우리는 Sinai 산에서의 연구 우수성의 Flow Cytometry, Microsurgery 및 Bio-repository / Pathology Centres의 기술적 인 공헌을 인정합니다. 이 연구는 COST Action BM1305의 지원을 받았다. Salli Mount Recanati / Miller Transplantation Institute 발달 기금, Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-R 및 SAF2016-80031-R에 초점을 맞추고 세포 독감 치료법 (A FACTT)을 가속화하는 활동 조

<html> 이 연구에서 쥐는 미국 농무성 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 보건 서비스 안내서의 권고에 따라 보관됩니다. 동물 실험과 관련된 모든 실험 기술은 Mount Sinai School of Medicine의 IACUC (Institutional Animal Care and Utilization Committee) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 미디어 준비 <ol><li> 2 MM L - 글루타민, 1 MM 나트륨 피루 베이트, 0.1 MM 비 필수 아미노산, 5 MM HEPES 및 0.05 MM 2를 사용하여 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (10,000 U / ML)와 완전한 RPMI 1640 매체를 준비 - 머 캅토 에탄올. </li></ol> 2. 동종 이식 및 단일 세포 현탁액 참고 : 폐동맥과 하대 정맥 정맥의 이식 및 문합 기법은 Corry와 공동 작업자에 의해 처음 설명되었으며 Liu &amp; Kang에서 시각화 할 수 있습니다s = &quot;xref&quot;&gt; 10 , 11 ( 그림 1A ). <ol><li> 유도 챔버에서 4-5 % isoflurane으로 이식 마우스를 마취. 자궁 경관 탈구로 희생하십시오. </li><li> 정형 가위로 정중선을 절개하고 대동맥을 국소화하기 위해 복부 내용물을 제거하십시오. 참고 : 이식 된 심장은 복부 대동맥의 오른쪽에 있습니다 ( 그림 1B ). </li><li> 미세한 날카로운 이빨 집게로 이식편을 부드럽게 당겨 즉시 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오. 참고 : 수술 가위를 사용하여 대동맥에서 이식편을 분리하면 이식재가 손상되고 일부 조직이 수혜자에게 달라 붙을 수 있습니다. </li><li> 모든 이식편을 수거 한 후 조직 처리를 위해 멸균 된 문화 후드로 옮깁니다. 페트리 접시에 이식을 배치하고 무균, 무딘, microsurgery 가위를 사용하여 작은 조각 (1mm)로 조직을 주사위. </li><li> 날카로운 이빨을 가진 forc로eps, collagenase A (멸균 1x PBS에 0.1 MG / ML collagenase) 5 ML와 50 ML 튜브에 조각을 전송. 37 ° C 조에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 콜라게나 제를 중화하기 위해 RPMI 배지 5 mL를 넣고 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 100 μm 스트레이너로 시료를 옮긴다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 샘플을 회전 시키십시오. </li><li> 펠릿을 ACK 용해 버퍼 1 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라. </li><li> 용해 완충액을 중화하기 위해 RPMI 배지 1 ML을 추가하고 4시 5 분 400 XG에서 샘플을 회전 ° C. </li><li> RPMI 배지 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다. 참고 : 폴리 프로필렌 튜브는 접착력이 적습니다. 또한 4 ° C와 같은 저온에서 세포를 유지하면 접착력이 감소합니다. </li></ol> 3. 형광 활성화 된 세포를 이용한 이식편 - 침윤성 대 식세포의 분리보내는 <ol><li> Fc 수용체 차단 단클론 항체 (rat ant-mouse CD16 / 32)를 사용하여 골수 세포에서 원하지 않는 특이 적 결합을 차단합니다. 표면 얼룩 15 분 전에 샘플 당 1-2 μL를 추가합니다. </li><li> anti-mouse CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-mouse Ly6C APC (2 μg / μL), anti-mouse CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI 배지에서 0.6 μg / μL 최종 농도) 항 마우스 Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μL). 