상되었습니다. 최고의 연구 된 태반 세포 집단 중 하나는 매우 효율적이고 신뢰할 수있는 격리를 허용 최적화 된 프로토콜에서 도움이되고 연구되는의 융모 cytotrophoblasts을, 남아있다. 이것은 또한 이러한 형질 전환 및 프로모터 연구 등의 실험의 수를 허용했다. 이전에 설명 된 프로?...

Human placental dysfunction is associated with the development of several pregnancy-associated diseases like preeclampsia and intrauterine growth restriction 1. An important cell constituent of the placenta is the trophoblasts, which can be classified as either extravillous or villous cytotrophoblasts. Upon fusion, villous cytotrophoblasts further differentiate into the syncytiotrophoblast layer, a multinuclear cell structure with an important role in feto-maternal exchange and hormone production 2. Human primary villous cytotrophoblasts and their differentiated counterparts represent important biological samples and allow researchers to study a number of placenta-related processes, such as cell fusion, in culture. Furthermore, substantial efforts are ongoing to identify markers that will facilitate appropriate management and improve preventive therapies specific to pregnancy-related diseases. Laboratories routinely isolate primary human villous cytotrophoblasts from fresh placentas, using a standard isolation procedure based on trypsin digestion of placenta villi 3. As cultured cytotrophoblasts lose their capacity to proliferate and quickly differentiate in a syncytiotrophoblast-like layer upon culture 4, very efficient transfection methods and optimized analysis approaches are needed. Previous studies have determined optimal conditions of transfection of these primary cytotrophoblasts 5. Herein, a different method of siRNA transfection, which has been previously tested in this cell type 6, is presented. In comparison to a lipofection-based approach, this microporation method improves transfection, as assessed by the extent of silencing of specific genes.
Promoter and gene expression studies also provide a better understanding of placental function. Although more difficult to use owing to the short time frame for which primary villous cytotrophoblasts can be cultured, promoter analyses using standard protocols can nonetheless be addressed, as previously published 7. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) is one of these commonly used in vitro methods, allowing for fast and easy monitoring of DNA-protein interactions. Nuclear extracts from these primary trophoblasts were used to test a region of the Syncytin-2 promoter for specific interactions. Results revealed that bound factors could be detected at different time points of culture and in a specific and reproducible manner.
Data presented in this protocol confirm that our transfection approach and the EMSA protocol can be used for isolated primary villous cytotrophoblasts and will be of great use to study the diverse functions of villous cytotrophoblasts in normal or pathological conditions.

<table><tbody><tr><td>HBSS without&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose without Hepes</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;.&lt;/sup&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>For density gradient</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life technologies</td><td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, type I&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfection&amp;nbsp; reagents&amp;nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A9099</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>CBL194F</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>FcR blocking reagent&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>Dilution 1:10</td></tr><tr><td>Flow Cytometer BD Acuri system</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 apparatus&amp;nbsp;</td><td>Digital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100&amp;nbsp;&amp;micro;l Kit)</td><td>Life technologies</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&amp;nbsp;</td><td>Activate with methanol</td></tr><tr><td>Anti-human GAPDH antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>#7074</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>#7076&amp;nbsp;</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminsescence and fluorescence imaging device</td><td>Montr&amp;eacute;al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% native gel</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Home made</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>Personal Molecular Imager (PMI) System</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sirna transfection and emsa analyses on freshly isolated human villous cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

임신 기간에서 신선한 태반은 프로토콜 부분에 제시된 실험 세트를 수행하기 위해, 인간 융모 cytotrophoblasts 주를 분리 하였다. 이들 분리 후, 우리는 먼저 사이토 케라틴 -7- 마커 (도 1)의 사용을 통해 cytotrophoblasts의 순도를 분석 하였다. 세포 제제는 따라서 단일 클론 항 - 사이토 케라틴 -7- 항체를 이용하여 염색 하였다. 1 유동 세포 계측법 표준 분...

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K 조회수.  University of Quebec in Montreal.  이 프로토콜은 효과적으로 격리 갓 인간 융모 cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 감염 microporation을 사용하여 이들 세포의 DNA 단백질 복합체를 식별하는 방법을 설명한다. 형질 감염된 세포는 웨스턴 블롯에 의해 모니터링 될 수 있고, EMSA는 4 일간의 배양 기간 동안 분석한다. 

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Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

연구

발생학

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석<em&gt; 생체</em&gt; 영양막 세포 거대 세포 또는<em&gt; 체외</em&gt; Ectoplacental 콘의 Explants의 단기 문화

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Improving ex vivo Placental Explant Culture using a Flow-Based Approach(흐름 기반 접근법을 사용한 생체 외 태반 이식 배양 개선)

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

저자 스포트라이트: Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues(태반 조직에서 단일 세포 시퀀싱 및 공간 조직학을 통한 연구 발전) 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

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의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석

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3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Ex Vivo (체외 주행) 태반 이식 유동 배양 - 자궁의 동적 조건 모방

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