Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Minist&#232;re de l'&#233;ducation, de l'Enseignement sup&#233;rieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Qu&#233;bec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the R&#233;seau Qu&#233;b&#233;cois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Sant&#233;, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient&#236;fico e Tecnol&#242;gico (CNPq) and the Programme de bourses d'excellence pour &#233;tudiants &#233;trangers MEESR-FRQNT.

태반은 정보를 환자의 동의와 윤리위원회 (CHUM - 세인트 루크 병원 INRS - 인스 티 투트 아르망 - Frappier의 승인을 즉시 미끼 - 세인트 루크 병원, 몬트리올, QC, 캐나다에서 복잡하지 않은 임신에서 자연 질식 분만 후 얻었다 라발, QC, 캐나다). 산모 Cytotrophoblast 세포의 1. 분리 및 정제 <ol><li> 솔루션 및 미디어 <ol><li> 보완하여 전송 매체를 준비 둘 베코의 이글의 중간 높은 포도당 1 % 부피 /의 부피 항생제와 (DMEM-HG) (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장 4 ℃에서 수정. </li><li> 10 % 부피 / 부피 소 태아 혈청 (FBS), 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1 % 부피 / 부피 항생제 (10,000 단위 / 가진 DMEM-HG를 보충하여 일차 배양 배지를 준비 ml의 페니실린 G 4 ° C에서 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염) 및 저장. 37 ° C에 따뜻한 미디어 전용도. </li><li> 생리 식염수 (0.9 % 중량 / 부피의 염화나트륨)의 4 L를 준비한다. </li><li> HBSS (PH 7.4) 1x에서 25 mM의 HEPES를 추가하여 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 수정 준비합니다. </li><li> (변성 (1.1.4에서 제조) HBSS, 황산 마그네슘 (MgSO4로), 염화칼슘 (CaCl2를) 트립신, 데 옥시 리보 뉴 클레아 제의 IV (DNase의 4) 및 1 % 부피 / 부피 항생제 분해 용액 신선 네병 준비 표 1에 나타낸 바와 같이 10,000 단위 / ㎖ 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트). </li><li> 밀도 원심 분리 미디어 구배를 준비 <ol><li> 10 % 부피 /의 부피 HBSS 10 배와 밀도 원심 분리 미디어를 보완하여 밀도 원심 분리 미디어 솔루션을 준비합니다. </li><li> 표 2에 기재된 바와 같이, 밀도 원심 미디어 용액 변성 HBSS 14 분석 튜브를 준비한다. </li><li> 적극적으로 그라데이션에 내용을 추가하기 전에 각각의 밀도 솔루션 (단계 1.1.6.2)를 섞는다. 부드럽게가장 높은 농도 (70 %)을 시작으로 연동 펌프 (1 ㎖ / 분)을 50 ㎖의 유리 원심 관에 밀도 솔루션을 추가한다. 구배의 각 층의 적절한 거리를 유지하기 관벽 용액을 배출하여 물방울을 피한다. <ol><li> 연동 펌프의 부재에서, 파스퇴르 피펫으로 매우 부드럽게 층을 적용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 실행중인 버퍼를 보완하여 최종 실행 버퍼를 준비 (10,000 단위 / ml의 페니실린 G, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 설페이트), 항진균제 2 % 부피 / 부피 항생제 /과 (재료의 표 참조). 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 융모 cytotrophoblast 분리 참고 : 사용 무균 수술 장비, 유리, 피펫, 플라스크 등 <ol><li> 융모 cytotrophoblast 분리 날에, 37 ℃의 수욕 및 FBS 70 ㎖ (단계 1.1.5에서)를 digestions 용액을 가온. 