이 공동 배양 방법은 대식세포 세포 세포의 중간엽 줄기 세포 조절 뒤에 있는 세포 접촉 메커니즘을 둘러싼 주요 질문에 답하는 데 도움이 되며, 따라서 선천성 면역을 조절하는 MSC의 역할을 조명합니다. 이 기술은 높은 처리량 해석에 적용될 수 있습니다. 바이오 입자는 산성 성 균증 환경에서만 pH 에 민감한 염료 형광에 컨쥬게이징됩니다.
따라서 세탁 및 담금질이 필요합니다. 이 방법은 또한 호중구 및 그밖 phagocytes를 포함하는 공동 배양 모형의 각종에 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 에단 Chetkof, 내 실험실에서 현재 학부입니다.
우선, 배양 된 중간 엽 줄기 세포의 합류를 관찰한다. 70-80%의 합류가 달성되면 배양 된 세포에서 성장 배지를 100 mm 접시에 흡인하고 PBS의 5 밀리리터를 추가하십시오. PBS를 심은 후 0.05%의 트립신 EDTA 용액의 2밀리리터를 추가하고 세포를 3분 동안 배양합니다.
3 분 후, 반전 된 현미경을 사용하여 세포 분리를 확인하십시오. 그리고 세포가 분리되지 않으면 다시 1 ~ 2 분 동안 배양하십시오. 모든 세포가 분리되면 접시에 신선한 성장 배지의 5 밀리리터를 추가하십시오.
트립신 중간 혼합물을 사용하여 플레이트를 헹구고 멸균 세리컬 파이펫을 사용하여 세포를 깨끗하고 멸균된 50 밀리리터 원추형 튜브로 채취하십시오. 다음으로, 원심분리에 의해 세포를 아래로 펠릿. 상체를 심은 후, 부드럽게 위아래로 파이펫하여 신선한 성장 매체의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
세포 계산의 경우, 세포 현탁액 10 마이크로리터를 0.4%의 30마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로센심심분리기 튜브에 추가한 다음 혈종계 계수 챔버의 커버슬립 아래에 혼합물의 마이크로리터 10개를 첨가한다. 반전 또는 브라이트필드 현미경하에서, 10X 객관적인 렌즈와 4개의 1평방밀리미터 챔버를 사용하여 염색되지 않은 실행 가능한 세포를 계산하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 세포 수를 계산합니다. C1V1 방정식을 사용하여 C2V2와 같으며 밀리리터당 5번째 세포에 10분의 1의 최종 농도에서 세포 현탁액을 준비하는 데 필요한 신선한 배지 및 세포 현탁액의 원하는 부피를 결정한다.
다중 채널 마이크로파이프터를 사용하여 플레이트 설계에 따라 96웰 플레이트의 우물에 셀 서스펜션 100 마이크로리터를 추가합니다. 마이크로피펫을 사용하여 플레이트 설계에 따라 각 챔버 슬라이드에 셀 서스펜션 530 마이크로리터를 추가하고 하룻밤 동안 배양합니다. 100mm 접시에서 대식세포를 활성화하기 위해 밀리리터당 250 나노그램의 농도로 인터페론 감마를 함유하는 활성화 배지 10밀리리터를 준비한다.
대식세포 배양으로부터 성장 배지를 흡인시키고 인터페론 감마가 없는 활성화 배지의 5밀리리터로 세포를 헹구는다. 실험 접시에 헹기 매체를 흡입 한 후 인터페론 감마로 보충 된 활성화 매체 10 밀리리터를 추가하십시오. 그리고 대조기 접시에 인터페론 감마없이 활성화 배지의 10 밀리리터를 추가 한 다음 세포를 16 ~ 24 시간 동안 배양합니다.
인큐베이션의 끝에서, 공동 배양을 준비하기 위한, 대식세포로부터의 활성화 배지를 제거하고 신선한 성장 배지의 5밀리리터를 첨가한다. 셀 리프터를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어 내고 세포를 50 밀리리터 원내 튜브로 수집합니다. 다음으로, Trypan Blue 배제 및 혈혈성 계수를 사용하여 세포를 카운트하고, 관건 줄기 세포에 대해 이전에 입증된 바와 같이 밀리리터 당 2회 10~5번째 세포의 농도에서 대조군 및 처리된 대식세포 현탁액의 제조에 선행한다.
중간 엽 줄기 세포를 포함하는 실험 우물에서 배지를 부드럽게 흡인. 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 처리된 100마이크로리터와 대조군 대식세포 현탁액을 플레이트 설계에 따라 적절한 실험용 우물에 추가하고 입증된 대로 하룻밤 동안 배양한다. 중간 엽 줄기 세포를 포함하는 4 개의 벽 챔버 슬라이드에서 배지를 부드럽게 흡인.
