이 작품은 우리는 원고의 중요한 읽기 알렘 Giorgis 감사 CHS에 GTEC (2731336 및 1411318)는 NIH (K01DK081351)와 NSF (1354837)에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

Zebrafish의 제기 및 기술 기관 동물 관리 및 사용위원회의 조지아 연구소의 승인을 국민 건강의 연구소와의 기준을 충족하는 표준 프로토콜을 사용하여 사육 하였다. 솔루션 1. 준비 <ol><li> 배아 / 애벌레 제브라 피쉬를 유지하기 위해 (상호 교환 &#39;배아 매체&#39;와 함께 사용) 20 L 계란 물을 준비합니다. 증류수 250 ml의 1.5 g CASO 4, 6 g 즉시 바다 바다 소금을 녹여. 20 L 증류수와 선동으로 가득 찬 상자 속에 든 대형 유리 병에 붓는다. </li><li> 1 L 준비 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU) 스톡 용액 (20 배). 1 L 증류수에 0.6 g의 PTU 분말을 녹여. 작업 용액 0.003 %의 최종 농도로 20 ml의 배아 매체 당 스톡 용액 1 ㎖를 추가한다. 주의 : PTU는 흡입 또는 피부 노출 다음 전신 독성을 일으킬 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 1 L의 에틸 3- aminobe 준비nzoate 메탄 (Tricaine) 원액 (20 배). 증류수에 4g의 Tricaine 분말을 녹여. 1 M 트리스 완충액 (pH 9)을 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 증류수 1 L에 최종 부피를 가져온다. -20 ℃에서 50 ㎖로 나누어 저장. 사용하기 전에 해동. 주의 : Tricaine는 감각의 손실을 유도 할 수있다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 100 ml의 애벌레 메트로니다졸 (MTZ) 작업 솔루션을 준비합니다. 100 ㎖의 배지에서 배아 0.1 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 0.25 g의 MTZ 분말을 용해시켜 신선한 MTZ 15mM의 용액을 만든다. 격렬한 흔들림에 의해 완전히 MTZ 분말을 녹여. 신선한 MTZ 용액을 만들고 MTZ의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 박을 사용한다. 주의 : MTZ는 자극의 원인이 될 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 100 ml의 유충 에탄올 / 메트로니다졸 (EtOH로 / MTZ) 작업 솔루션을 준비합니다. 신선한 MTZ 용액을 광촉매 드 않도록 알루미늄 호일을 사용MTZ의 그라데이션. 사용 직전 1.5 %의 최종 농도로 100 ml의 MTZ 용액에 1.5 ml의 100 % 에탄올을 추가한다. </li><li> 500 ml의 성인 MTZ 작업 솔루션을 준비합니다. 500 ml의 시스템을 물에 0.1 % DMSO에 0.83 g의 MTZ 분말을 용해하여 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을합니다. 격렬한 흔들림에 의해 완전히 MTZ 분말을 녹여. 신선한 MTZ 용액을 만들고 MTZ의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 박을 사용한다. </li><li> 1 L PEM 버퍼를 준비합니다. 30.2 g 파이프, 0.74 g의 EGTA, 0.12 g의 증류수에 황산을 녹인다. NaOH를 사용하여 pH 7을 조정합니다. 증류수 1 L에 최종 볼륨을 가져와. </li></ol> 애벌레 Zebrafish의 2. 준비 <ol><li> [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 설정 결합 GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] TG (hand2 : EGFP)와 15,17 성인 제브라 피쉬는 짝짓기 탱크 (13) 성인 제브라 피쉬를 PD24. 