주 : FBS 50ml의 사용은 digestions 및 인터럽트 할일단 해동 얼음에 배치 할 수있는 냉동 공정 (1.2.22) 20 ml의 나머지. </li><li> 전달 후, 수 (이하, 1 시간) 빨리 (1.1.1)에서 빙냉 전송 매체에 실험실 태반을 가져온다. </li><li> 취소 전송 매체 및 액체 쓰레기통에 태반 혈액. 태반의 무게를 차가운 생리 식염수에 담가. </li><li> 측정하고 다음과 같은 기능 분석 : 탯줄의 길이; 탯줄 현지화; 태반 길이, 폭, 모양 (타원형 원반 모양); 막 색상; 떡잎 구조 병변. 주 : 데이터는 결과 섹션에 표시됩니다. </li><li> (코드 주위에 추가 1cm 반경 원과의 기지에서, 즉)의 태반 삽입과 함께 탯줄을 잘라. 이상 조직 학적 분석 학적 조직 고정액 수용액 (포르말린 10 %) 300 ㎖에 담근다. </li><li> 5 × 5 × 5cm의 큐브로 전체 태반을 잘라. 식염수 졸 (4 시간 X ~ 1 분) 철저하게 세척생리 식염수가 선명해질 때까지의 ution (0.9 %)는 혈액 세포를 제거한다. 액체를 씻어 버리십시오. </li><li> 시계 유리, 혈관 석회화를 제거하는 태반 막과 말하다 조직을 제거합니다. 집게로 단단히 혈관을 잡고 Metzenbaum 가위의 뒷면을 사용하여 조직을 제거합니다. <ol><li> 흡인 여과기에 다진 태반을 놓습니다. 식염수 버퍼의 약 100 ㎖로 씻어. 다진 조직의 35g (보트와 규모 무게 사용 플라스틱)를 얻을 수있다 - (30)가 될 때까지 닦지 계속합니다. 35g 제제 - 필요한 경우, 추가로 30 세까지 얻었다 태반의 나머지 말하다. 이 시간 동안 얼음에 무게 보트에 다진 조직을했습니다. 참고 :이 단계는 1 시간에 약 45 분 소요됩니다. </li></ol></li><li> trypsinizing 플라스크에 35g 다진 태반 조직 - 30를 추가합니다. 전송 150 trypsinizing 플라스크에 준비된 소화 용액 1 (표 1)의 용액과 잘 혼합한다. </li><li> 에 trypsinizing 플라스크를 배치무 50 사이클 / 분의 속도로 30 분 동안 수욕 진탕 수동 trypsinizing 플라스크를 균일 소화 매 5 분 동안 혼합한다. </li><li> 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 플라스크를 분리하고 태반 조직을 1 분 침강 대 (45)를 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로 제거하고 상층 액의 약 80 ml의 폐기합니다. 조직을 흡입하지 마십시오. </li><li> 전송합니다 trypsinizing 플라스크 소화 용액을 100㎖의 2 (표 1); 잘 혼합 단계 1.2.9를 반복합니다. </li><li> 제 소화의 끝에, 수욕에서 trypsinizing 형틀을 제거하고 1 분 정도 45 ° 기울. 10 ㎖의 멸균 피펫으로, 80 ml의 상층 액을 제거하고 부드럽게 셀 스트레이너 (100 μm의 메쉬)와 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. FBS 2 ㎖ 원심 분리 튜브가 가득마다 들어있는 비이커에 여과하여 상층 액을 이동. </li><li> 기술 한 바와 같이 제 소화를 수행병행하여 75 ml의 소화 용액 (3)을 사용하여 초 소화 (1.2.11 및 1.2.12)은, 소화 2 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행합니다. </li><li> 소화 용액 (4) (75 ㎖)를 사용하여 제 소화 정확히 제 소화를 수행하지만, 상등액의 최대 양을 수집한다. 소화 3 병렬 1.2.16.1에 단계 1.2.15를 수행하고, 마지막으로 소화 4. </li><li> 제 (digestions이 3 내지 4), 13.5 mL의 상층 액 부분으로 한 15 mL의 원심 분리 튜브에 나누어지는 각 부품. 22.8 cm 길이 유리 파스퇴르 피펫으로 아주 부드럽게 천천히 개별 층을 생성하기 위해 각 튜브의 하단 FBS 1.5 ㎖에 놓는다. FBS와 상층 액을 혼합하지 마십시오. 실온에서 1,250 × g으로 20 분 동안 브레이크없이 튜브를 원심 분리기. 