마이크로피펫을 사용하여 대식세포 현탁액 530마이크로리터를 설계에 따라 적절한 웰에 추가하고 하룻밤 동안 배양한다. Zymosan 입자의 1 밀리 그램을 포함하는 유리 에 살아있는 세포 이미징 매체의 1 밀리리터를 추가하고 유리 배양 튜브에 중간 입자 혼합물을 수집합니다. 유리질 1밀리리터를 추가로 헹신 후 유리 튜브에 헹은 이미징 배지를 옮은 다음 밀리리터 자이모산 입자 서스펜션당 0.2밀리그램을 달성하기 위해 3밀리리터의 추가 이미징 솔루션을 추가합니다.
30~60초 동안 빠른 펄스를 사용하여 Zymosan 서스펜션을 소용돌이친 다음 프로브 초음파 처리기를 사용하여 60개의 빠른 펄스로 서스펜션을 초음파 처리합니다. 매체를 흡입한 후, 살아있는 세포 화상 진찰 용액의 100 마이크로리터로 실험적인 우물과 시약 공백 우물을 헹구는 다. 다음으로, 우물에서 살아있는 세포 이미징 솔루션을 흡인하고 Zymosan 서스펜션의 100 마이크로 리터를 추가합니다.
터치 패드 인터페이스를 사용하여 형광 리더의 플레이트 트레이를 엽니다. 왼쪽 상단 모서리에 A1을 잘 놓는 트레이에 뚜껑이 없는 플레이트를 놓습니다. 터치 패드를 사용하여 트레이를 닫고 상단 메뉴의 녹색 읽기 버튼을 클릭합니다.
식세포 분석서를 수행하기 위해, 이미징 매체의 750 마이크로리터로 첫 번째 실험을 잘 헹구고, Zymosan 현탁액의 400 마이크로리터를 추가하여 성장 배지에 남아 있는 우물을 남깁니다. 다음으로, 이미징 시스템의 인큐베이션 된 단계에 슬라이드를 놓습니다. 이미징 소프트웨어를 사용합니다.
찾기 탭 에서 브라이트필드 옵션을 선택한 다음 접안 아이콘을 클릭합니다. 10X 목표를 제자리에 두고, 접안렌즈와 초점 손잡이를 사용하여 세포에 집중하십시오. 획득 탭을 선택합니다.
실험 드롭다운 메뉴를 열고 509나노미터 의 발산과 533나노미터의 방출 파장을 수용할 수 있도록 설정된 EGFP 필터세트를 선택한다. 타이머에 약 2분이 남은 경우 목표 메뉴의 20X 아이콘을 클릭하여 목표를 20X로 변경한 다음 채널 메뉴를 클릭하고 EGFP 필터를 선택하고 노출 메뉴에서 노출 시간을 400밀리초로 설정하여 pH에 민감한 녹색 불소호를 감지한 다음 라이브로 클릭합니다. 포커스를 조정한 후 정지를 클릭하여 빛을 끄고 정상 시간 경과 실험 설정 옆에 있는 확인란을 선택합니다.
포커스 전략 메뉴에서 소프트웨어 자동 초점 및 드롭다운 메뉴에서 자동 초점 옵션을 선택하고 스마트 및 코어 설정을 선택하여 자동 초점이 실행되는 동안 빛에 노출되는 시간을 줄입니다. 시간 경과 메뉴에서 원하는 인수 수를 30~60개로 설정하고 간격 시간을 1분으로 설정한 다음 시작 실험 버튼을 클릭하여 인수를 시작합니다. 인터페론 감마가 공동 배양에 미치는 영향을 연구했습니다.
대표적인 결과는 중간엽 줄기 세포를 가진 대식세포의 공동 배양이 대식세포의 식세포 활성을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 인터페론 감마 치료는 대식세포의 활성을 감소시킨다. 그러나, 중간엽 줄기 세포의 존재에서, 대식세포 세포 활성은 부분적으로 구출되었다.
최적의 세포 밀도는 이 연구 결과에서 중요합니다. 그리고 대식세포가 밀도가 너무 낮게 도금되었을 때 형광 강도의 변화가 감지되지 않았다. 대식세포가 고밀도로 도금되었을 때, 형광 강도는 모든 군에서 급속히 상승하였고 차이는 분별되지 않았다.
이 절차 동안 가장 중요한 것 중 하나는 세포 밀도가 최적화되고 실험 사이에 일관되게 유지되도록하는 것입니다.