시간 제한 짝짓기를 수행하는 디바이더를 사용합니다. </li><li> 는 D를 제거다음 아침 ivider 것은 물고기가 중단없이 짝짓기를 할 수 있습니다. 2 시간 후 시스템 물 긴장과 배아 매체와 100mm 배양 접시에 배아를 전송하여 수확 배아. </li><li> 페트리 접시 당에는 100 개 이상의 배아를 보관하십시오. 실체 현미경에서 유리 피펫을 사용하여 미 수정 난자를 제거합니다. 28 ° C에서 배아 성장 및 안료 개발을 억제 10 시간-후 수정 (HPF) 후 0.003 %의 최종 농도 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)를 추가합니다. </li></ol> 애벌레 Zebrafish의 3. 에탄올, 메트로니다졸 치료 및 간 재생 <ol><li> 1.5 %의 최종 농도로 배아 매체에 에탄올을 첨가하여 신선한의 EtOH 용액을 제조 하였다. PTU를 추가하지 마십시오. </li><li> 56 80 HPF에 페트리 접시 당 20 ml의 에탄올 용액으로 배아를 취급합니다. 에탄올의 증발을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 배양 접시를 커버. </li><li> 정렬 아웃 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11 </SUP&gt;; TG (hand2 : EGFP) 80 HPF에서, CFP의 식에 의해 결정되는 비슷한 간 크기 PD24] 애벌레. EtOH로 처리 된 애벌레를 정렬 할 때이 이후의 EtOH / MTZ 처리와 높은 사망률의 원인이되므로 Tricaine을 사용하지 마십시오. 페트리 접시 당 30 배아의 밀도로 정렬 된 유충을 유지합니다. </li><li> 0.1 % DMSO에 배아 매체에 신선한 15 mM의 MTZ를 준비합니다. 1.5 %의 최종 농도를 만들어 MTZ 용액에 적당량의 EtOH를 추가한다. 28 ° C에서 24 시간 동안 배양 접시 당 20 ㎖의 EtOH / MTZ 솔루션의 애벌레를 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 EtOH로 농도와 알루미늄 호일로를 유지하기 위해 플라스틱 포장으로 배양 접시를 커버. </li><li> 처리의 끝에서, 신선한 배아 매체 새로운 배양 접시에 애벌레를 전송하여를 EtOH / MTZ 용액을 제거한다. 배아 매체와 유충을 3 회 세척하고 PTU없이 20 ㎖ 배아 매체에 보관하십시오. </li><li> 형광을 관찰, 간세포의 거의 완전한 제거와 유충을 정렬하려면80X의 배율에서 CFP 필터와 표면 형광 현미경. 간에서 최소한의 CFP 형광의 성공적인 절제의 결과와 크게 감소 간 볼륨. </li><li> 의 EtOH / MTZ 처리 유충의 죽음을 방지하기 위해, 정렬 Tricaine을 사용하지 마십시오. 면역 염색의 유충을 수정 (5 장 참조) 또는 추가 분석을 위해 28 ° C에서 배양 접시에 정렬 된 유충을 유지합니다. </li></ol> EtOH로 / MTZ 처리 애벌레 Zebrafish의 4. 화학 화면 <ol><li> DMSO에 10 밀리미터에게 화학 주식을 포함하는 96 웰 플레이트를 가지고 ° C의 냉동고에서 -80 (상용 화학 라이브러리에 대한 자세한 내용은 재료 목록 참조). 화학 물질의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 커버. 부드러운 락으로 실온에서 재고 솔루션을 녹여. </li><li> 96 웰 플레이트에서 50 μM (최종 농도 배아 배지 10 mM의 스톡 용액을 희석 한 약액을 조제 : 초기들creen; 1.5 ml의 튜브 : 재시험). 제어 유충은 배아 매체에서 DMSO의 동일한 농도로 처리 하였다. </li><li> 중 96 웰 (초기 화면)에, 1.5 %의 EtOH / 15 mM의 MTZ로 처리하고 전술로 분류 된 거의 완전한 간세포 절제, 또는 24 웰와 전송 유충 (재시험) 판의 밀도로 배아 매체로 채워져 물론 당 5 애벌레. 각 화학 물질에 대해 중복 우물을 사용합니다. </li><li> 배아 매체를 제거하고 250 μL (96 웰 플레이트) 또는 각 웰에 500 μL (24 웰 플레이트) 화학 솔루션 중 하나를 추가 할 수 있습니다. 알루미늄 호일 커버 플레이트 및 28 ° C에서 50 시간 동안 유충을 취급합니다. 