참고도 1에 나타낸 바와 같이 원심 분리 후에, 4 층의 튜브를 볼 수 트립신 및 영양막 세포의 분리 과도한 세포 분해를 피한다.. </li><li> 진공 펌프와 aspir먹고 두 층 사이에 백탁 막을 포함 상청액 (분해 용액) 및 FBS 층을 버린다. 따뜻한 세포 배양 배지 1 mL를 펠렛합니다 (trophoblasts과 적혈구 층) 재현 탁한다 (단계 1.1.2 아니오 FBS없이 HEPES로). <ol><li> 모든 관에서 재 부유 세포를 수집하고 1 관에서 그들을 결합. 튜브 모든 digestions이 끝날 때까지 실온에 서 보자. 참고 : 모든 digestions 후, 보통의 수율은 재현 탁 세포 (소화 당 하나)의 3 관입니다. </li></ol></li><li> 따뜻한 세포 배양 배지 15 ml의에 볼륨을 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 1250 × g으로 원심 분리기. 진공 펌프와 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 흡입하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 따뜻한 세포 배양 배지 1 ㎖로 3 개의 튜브에서 얻은 펠렛을 재현 탁. 1 관에서 자신의 콘텐츠를 풀. 8 ml의 수득 따뜻한 세포 배양 배지 부피를 완료. </li><li> 아주 부드럽게 분리 래드에 세포 현탁액 레이어파스퇴르 피펫 ient. 실온에서 507 XG에 30 분 동안 브레이크없이 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 다시 조명 기울기에 세포의 다른 레이어를 식별합니다. 밀도 원심 분리 매체의 50 % - 레이어 영양막 세포를 포함하는 40 사이에 세포 오염을 찾습니다. 진공 펌프로, 상위 계층들 (&gt; 50 %)을 제거한다. </li><li> 파스퇴르 피펫 관심 층에있는 세포를 수집하고 50 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 세포 배양 배지 50 ㎖에 볼륨을 확인합니다. 상온에서 1,250 XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 멸균 조건 하에서, 상층 액을 제거 FBS 20 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. 얼음 멸균 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 2.22 mL를 추가하고 젖혀 부드럽게 혼합한다. 저온 바이알에 세포 현탁액의 분취 량 1.5 ㎖를, -​​80 ° C에서 밤새 냉동 및 액체 질소 탱크로 옮긴다. </li></ol></li> &lt;리&gt; 영양막 세포 정화 <ol><li> 헹굼 및 실행 버퍼와 제조업체의 지침에 따라 자기 정화 장비에 새 필터 컬럼을 설치합니다. 음 1, 양 1, 양 2 포트를 청소하고 제조업체의 지침에 따라 각 포트에서 50 ml의 튜브를 소개하는 &quot;클린 프로그램&quot;을 수행합니다. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 빠르게 단계 1.2.22에 동결 된 세포를 해동. 50 ㎖의 튜브에 세포를 전송 천천히 차가운 완충액 20 ㎖로 재현 탁 셀. 450 XG에 5 분, 4 ℃로의 튜브를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 차가운 버퍼로 세척 단계를 반복합니다. 생존을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심 분리를 반복합니다 (5 분, 4 ° C에서 450 XG의 경우). 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 1 % 권 / 마우스 항 - HLA-ABC 항체의 부피를 포함하는 차가운 버퍼의 1 ML을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어, 믹시부드럽게 매 5 분 ng를. </li><li> 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고이 단계를 반복합니다. 10 % 부피 / 항 - 마우스 이차 항체 결합 된 자성 비드의 체적을 포함하는 차가운 완충액 1 ㎖에 재현 탁 된 세포. 부드럽게 매 5 분을 혼합, 15 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 차가운 버퍼 6 ML을 추가합니다. 