형광등 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ℃에서 냉장고에 튜브를 잠복니다. 참고 : 단일 얼룩 보정의 경우 네거티브 컨트롤 튜브 (얼룩이 없음)와 각 형광 색소가있는 라벨이 붙은 튜브가있는 튜브를 준비하십시오. 문을 세우는 것을 돕기 위해 isotype 컨트롤은 특히 Ly6C (IgG2a)와 Ly6G (IgG2b)에 사용될 수 있습니다. </li><li> RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. 트리 판 블루 (trypan blue) 및 혈구 세포 (hemocytomete)를 사용하여 세포를 센다.1x10 6 세포 당 RPMI 배지 1 ML에서 희석. 분류하기 전에 샘플을 5 mL, 70 μm 셀 여과기 튜브 캡으로 옮깁니다. 세포 생존률 마커로 DAPI (1 μg / ML)를 추가하고 정렬로 진행합니다. </li><li> 대 식세포는 민감하고 깨지기 쉬운 세포이기 때문에 정렬 조건을 20 psi로 설정하고 100 μm 노즐 크기를 사용하여 4 방향 순도 모드를 사용하여 대 식세포를 분리합니다. </li><li> 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에서 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비합니다. </li><li> 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다. </li><li> 전방 및 측면 산란이 가장 적은 부스러기와 덩어리를 제외한 모든 백혈구의 전방 (FSC) 대 측면 (side) 산란 (SSC) 및 게이트를 표시하는 도트 플롯을 설정합니다. 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다. <ol><li> 새롭게 문을 열 인구에 광고 작성CD11b 대 CD45 및 이중 양성 (CD11b + CD45 + ) 대 식세포 및 호중구의 게이트를 나타내는 플롯. </li><li> 여기에서 Ly6C 대 Ly6G를 표시하는 최종 도트 플롯을 만들고 Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - , Ly6C int Ly6G + 와 같은 바람직한 개체군을 게이트하십시오 ( 그림 2 ). </li></ol></li><li> 분류 후, 순도와 세포 생존률 (&gt; 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan 블루와 hemocytometer를 사용하여 세포를 세고 완전한 RPMI 매체에서 원하는 농도 ( 예 : 1 × 10 6 macrophages / ML)에 그들을 resuspend. </li><li> 완전한 RPMI 배지 100 μL의 최종 부피가있는 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 플레이트 50 x 10 3 개의 대 식세포. 37 ° C와 5 % CO 2 에서 적어도 24 시간 동안 세포를 방해하지 마십시오. </li></ol> 4. Isolatio형광 활성화 된 셀 정렬을 이용한 T 세포의 수 참고 : C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn은 Foxp3 (포크 헤드 박스 P3) 유전자를 표현하는 세포를 단량체 적색 형광 단백질 (mRFP)과 공동 표지하는 X- 연결된 표적 노크 - 인 마우스입니다. <ol><li> 전에 2.1 단계에서 설명한대로 C57BL / 6 및 C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H - 2b) 마우스를 마취하고 희생. 비장과 림프절 (LN : 사타구니, 요추, 축삭, 상완, 자궁 경부)을 분리하고 신속하게 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오. </li><li> LN을 분리하기 위해 마우스를 앙와위에 놓고 정중선 피부를 아래에서 위로 절개하고주의 깊게 복막을 잘라 부드럽게 피부를 벌리십시오. 모든 사타구니, 요추, 겨드랑, 상완, 그리고 자궁 경부 LN ( 그림 1C , 붉은 색)가 수집되면, 복막을 자르고 창자의 왼쪽 상단에서 비장을 분리. </li><li> 배치 된 100 μm 필터를 사용하여 비장 및 LN 분리50 mL 튜브 위에 올려 놓습니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 조심스럽게 누릅니다. 필요할 때까지 RPMI 배지로 필터를 깨끗이 헹굽니다. 