매일 화학 몸을 담글 유충을 검사하고 개별 우물에서 죽은 유충을 제거합니다. </li><li> 화학 처리의 끝에서, 80X의 배율로 CFP 필터와 표면 형광 현미경 CFP 발현 간세포의 수 및 / 또는 강도를 관찰한다. 사진 라이브 애벌레를 보여주는 향상 또는 감소D 번호 및 / 또는 기록을 위해 디지털 카메라와 CFP 발현 간세포의 강도. </li><li> 섹션 5에 설명 된대로 공 촛점 이미징을위한 포름 알데히드 고정하여 유충을 보존합니다. </li><li> 초기 화면에서 간세포 재생을 촉진 화학 물질을 다시 테스트하기 위해, 4.1-4.5 ( &#39;재시험&#39;)에 설명 된 절차에 가장 효과적인 농도를 찾기 위해 더 낮은 농도에서 자신의 힘을 확인합니다. </li></ol> 5. 애벌레 Zebrafish의 고정, 면역 염색 및 공 촛점 이미징 <ol><li> 0.02 %의 최종 농도로 첨가하여 Tricaine 유충 마취. 1.5 ㎖의 튜브에 10-15 유충을 전송하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세척 하였다. PBS를 제거하고 4 ℃에서 O / N를 해결하기 위해 PEM 버퍼에 새로 제조 된 2 %의 포름 알데히드 1 ㎖를 추가합니다. 주의 : 포름 알데히드가 자극을 원인과 인간 발암 물질로 알려져있다. 화학 흄 후드에서 처리합니다. </li><li> 워싱턴 제대로하고 솔루션을 고정 폐기RT에서 PBS와 SH 3 번. 고정 유충 수일까지 4 ℃에서 PBS에 보관 될 수있다. 다음 단계로 진행 즉시 면역 더 나은 결과를 제공한다. </li><li> 조심스럽게 실체 현미경 하에서 # 55 집게를 사용하여 간 영역을 다루는 노른자 피부를 제거합니다. </li><li> Permeabilize 하시려면 및 블록 버퍼 블록 유충 (4 % 소 혈청 알부민 0.3 % PBS에 트리톤 X-100) O / N 4 ° C에서. </li><li> 1의 희석에 토끼 항 - 콜라겐 I 항체와 함께 품어 : (100)를 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 버퍼 (PBS에서 0.3 % 트리톤 X-100)를 15 분마다 5 회 반복한다. </li><li> 1의 희석에 AlexaFluor와 647 복합 당나귀 항 - 토끼 항체를 품어 : 200 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 버퍼와 15 분마다 5 회 반복한다. 그 후 PBS로 한번 씻어. </li><li> 조심스럽게 왼쪽 측면이 위를 향하도록 유리 피펫 및 동양 고정 애벌레를 사용하여 유리 슬라이드에 애벌레를 전송합니다. 초과 PBS 사용하여 매직 잉크를 킴 와이프를 제거합니다. 장착 미디어 방울을 추가매니큐어와 및 밀봉 용 커버 유리. 실시 공 촛점 영상은 즉시 매우 좋습니다. </li><li> 이미지를 캡처하는 40X / 1.3 오일 렌즈가 장착 된 공 초점 시스템을 사용합니다. 20-50%에서 레이저 강도를 사용합니다. 1 ㎛ 간격으로 Z 스택 이미지를 캡처합니다. </li></ol> 성인 Zebrafish의 6. 준비 <ol><li> [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 설정 결합 GT1; TG : 상대 탱크 (TP1 mCherry) jh11] 15,17 성인 제브라 피쉬. 수확 시스템 물 긴장과 배아 매체와 100mm 배양 접시에 배아를 전송하여 다음 날 아침 배아. </li><li> 페트리 접시 당에는 100 개 이상의 배아를 보관하십시오. 실체 현미경에서 유리 피펫을 사용하여 미 수정 난자를 제거합니다. 28 ° C에서 배아 성장 및 안료 개발을 억제하기 위해 10 HPF 후 0.003 %의 최종 농도 PTU를 추가합니다. </li><li> 4 DPF에서 애벌레를 마취하고 분류하는 Tricaine를 사용하여 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] 애벌레. 신선한 배아 매체를 여러 번 변경하여 Tricaine을 씻으십시오. 그들이 분 18 당 120-180 비트의 정상적인 심장 박동을 달성 할 때까지 애벌레가 28 ° C에서 복구 할 수 있습니다. </li><li> 표준 절차 (19)에 따라 6-12개월 이전에 정렬 된 유충을 올립니다. </li></ol> 성인 Zebrafish의 7. 