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 5 ml의 차가운 버퍼에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. </li><li> 자기 정화 장비를 사용하여 영양막 세포를 분리합니다. 부정적인 포트에서 세포를 수집하고 차가운 버퍼 20 ㎖를 추가합니다. 주 : 영양막 세포는 복잡한 HLA-ABC 포함하지 않으며, 따라서 음의 1 포트쪽으로 다른 유형의 세포로부터 분리에 관한 것이다. </li><li> 450 XG에 5 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 부드럽게 20 ㎖ 따뜻한 차 배지에서 세포를 재현 탁. 저기서 세포를 계산조지아 혈구는 가능성을 확인합니다. </li><li> 판 다음 밀도의 세포 : 0.15 × 10 6 세포 / 웰에서 96 웰 플레이트, 1.6 × 10 6 세포 / 웰에서 24 웰 플레이트 4.5 × 10 6 세포 / 웰 6 웰 플레이트. 37 ° C와 5 % CO 2에서 접시를 품어. </li><li> 16, 17 계측법 및 / 또는 18 면역 세포에 의해 흐름에 의해 영양막 세포의 순도를 확인합니다. 주 : immunopurified 세포의 순도는 사이토 케라틴 -7- 멘틴 및 17-19에 대해 FITC 접합 된 모노클로 날 항체를 사용하여 측정 하였다. 이 프로토콜은 Lanoix 등의 알 잘 상세한입니다. 2008 년 7. </li><li> 적어도 4 시간 후 비 부착 세포를 제거하고 8 % O 2 (도 2, 섹션 2 참조)로 구성된다 normoxia 챔버에 플레이트를 전송하는 따뜻한 배지로 두 번 세포를 씻어. </li></ol></li></ol> 2. 체외 유도 전열Normoxia의 n 및 저산소증 / 재산 소화 <ol><li> 인큐베이터 챔버 작업 (셋업에 대한도 2A 참조). <ol><li> 층류 후드에서 건조 함을 방지하기 위해 인큐베이터 챔버의 바닥에 멸균 수를 함유하는 페트리 접시로; 그 실의 우수한 가구에 미리 제조 세포 배양 플레이트 또는 플라스크 (단계 1.3.10)을 배치했다. </li><li> 후드 이외의 가스 호스 챔버 (입구 포트) 연결 (그림 2A : 5A, B 및 C) 가스 (8 % O 2 0.5 % O 2)의 튜브에 도달하는 (그림 2A : 7). 챔버의 양쪽 입구와 출구 포트를 엽니 다. 이 때, 가스 레귤레이터 (그림 2A : 4) 폐쇄 상태를 유지해야합니다. </li><li> 조심스럽게 가스 조절 밸브를 엽니 다 (그림 2A : 4). 25 L의 공기 흐름을 4 분 동안 세척 / min으로 완전히 챔버 내부의 공기를 대체한다. </li><li> 챔버를 세척 한 후, 그 입구 및 OU를 가스 조절기를 닫고챔버의 tlet 포트. </li><li> 유량계 출구 호스 빼고 (도 2a를 : 5C) 상기 챔버의 입구로부터 37 ℃ 세포 배양 인큐베이터 챔버를 배치했다. </li><li> 단계 2.1.3 후 가스를 1 시간으로 챔버를 작성하여 배지에서 현재 판, 플라스크에 존재하는 용존 공기를 교체합니다. </li><li> 를 반복하여 다른 가스 조성에 대한 2.1.6에 2.1.1 단계 (예를 들어, 2 % 임신 초기의 영양막 세포 배양 9 O 2). </li></ol></li><li> 산소 비율을 확인 (도 2B-C) <ol><li> 상기 챔버 내부 (셀)없이 세포 배양 배지 내의 산소의 농도를 확인하기 위해, 산소 어댑터에 연결된 산소 전극을 사용한다. 전압계에 산소 전극을 연결합니다. </li><li> 동일한 용액에서 검량선을 작성 (예를 들어, 세포 배양 배지) 공지의 산소 함량 (기체로 용액에 노출시킴으로써 예를 들어, 0 % 및21 % 산소). 판독은 각 농도에 대해 안정화 된 후, 챔버 내의 매질에 전극을 소개한다. 주 : 산소 농도 10 편견을 피하기 위해 동일한 깊이에서 모든 측정을 수행. </li></ol></li><li> trophoblasts에서 normoxia 및 저산소증 / 재산 소화 유도. <ol><li> 적절한 세포 배양 플라스크, 플레이트 또는 페트리 접시에 차 영양막 세포를 추가 한 후, 필요에 따라 치료를 수행합니다. </li><li> 병행하여, 챔버 내부 특정 조건마다 24 시간 (도 3)를 재생하기 원하는 가스 혼합물에 셀을 노출. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

