이 프로토콜은 제브라피시 배아 를 개발하는 에탄올의 약동학을 이해하는 데 도움이되며 이것은 제브라피시 연구에서 에탄올 노출 정권을 표준화하는 데 도움이 되기 때문에 중요합니다. 우리의 기술의 주요 장점은 연구원이 배아 발달 도중 에탄올 수준을 신속하고 재현적으로 측정할 수 있다는 것입니다, 특히 혈액 공급이 유효하지 않는 태아에서. 이 방법은 적절한 기술 및 장비 설정을 가정하는 다른 환경 요인뿐만 아니라 다른 모델 시스템에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
나는 태아 처리 도중 에탄올 증발을 방지하는 데 필요한 속도로 투쟁하기 위하여 처음으로 이 프로토콜을 능력을 발휘하는 개별을 기대할 것입니다. 250 마이크로리터의 부피에서 라인으로 표시된 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 여분의 배아 액을 가진 10개의 배아를 이송하는 것으로 시작합니다. 채우기 라인에 물을 추가합니다.
비반향 샘플을 위해 추가 미세 원심 분리튜브를 준비하십시오. 초리온을 제거하려면 배아를 10분 동안 배아 매체에 밀리리터 당 2밀리그램의 페트리 접시에 배아를 배양합니다. 몇 분마다 부드럽게 접시를 소용돌이어 초리온을 깨뜨린다.
모든 배아가 초리온이 없는 후에는 프로테아제 칵테일에서 제거하고 신선한 매체로 두 번 씻으시다. 그런 다음 배아를 신선한 100밀리미터 접시로 옮기습니다. 모든 시료가 부피 측정준비가 되면, 배아 주위의 모든 액체를 주의 깊게 제거하기 위해 가능한 가장 작은 팁이 있는 P200 마이크로파이프를 사용하십시오.
0.1 밀리그램 이하의 정밀도로 수량을 계량한 다음 250 마이크로리터에서 제거된 물의 무게를 빼서 10개의 배아의 부피를 결정합니다. 단일 배아의 부피를 결정하기 위해 차이를 10으로 나눕니다. 짝짓기 탱크에서 배아를 모아 표준 100mm 페트리 접시에 넣은 다음 28.5섭씨로 접시를 배양합니다.
수정 후 6 시간에서, 배아 미디어와 1 % 에탄올 또는 미디어 혼자 새로운 접시에 최대 100 배아를 전송합니다. 뚜껑을 덮지만 페트리 요리를 밀봉하지 않고 18시간 동안 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣거나 수정 후 24시간 까지 보관하십시오. 50 마이크로리터로 설정된 두 개의 P200 마이크로파이펫을 사용하고 프로테아제 칵테일 용액을 하나와 물을 두 번째로 흡인시합니다.
그런 다음 유리 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 10 개의 배아를 신속하게 배치하고 캡을 닫습니다. 모든 샘플을 테스트, 제어 및 에탄올 치료 배아에 대해이 과정을 반복하십시오. 한 번에 하나의 샘플로 작업하여 캡을 빠르게 열고 200 마이크로리터로 설정된 P200 마이크로파이펫으로 모든 잔류 배아 미디어를 흡인합니다.
빠르게 하지만 부드럽게 추가 하 고 물 50 마이크로 리터를 제거, 다음 프로테이즈 칵테일의 50 마이크로 리터를 추가 하 고 튜브 캡을 닫습니다. 샘플이 실온에서 10분 동안 앉아 서염화 나트륨 5개 중 450마이크로리터를 빠르게 추가하고 튜브 캡을 닫습니다. 10분 동안 소용돌이를 통해 시료를 균질화하고 두 개의 초미세먼지를 가스 크로마토그래피 바이알로 이송한다.
바이알을 폴리테트라플루오로틸렌 캡으로 밀봉합니다. 시작 방법을 완료한 후 현재 SPME 에탄올 436개를 로드하여 2~5분 RG 런을 로드합니다. 샘플 목록의 각 샘플에 대한 분석 소프트웨어의 메서드 메뉴에서 메타메타.