에탄올, 메트로니다졸 치료 및 간 재생 <ol><li> 6~12개월 된 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)로 이동 GT1을; TG : 그물을 사용하여 상대 탱크 (TP1 mCherry) jh11] 성인 제브라 피쉬. 탱크 당 10 개 이상의 물고기의 밀도로 물고기를 유지합니다. </li><li> 1 %의 최종 농도 시스템 물을 EtOH을 첨가하여 신선한의 EtOH 용액을 제조 하였다. 각 탱크에 500 ml의 EtOH를 용액으로 성인 물고기를 치료하고 28 ° C 배양기에서 그들을 유지합니다. </li><li> 매일 신선한 EtOH로 솔루션에 전송 성인 물고기, 폐기 죽은 물고기 소품생물 학적으로 지함. 지속적으로 MTZ 처리하기 전에 72 시간 동안 동물을 취급합니다. </li><li> 0.1 % DMSO의 시스템 물에 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을 준비합니다. 28 ° C를 인큐베이터에서 MTZ 솔루션을 미리 따뜻하게. 28 ° C에서 8 시간 동안 1 L 횡단 탱크에서 500 ml의 MTZ 솔루션으로 물고기를 치료 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다. </li><li> 치료 기간 동안 매 시간 관찰하고 즉시 죽은 물고기를 제거합니다. 생물 학적으로 제대로 죽은 물고기를 폐기하십시오. MTZ 처리의 끝에서 두 시스템 신선한 물 동물 전사함으로써 MTZ 씻어. </li><li> 동물이 28 ° C에서 인큐베이터에서 회복하고 유지 할 수 있습니다. 피드 및 분석을위한 시점까지 매일 신선한 시스템 물에 물고기를 전송합니다. </li></ol> 8. 성인 Zebrafish의 간 고정, 면역 염색 및 공 촛점 이미징 <ol><li> 0.02 % Tricaine와 성인 물고기를 마취하고 15 분 동안 얼음 물에 안락사. 팻 물고기 종이 타월에 건조하고 해부 매트에 놓습니다. </li><li> 이전으로 피부와 근육을 제거하여 위장 기관을 노출 20을 설명했다. 항문 지느러미로 다시 후방 물고기의 측면을 따라 다음 아가미에 뒷 지느러미에서 배를 따라 피부와 기본 근육을 잘라 가위를 사용합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 물고기를 넣고 PBS로 한번 씻어. PBS를 제거하고 4 ℃에서 O / N를 해결하기 위해 PEM 버퍼에 새로 제조 된 2 %의 포름 알데히드의 4를 가하여. </li><li> 제대로 솔루션을 고정 폐기하고, RT에서 PBS로 3 회 세척한다. 고정 된 샘플은 수일 동안 4 ℃에서 PBS에 보관 될 수있다. 다음 단계로 진행하기 바로 면역 더 나은 결과를 제공한다. </li><li> 식도를 잘라 물고기의 체강 내에서 간과 전체 장 해부. 4 %가 절편 금형에 아가로 오스 저 융점와 위장 기관을 포함. </li><li> 앞쪽 끝에서 시작하여 얼음 차가운 PBS에 50 μm의 간격으로 가로 섹션으로 샘플을 잘라 vibratome를 사용합니다. 초 이동A # 1 페인트 브러시를 사용하여 PBS 6 웰 플레이트에 TIONS. </li><li> Permeabilize 하시려면 및 블록 버퍼 O에서 블록 섹션 / N 4 ° C에서. </li><li> 1의 희석에 토끼 항 - 콜라겐 I 항체와 함께 품어 : (100)를 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 5 회, 15 분 세척 버퍼와 각을 씻으십시오. </li><li> 1의 희석에 AlexaFluor와 647 복합 당나귀 항 - 토끼 항체를 품어 : 200 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 완충액으로 한 번 PBS로 5 회, 15 분 각각을 씻으십시오. </li><li> 조심스럽게 # 1 페인트 브러시를 사용하여 유리 슬라이드에 섹션을 전송합니다. , 매직 잉크를 킴 와이프를 사용하여 여분의 PBS를 제거 설치 미디어의 한 방울을 추가하고, 매니큐어와 인감 커버 유리. 실시 공 촛점 영상은 즉시 매우 좋습니다. </li><li> 이미지를 캡처하는 40X / 1.3 오일 렌즈가 장착 된 공 초점 시스템을 사용합니다. 20-50%에서 레이저 강도를 사용합니다. 1 ㎛ 간격으로 Z 스택 이미지를 캡처합니다. </li></ol>