포유 동물에서 태아의 발달은 적절한 태반 기능에 직접적으로 의존한다. 건강 장애의 발달 기원은 이후의 삶에서 나타난 질환의 원인은 초기 개발 및 태반 태아 프로그래밍 30-32에서 기계적 역할을하고 있음을 다시 추적 될 수 있다는 가설에 기초한다. 그것은 영양 전달을 조절 유해한 노출 방지 및 주요 내분비 기능을 가지고 : 태반은 태아의 성장과 발전의 중요한 매개체이다. Kliman ?...

인간 임신 중, 단핵 줄기 세포 인 cytotrophoblast 태반 세포는 빠르게 증식 또는 융모 extravillous cytotrophoblast 세포로 분화하거나. Extravillous cytotrophoblasts는 침략과 자궁 벽의 나선형 동맥을 개조. 융모 cytotrophoblasts 반면에, 다핵는 syncytiotrophoblast합니다 (syncytium) (1)를 형성하기 위해 증식 분화 퓨즈 계속한다. 융모 영양막 세포의 항상성의 유지 보수는 태아 웰빙과 건강한 임신을 위해 필수적이다. 사실, 융모 trophoblasts는 산소와 영양소의 모체 - 태아의 교환을 허용하고, 임신을위한 필수적인 호르몬을 생산하고 있습니다. 또한,는 syncytiotrophoblast는 모체 혈액 순환과 직접 접촉만을 셀형이며 필수적인 물리적 면역 장벽을 제공한다. 따라서,는 syncytiotrophoblast는 항상성 유지를위한 세포 사멸 및 교체를 받아야하고 AVO하기아이디 태반은 2-5 병리. 인간의 태반에서 차 융모 cytotrophoblasts를 분리하기 위해 1986 년 Kliman 등. (6)에 의해 개발 된이 기술은 융모 영양막 세포의 분화에 관여하는 분자 메커니즘 연구를 허용하여 태반 연구에 혁명을 일으켰습니다. 밀도 원심 분리 미디어에서 분리 한 다음 트립신과 DNase를 순차적 효소 digestions에 따라이 고전적인 기술은, (콜로 이달 실리카 입자는 폴리 비닐 피 롤리 돈에 의해 코팅, 또는 퍼콜)는 지금 융모 cytotrophoblast 세포를 분리하기위한 황금 표준으로 인식하고 있습니다. 이 기술은 자기 immunopurification, 이들 세포의 표면에 특이 항원의 발현 차이에 기초하여 비 융모 세포 융모 cytotrophoblasts 분리 절차에 의해 최적화 될 수있다. 우리 때문에 융모 membran 세포에 발현의 부재에 사람 백혈구 항원 ABC (HLA-ABC)를 선택한전자 7, 8. 태반은 임신 중 산소 수준에 극적인 변화를 겪는다 기관이다. 임신 초기에, 산소 비율은 생리 매우 낮음 (2 % O 2) 그러나 두 번째 및 세 번째 임신에서 산소화 온화한 수준 (8 % O 2)로 증가한다. 툴리 등. (9)는 태반 융모 내부 영양막 환경 시험 관내 재생 산소화 수준의 도전 및 변형도 표현형 변화를 초래할 수 있음을 설명했다. 따라서, 임신 8,9의 세 번째 임신시 태반 융모에있는 산소 장력을 모방 normoxia로 8 % 산소를 도입하는 것을 제안한다. Chen 등. (10)는 광범위 영양막 세포 배양 산소 장력과 관련된 여러 변수를 검토하고 pericellular 환경에서의 산소 농도를 결정하는 중요성을 입증 하였다. 융모의 산소 농도가 증가하는 경향혈관 생성에 기인. 계속 태반 융모 증가 혈류량과 과산화수소의 수준 (풍부한 반응성 산소 종) 혈관 형성 (11, 12)을 제어하는 중요한 신호이다. 임신 합병증, 혈관 생성의 결핍은 저산소증, 더욱 중요한 것은, 산소 간헐적 변동 (호출 저산소증 / 재산 소화)를 생성한다. 이러한 조건은 태반과 태아의 생존 13,14 타협 산화 스트레스의 비정상적인 증가로 이어집니다. 융모 cytotrophoblasts 그들이는 syncytiotrophoblast로 분화 될 때까지 정상 산소 상태 (8 % O 2)에서 유지되는 다음과 같이 영양막 세포가 저산소증 / 재산 소화의 에피소드 중 생체 내에서 받아야 변화는 시험 관내에서 모방 할 수 있습니다. 그들은 다음 normoxia (재산 소화)의 추가 18 시간 뒤에, 4 시간 동안 저산소 조건 (0.5 % O 2)을 실시한다. 이 저산소증 / 재산 소화 방식을 사용하여, 예를 trophoblasts특정 임신 합병증에서 관찰 된 바와 같이, 하이드 록시 에틸는, 산화 환원 상태 및 고유 세포 사멸 (8)의 증가 수준을 규제 완화. 따라서, 이는 태반 저산소증 / 재산 소화와 관련 임신 합병증을 방지하기 위해 새로운 예방 및 치료 방법을 평가하기 위해 시험 관내 모델에서 유용하다. 태반 세포는 산화 스트레스와 태반 기능 부전 (15)를 미연에 방지 할 수있는 능력 등 여러 가지 중요한 기능을 가지고 멜라토닌을 생산하고 있습니다. 여기, 우리는, 분자 세포 및 기능 수준 8시 태반의 영양막 세포에서 멜라토닌의 보호 효과를 입증하는 데 사용되는 실험 방법 및 세포 모델을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Curved Metzenbaum Scissors</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td></tr><tr><td>Splinter Forceps Fine 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td></tr><tr><td>Scissors 4.5 Str Dissection</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>surgical equipment (cell isolation) (2 units)</td></tr><tr><td>Gauze Sponge 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td>361020733</td><td></td></tr><tr><td>Oblong Glass Baking Dish</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>Glassware (2.8 L)</td></tr><tr><td>Funnel Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Glassware (114 mm diameter)</td></tr><tr><td>Watch Glass&amp;nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Glassware</td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>histological tissue fixative solution</td></tr><tr><td>Trypsinizing Flasks</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>Glassware (1 unit)</td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Glassware</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>Glassware</td></tr><tr><td>250 ml Glass Beakers</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td>Glassware</td></tr><tr><td>Glass Media Bottles With Cap</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Glassware (8 units)</td></tr><tr><td>50 ml Corex Tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 unit)</td></tr><tr><td>15 ml Polystyrene Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polystyrene Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological Pipet</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &amp;mu;m Nylon</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Absorbant