공기, 물, 5개의 어금니 나트륨 염화 나트륨 프로테아제 칵테일 블랭크로 시작하여 샘플 목록을 작성합니다. 그런 다음 0.3125에서 40 밀리머까지 순으로 에탄올 표준을 입력합니다. 공백의 두 번째 라운드와 표준을 따르십시오.
모든 균질화 배아 상체 샘플을 입력하여 가장 낮은 에서 가장 높은 예측 에탄올 농도까지 테스트하고 빈칸의 세 번째 라운드를 입력하여 완료합니다. 가스 크로마토그래피 바이알을 자동 샘플러에 추가하여 시료를 입력하고 10~15분 동안 따뜻하게 할 수 있도록 합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 샘플 실행을 시작합니다.
실행이 완료되면 샘플 목록에 최종 샘플을 추가하고 대기.meth를 실행하여 종료 방법을 활성화합니다. 샘플 실행 중에 획득한 모든 데이터를 백업합니다. 종료 방법이 완료되면 열 크로마토그램을 클릭하고 결과와 함께 폴더를 엽니다.
샘플은 이 프로그램에 자동으로 통합됩니다. 결과에서 올바른 피크가 통합되었는지 확인합니다. 모든 샘플이 확인되면 결과를 인쇄하거나 내보냅니다.
그래프에서 에탄올 표준의 피크 높이를 플롯한 다음 경사, y-intercept 및 r 제곱 값을 계산합니다. 표준의 y-intercept에서 샘플의 피크 높이를 빼고 이 값을 표준의 경사로 나누어 각 샘플에 대한 에탄올 값을 가져옵니다. 배아에서 에탄올 농도를 계산하려면 각 샘플에 대한 희석 계수를 계산하고 이 희석 계수에 의해 샘플 에탄올 값을 곱합니다.
마지막으로 미디어 에탄올 값을 10의 희석 계수로 곱하여 미디어 참조 샘플을 계산합니다. 배아 에탄올 농도를 제대로 계산하기 위해, 그들의 초리온에서 배아의 양을 측정하고 그들의 초리온에서 제거되었습니다. 이 분석에서, 태아는 초리온 내부의 총 부피의 56%를 구성하였다.
이전에 발표된 작업을 기반으로, 73.6%는 제시된 모든 분석을 위한 배아 수분 함량으로 사용되었다. 이로 인해 배아 부피의 1.1 마이크로리터의 0.82 마이크로리터를 포함하는 물. 총 물 부피 중 49%는 배아에 함유되어 있으며 51%는 배아 유체에 함유되어 있습니다.
가스 크로마토그래피 분석을 위해, 15개의 샘플과 처리된 매체의 2개의 단이 그룹당 5회 측정되었다는 것을 분석하였다. 미디어 에탄올 수준은 그룹 1용 143.6 밀리몰어, 그룹 2의 경우 133.6 밀리몰러였다. 배아의 에탄올 농도는 각각 63.5 밀리몰러와 53.1 밀리몰러를 각각 1개와 2군으로 측정했다.
각 샘플에 대해 에탄올의 미디어 수준에 배아 에탄올 농도의 비율이 계산되었다. 그룹 1은 미디어 에탄올 레벨의 44%를, 그룹은 미디어 에탄올 레벨의 40%를 차지했다. 처리되지 않은 대조군 배아는 0 밀리몰라 미디어 에탄올 농도로 측정하였다.
이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 에탄올이 휘발성이고 빠르게 증발하기 때문에 GC 분석을 위한 배아를 제대로 처리하는 것이 중요하다는 것입니다. 이 단계를 수행하는 가장 좋은 방법은 설명, 하지만 적절 한 근육 메모리를 개발 하기 위해 연습 해야. 이 절차는 제브라피시의 에탄올 치료 정권을 표준화하고 에탄 테라토겐성의 유전 및 세포 메커니즘을 해부하는 미래의 작업을 허용하는 데 도움이됩니다.