참고 : 각 마우스의 LN과 비장은 동일한 튜브에 모아 둘 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운. </li><li> 펠릿을 ACK 용해 버퍼 2 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라. </li><li> 용해 버퍼를 중화하기 위해 2 ML RPMI 매체를 추가합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운. </li><li> RPMI 매체 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 항 마우스 CD4 APC (0.6 μg / μL) 및 / 또는 항 마우스 CD8 PeCy7 (2 μg / μL)에 대한 염색. 빛으로부터 형광 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ° C에서 냉장고에 튜브를 품어 라. 참고 : 단일 얼룩 보정의 경우, 음성 대조 튜브 (얼룩 없음)를 준비하고튜브는 형광 염료의 각각으로 단독으로 라벨이 붙어있다. </li><li> RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 참고 : CFSE 염료는 일반적으로 50 μg에서 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester powder로 제공됩니다. CFSE의 유리 병에 18 μL DMSO를 넣어 최종 보관 용액 5 mM에 저장하고 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> CFSE 라벨을 위해, 주식 솔루션에서 5 μm의 CFSE의 최종 작업 농도에서 PBS에 ML 당 10 6 세포의 농도로 resuspend CD8 염색 세포. 앞서 설명한대로 20 ° C에서 5 분간 배양하십시오. 주의 사항 : (CRITICAL STEP) 저농도 (㎖ 당 ≤10 6 ) 인 세포의 경우 CFSE의 독성 효과를 완충시키기 위해 단백질이 첨가 된 상태에서 세포를 표지해야한다. 따라서, PBS는 5 % FBS를 함유 할 수있다. 나에게dium이 사용되면 유리 아미노산은 CFSE와 경쟁하여 표지 효율을 낮출 수 있습니다. </li><li> 2 mL의 RPMI 배지로 CFSE를 중성화하십시오. 4 ° C에서 5 분간 400 xg에서 스핀. 1 x 106 CD8 T 세포 당 1 mL의 RPMI 배지를 첨가한다. </li><li> 분류하기 전에 샘플을 5 μm 튜브 캡에서 70 μm 셀 여과기로 옮깁니다. 세포 생존 마커로 1xDAPI (1 μg / ML) 50 μL를 추가하고 정렬로 진행합니다. 참고 : 1x는 다른 구성 요소에 대한 시약의 1 : 1 비율을 의미합니다. </li><li> 정렬 조건을 20 psi 및 100 μm 노즐 크기로 설정하여 이중 양성 CD8 + CFSE + T 세포를 분리합니다 ( 그림 3A ). </li><li> 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비하고 정렬로 진행합니다. </li><li> 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다. </li><li> CD4 + T 세포 분리의 경우,수지상 세포와 같은 큰 과립 세포뿐만 아니라 잔해물을 제외한 FSC 대 SSC 및 림프구 게이트를 재생합니다. <ol><li> 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다. </li><li> 새롭게 문이 열어 진 인구에서 모든 CD4 + 세포를 분리하기 위해 SSC 대 CD4를 나타내는 도트 플롯을 만듭니다 ( 그림 3B ). 대안으로, 항 -CD3 단클론 항체를 사용하여 순수한 T 세포 집단의 분리를 보장 할 수있다. 참고 : 모든 CD4 + T 세포의 작은 부분 (5-10 %)은 Foxp3 + mRFP + 이어야합니다. </li></ol></li><li> 분류 후, 순도와 세포 생존률 (&gt; 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 2x10 6 T 세포 당 1 ML의 완전한 RPMI 매체를 사용하여 Resuspend. </li><li> 이전에 정렬 된 macrophages와 T 세포를 배양하여 억제 분석을 설정합니다. 플레이트 10 x 10 4 CD4 + T 및 10 × 10 4 CD8 + CFSE + T 세포를 100 μl의 최종 RPMI 배지에 넣었다. 96 시간 동안 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 배양하십시오. 참고 : 대 식세포와 T 세포는 1 : 4 비율로 사용되었습니다. </li><li> 아 지드 함유 완충액을 제거하기 전에 T 세포 활성제 CD3 / CD28 자석 구슬을 PBS 2mL로 세척하여 T 세포 분열을 자극합니다. 우물 당 마우스 T 세포 - 활성화 CD3 / CD28 비즈 5 μL를 추가합니다. 참고 : Magnetics beads는 항원 제시 세포와 크기면에서 유사하며 T 세포의 활성화와 확장을위한 간단한 방법을 제공하는 항 -CD3 및 항 -CD28 mAb에 결합됩니다. </li></ol>