Liner</td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&amp;nbsp;ml Bottles Top Filter</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore: 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m / medium and HBSS preparation</td></tr><tr><td>2 ml Criogenic Vials</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 model</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Fisher</td><td>Model 127</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Saline solution 0.9%</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Buffered Salt Solution (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Quantity: 9.25 (one vial) for 1 L of digestion solution</td></tr><tr><td>Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes)</td><td>&lt;a name=&quot;RANGE!B29&quot;&gt;Life Technologies&lt;/a&gt;</td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) for 1 L of digestion solution</td></tr><tr><td>Trypsin Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9,888 U</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease Type Iv</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402,000 U</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Sulphate</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Density centrifugation media gradient. Volume: 36 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Magnetic Separator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Model 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&amp;nbsp;Columns&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Running Buffer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Automacs Rinsing Solution&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>anti-mouse antibody</td></tr><tr><td>Anti Mouse Igg Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>Multiple Well Plate -&amp;nbsp; 6 Well With Lid</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Cell Bind surface</td></tr><tr><td>Multiple Well Plate -&amp;nbsp; 24 Well With Lid</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Cell Bind surface</td></tr><tr><td>Multiple Well Plate -&amp;nbsp; 96 Well With Lid</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Cell Bind surface</td></tr><tr><td>Modular Incubator Chamber&amp;nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions</td></tr><tr><td>Single Flow Meter</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>50 mm In-Line Filter</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, pore: 1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Gas Regulator</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions</td></tr><tr><td>Gas Hose Class Vi Clear 5/16&amp;nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 pieces with ~ 0.5 m</td></tr><tr><td>17 mm Adjustable Gas Hose Clamp</td><td>Tiewraps</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Normoxia Gas Cylinder&amp;nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Size K (3&lt;sup&gt;rd&lt;/sup&gt; trimester&#039;s composition: 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 8% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, Bal. N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Normoxia Gas Cylinder&amp;nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Size K (3&lt;sup&gt;rd&lt;/sup&gt; trimester&#039;s composition: 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, Bal. N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Oxygen Microelectrode Mi-730</td><td>Microelectrodes INC</td><td>84477</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Adapter</td><td>Microelectrodes INC</td><td>3572</td><td></td></tr><tr><td>ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-hCG ELISA kit&amp;nbsp;</td><td>DRG internatinal</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin purified antibody</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Host: mouse</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Host: mouse</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&amp;amp;L antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