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</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 심지어 내가 콜라겐 섬유의 유형을 포함하여 ECM 단백질의 상당한 양의 존재의의 HPC가 간세포로 재생하기 위해 자신의 역량을 유지하는 것이 시사의 EtOH / MTZ 처리 복구 간에서 HPC 매개 간세포의 재생을 관찰했다. 의 EtOH 만 처리는 HPC 활성화 (15)를 유도하지 않은 반면, MTZ 전용 치료는 크게 ECM 단백질의 침착을 증가하지 않았다. 조합의 EtOH / MTZ 처리를 이용하여, 우리는 섬유 성 간에...

간 실질 주요 세포 타입 간세포 하나의 놀라운 재생 능력에도 불구하고, 만성 간부전 간장 전구 세포 (HPC) 의존성이 재생 선도,이 능력을 손상시킨다. 만성 간 손상은 주로 알코올 남용, 만성 C 형 간염 바이러스 (HCV) 감염 (3) 및 비 - 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD) (4)로부터 유도된다. 이 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 축적과 연관되어 유지 간 섬유증으로 이끈다. 지속 ECM 축적 이후 높은 이환율과 사망률과 간경변의 결과로, 섬유 반흔 조직 (5)을 형성하여 그대로 간 구조를 왜곡. 많은 시도가 profibrogenic 사이토 카인 활성을 억제 근섬유 6에 초점을 주로 섬유 성 반응을 완화하기 위해 이루어졌다. 후자는 주로 H (간 성상 세포에서 유래희주), 간 흉터 형성 (4)에 대한 책임 원칙 간 비 실질 세포. 그럼에도 불구하고, 지속적인 폐의 섬유 성 모욕의 존재 간세포를 재생하는 HPC의 등 내인성 세포 소스를 자극 재생 치료법은 추가 조사를 기다리고 있습니다. 간 섬유화 많은 실험 모델은 포유류에 기재되어있다. 사염화탄소 (사염화탄소)의 반복적 인 주입 널리 뮤린 및 래트 모델 7 간 섬유화를 유도하는 데 사용되어왔다. 높은 지방 (HF)식이 요법과 함께 사용하면 알코올 profibrogenic 유전자 발현 및 간 섬유화 (8)의 실질적인 상향 조절되었다. 지방증 (지질 축적) 급성 알코올 노출의 결과이지만, 더 심각한 간 손상에 취약 9 간을 만든다. 제브라 피쉬, 다니오 레 리오는 재생 연구를위한 귀중한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 그래도이러한 도롱뇽과 axolotls 같은 다른 낮은 척추 동물은 제브라 피쉬는 잠재적 인 재생을 조작하는 데 필요한 유전자 조작 및 시각화 전략에 관해서 다른 모델 시스템에 비해 장점이 있습니다 (10) 요인, 재생에 놀라운 능력을 가지고있다. 제브라 피쉬는 단순히 물에 에탄올 (EtOH로)를 추가하여 알코올성 간 질환 (ALD)을 연구하는 매력적인 척추 동물 모델을 나타냅니다. 애벌레와 성인 제브라 피쉬에 급성 EtOH로 노출 간 지방증 11-13 발생했습니다. 성인 지브라 피쉬가 확장을 EtOH 노출을 수신하면, 콜라겐 침착은 섬유증 관련 유전자 (14)의 상향 조절을 관찰 하였다. 그러나, 필요는 폐의 섬유 자극 등의 EtOH에 응답 간 재생을 연구 모델의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 최근에는 제브라 15에서 EtOH로 인한 간 섬유화 모델을 개발 하였다. 우리는 애벌레 및 adul에 EtOH로 처리와 간세포 특이 유전자 제거 시스템을 결합t의 제브라 피쉬. 우리가 두 개의 형질 전환 라인을 생성, Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1, Tg 및 (fabp10a : mCherry-NTR) GT2, 대장균 nitroreductase (NTR)의 제어하에 각각 시안 mCherry 형광 단백질에 융합 된 단백질 10A, 간 기본 (fabp10a) 프로모터 바인딩 간세포 특이 지방산. 이 시스템에서, NTR은 간세포의 명시 적 죽음을 유도하는 DNA 간 가닥 가교제 (16)로 독성 전구 약물 메트로니다졸 (MTZ)을 변환합니다. 이 모델을 사용하여, 우리는 노치 신호 전달에 반응하는 간 세포의 집단은 간세포의 근처에 부재와 ECM의 초과 간세포로 변환하는 것이 보였다. 우리는 HPC의 이러한 세포를 지정. 또한, 화학 화면을 통해, 우리는 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 증가 작은 분자 Wnt 신호의 활성화 및 노치 신호 전달의 억제를 확인 하였다. Therefo다시는 제브라 피쉬에서 우리의 섬유 성 간 모델은 셀 문화 - 또는 포유류 기반 검사 시스템에 비해 뛰어난 화학 검사 시스템을 나타냅니다. 그것은 상당한 비용과 시간을 절약 혜택을 생체 시스템입니다. 여기에서 우리는 EtOH로 유도 된 섬유 성 간 모델을 확립하고 제브라 피쉬에서이 모델을 사용하여 화학 화면을 수행하기위한 세부 절차에 대해 설명합니다. 또한, 시간 코스 분석은 섬유 성 간에서 발생하는 방법 간세포 재생 조사를 실시 하였다. 이 프로토콜은 메커니즘과 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 향상시키는 전략을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Calcium sulfate hemihydrate (CaSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-&lt;br /&gt;&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablet</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>Dissolve one tablet with 100 ml distilled water</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Signaling Compound Library</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K Library</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Dissolve with DMSO to 10&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Dissolve with DMSO to 10&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Anti-Collagen I antibody</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Molecular Probes</td><td>A31573</td><td>Use at 1:200 for immunostaining</td></tr><tr><td>Mounting media (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Plastic wrap</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoresence microscope</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Confocol microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an ethanol-induced fibrotic liver model in zebrafish to study progenitor cell-mediated hepatocyte regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