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D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry.">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li></ol>

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이 프로토콜은 심장 이식의 실험 쥐 모델에서 이식편 - 침윤 골수 세포 서브 세트를 면역화하는 데 사용한 방법을 기술하며, 이는 다른 쥐 실험 모델의 다른 조직에도 적용 가능합니다. 20 psi에서의 저압 셀 분류는 순수한 셀 하위 집합의 좋은 수율을 격리하는 데 선호되는 방법이었습니다. 각 골수 하위 집합의 순도를 유지하는 것은 다른 골수 집단 사이의 억제 능력의 결정적인 결과를 확립하는 ?...

이 프로토콜은 T 세포 반응을 조절하는 능력에 따라 심장 동종 이식으로부터 격리 된 조직 침윤성 대 식세포의 기능을 연구하기위한 시험 관내 기술을 기술한다. 문헌에 널리 기술되어 있듯이, 형광 세포 추적 염료는 유세포 분석과 함께 체외 및 특정 생체 내 특정 세포 유형 의 억제 기능을 연구하는 강력한 도구 입니다. 우리의 프로토콜 은 체외에서 림프구 증식을 모니터링하기 위해 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 방법을 따른다. CFSE로 표지 된 세포가 분열하면 그 자손은 카르복시 플루 오레 신 표지 분자의 수의 절반을 얻습니다. 유동 세포 계측법에 의한 세포 형광의 감소는 T 세포 면역 반응을 조절하는 억제 성 대 식세포의 능력을 모니터링하는 세포 분열을 평가하는데 사용될 수있다. CFSE는 플루 오레 신계 염료이기 때문에 br다량의 유동 세포 계측법에 적용 할 수있는 다른 형광 크로마토 그래피의 범위를 제공합니다. phenotyping을위한 fluorochromes의 적절한 선택은 과도한 스펙트럼의 중복과 항원 양성 세포, 특히 CFSE 7 와 같은 가시 단백질 염료를 인식하지 못하는 것을 피하기 위해서도 중요합니다. 방사성 표지 된 티미 딘 (TdR) 8 을 사용하는 티미 딘 도입 분석과 같은 세포 증식을 측정하는 대체 기술에 비해 형광 염료를 사용하면 많은 이점이 있습니다. 이 분석은 mitotic 세포 분열 동안 염색체 DNA의 새로운 가닥에 통합되는 삼중 티미 딘 ( 3 H-TdR)을 이용한다. 이 분석과 관련된 안전 문제는 방사성 동위 원소의 사용이다. 왜냐하면 신틸레이션 베타 계수기가 세포 분열 정도를 결정하기 위해 세포에서 회수 된 DNA의 방사능을 측정하기 때문이다. 방법 론적으로, 삼중 수소 티미 딘 엉덩이ay는 세포 수가 적고 염색 후 지연된 분석과 같은 중요한 임상 실험실 제약 조건에 맞을만큼 유연하지 않습니다. 반대로, CFSE 염색은 세포 증식을 예방하고 CD69, HLA-DR 및 CD25와 같은 중요한 활성화 마커를 방해하는 것으로 나타났습니다. 따라서 각 방법론의 장점과 한계를 이해하는 것은 특히 여러 염료를 사용하여 여러 세포 유형을 추적하는 다색 연구에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">RPMI 1640 Media</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">11875119</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">10 % FBS</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">26140-079</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21985023</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">100X Pen/Strep</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15140122</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">100X L-glutamine</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030081</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">100X Non Esential amino acids</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25025039</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">1M HEPES buffer&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25060CL</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:111px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:123px;">SH30239.01</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">Penicilin/Streptavidyn</td>
			<td style="width:111px;">ThermoScientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">Collagenese A</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">70381322</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">DPBS (w/o calcium&#38;magnesium)</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">21031CV</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">70 micron Cell strainer</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22363548</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">A10492-01</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">DAPI</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">32670-5mg-F</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:147px;">CFSE-FITC</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C34554</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">11452D</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">96 well&#160; U-bottom plate</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">353077</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">Antibodies:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-Ly6C-APC</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">175932-80</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-Ly6G-Pe/Cy7</td>
			<td style="width:111px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">127617</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">45011282</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-CD45-APC/Cy7</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">47045182</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-CD4-APC</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">17004181</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-CD8-P/ Cy7</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">25008181</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">LSRII Flow Cytometer</td>
			<td style="width:111px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">FACSDiva Software</td>
			<td style="width:111px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">008374</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:111px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">000664</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">Balb/c</td>
			<td style="width:111px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">000651</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of regulatory macrophages that inhibit graft-reactive immunity

이식 장기의 대 식세포 축적은 동종 이식 거부 1 의 특징으로 오래 동안 인식되어왔다. 면역 원성 단핵구는 이식 후 조기에 동종 이식종에 침투하고, 이식 장기에 대한 이식편 반응 반응을 일으키며 장기 거부 반응을 시작합니다 2 . 최근 데이터는 억제 성 대 식세포가 장기 이식 성공을 촉진하고 이식 내성의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. 이것은 macrophage 기능의 분리 및 분석을위한 새로운 로드맵을 요구하는 macrophage ontogeny, activation 및 function의 다차원 개념을 제안합니다. 대 식세포의 소성 때문에 조직 환경에 따라 대 식세포를 분리하고 특성화하는 방법론을 제공하고 여러 시나리오에 따라 기능을 정의해야합니다. 여기, 우리는 descri이식편 침윤성 대 식세포의 면역 특성 규명 및 우리가 기능적으로 CD8 + T 증식을 억제 하고 체외에서 CD4 + Foxp3 + Treg 확장을 촉진시키는 능력을 기능적으로 평가하는 데 사용한 방법이 될 수 있습니다.

대표적인 결과는 위의 프로토콜에 설명 된 게이팅 전략을 보여줍니다. 결과는 또한 이식편 - 침투 대 식세포와의 공 - 배양 후 T- 세포 증식 활성의 분석을 나타낸다. 그림 4 에서 대 식세포 하위 집합의 체외 억제 능력을 분석했습니다. 결과는 용인 된 수용자로부터 얻은 Ly6C lo Ly6G - 대 식세포가 억압 적이라는 것을 나타낸다. 결과는 또?...

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Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

functional-characterization-regulatory-macrophages-that-inhibit-graft

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다. 

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Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

연구

면역학 및 감염병학

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

선생님 FcγR Cross-linking에 대 식 세포에서 생산의 흐름 Cytometric 측정

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...