human primary trophoblast cell culture model to study the protective effects of melatonin against hypoxia/reoxygenation-induced disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

질식 분만에 의해 얻어진 일반 용어 태반에서 분리 및 융모 cytotrophoblast 세포의 immunopurification 1 × 10 8 가능한 세포를 얻었다. 태반은 350g 무게 원반 모양과 투명 막에 4cm 높이 직경 19cm였다. 더 자엽 기형은 발견되지 않았다. 탯줄은 paracentral 현지화 및 56cm의 길이를 가지고 있었다. 순도는 멘틴 및 사이토 케라틴-7 마커를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 평가되었?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption at JoVE.com

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

인간의 기본 영양막 세포 멜라토닌에 대해 저산소증의 보호 효과를 연구하기 위해 세포 배양 모델 / 재산 소화에 의한 혼란

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

human-primary-trophoblast-cell-culture-model-to-study-protective

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.8K 조회수.  INRS-Institut Armand-Frappier. This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

비디오: Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

생체공학

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

발생학

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

생물학

Translational 3D-Cell Culture Model to Assess Hyperoxia Effects on Human Neonatal Airway Epithelial Cells

The preterm neonatal airway epithelium is constantly exposed to environmental stressors. One of these stressors in neonates with lung disease includes oxygen (O2) tension higher than the ambient atmosphere - termed hyperoxia (&gt;21% O2). The effect of hyperoxia on the airway depends on various factors, including the developmental stage of the airway, the degree of hyperoxia, and the duration of exposure, with variable exposures potentially leading to unique phenotypes. While there has been extensive research on the effect of hyperoxia on neonatal lung alveolarization and airway hyperreactivity, little is known about the short and long-term underlying effect of hyperoxia on human neonatal airway epithelial cells. A major reason for this is the scarcity of an effective in vitro model to study human neonatal airway epithelial development and function. Here, we describe a method for isolating and expanding human neonatal tracheal airway epithelial cells (nTAECs) utilizing human neonatal tracheal aspirates and culturing these cells in air-liquid interface (ALI) culture. We demonstrate that nTAECs form a mature polarized cell-monolayer in ALI culture and undergo mucociliary differentiation. We also present a method for moderate hyperoxia exposure of the cell monolayer in ALI culture using a specialized incubator. Additionally, we describe an assay to measure cellular oxidative stress following hyperoxia exposure in ALI culture using fluorescent quantification, which confirms that moderate hyperoxia exposure induces cellular oxidative stress but does not cause significant cell membrane damage or apoptosis. This model can potentially be used to simulate clinically relevant hyperoxia exposure encountered by neonatal airways in the Neonatal Intensive Care Unit (NICU) and used to study the short and long-lasting effects of O2 on neonatal airway epithelial programming. Studies using this model could be utilized to explore ways to mitigate early-life oxidative injury to developing airways, which is implicated in the development of long-term airway diseases in former premature infants.

We describe a protocol to establish an air-liquid interface (ALI) culture model utilizing neonatal tracheal airway epithelial cells (nTAEC) and perform physiologically relevant hyperoxia exposure to study the effect of atmospheric-induced oxidative stress on cells derived from the developing neonatal airway surface epithelium.

The preterm neonatal airway epithelium is constantly exposed to environmental stressors. One of these stressors in neonates with lung disease includes ...

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

기본 마우스 Trophoblast 셀 및 Trophoblast의 침략 분석의 절연

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

의학

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.