도 1은 유충 지브라 피쉬의 EtOH로 인한 간 섬유화 모델의 개발을 도시한다. 의 EtOH에 제브라 피쉬 애벌레를 노출 프로토콜을 최적화하기 위해, 우리는 먼저 EtOH로 독성을 평가 하였다. 2.5 일 후 - 수정 (DPF) 유충은 동시 24 시간을 EtOH / MTZ 처리 한 다음 24 시간 동안 EtOH 중 농도 1 %, 1.5 %, 2 %를 노출시켰다. 거의 모든 애벌레 콜라겐 등 세포 외 기질 단백질의 희귀 증...

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Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K 조회수.  Georgia Institute of Technology. Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. 

비디오: Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

연구

발생학

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

의학

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

암 연구학

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies and neurological impairments. With a complex pathology, FASD affects approximately 1 in 100 children born in the United States each year. Due to the highly variable nature of FASD, animal models have proven critical in our current mechanistic understanding of ethanol-induced development defects. An increasing number of laboratories has focused on using zebrafish to examine ethanol-induced developmental defects. Zebrafish produce large numbers of externally fertilized, genetically tractable, translucent embryos. This allows researchers to precisely control timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts and quantify the impact of embryonic ethanol exposure through live imaging techniques. This, combined with the high degree of conservation of both genetics and development with humans, has proven zebrafish to be a powerful model in which to study the mechanistic basis of ethanol teratogenicity. However, ethanol exposure regimens have varied between different zebrafish studies, which has confounded the interpretation of zebrafish data across these studies. Here is a protocol to quantify ethanol concentrations in zebrafish embryos using head space gas chromatography.

This work describes a protocol to quantify ethanol levels in a zebrafish embryo using head space gas chromatography from proper exposure methods to embryo processing and ethanol analysis.

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Zebrafish Tol2 시스템: 유연한 모듈식 게이트웨이 기반 트랜스제네시스 접근 방식

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

<meta charset="utf8"></head><body>재생 및 개발 연구를 위한 강력한 제브라피시 세포 이식

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 발달 및 재생 중 제브라피시 신경계의 세포 연결성 매핑

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

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배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

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