我々は、フローサイトメトリー、顕微手術、およびシナイ山での研究優秀な生物リポジトリ/病理学のセンターの技術的貢献を認めています。この研究は、COST Action BM1305：細胞致死療法（A FACTT）、Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Instituteの開発基金、Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-RおよびSAF2016-80031-Rに焦点を当てて加速するアクションJO

<html>この研究では、マウスは、米国農務省のガイドラインおよび実験動物のケアおよび使用のための公衆衛生サービスガイドの勧告に従って収容されている。動物使用を含むすべての実験的技術は、Mount Sinai School of MedicineのIACUC（Institutional Animal Care and Utilization Committee）承認プロトコールに従って実施した。 1.メディアの準備<ol><li> 2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸、5mMのHEPESおよび0.05mMの2mM EDTAを用いて、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（10,000U / mL）を含む完全RPMI 1640培地を調製する。 - メルカプトエタノール。 </li></ol> 2.同種移植および単細胞懸濁液注：肺動脈および下大静脈の移植および吻合技術は、最初にCorryおよび共同研究者によって記述され、Liu＆Kangs = &quot;xref&quot;&gt; 10,11（ 図1A ）。 <ol><li>誘導チャンバー内で4-5％イソフルランで移植マウスを麻酔する。頚椎脱臼によってそれを犠牲にする。 </li><li>標準的なはさみで正中線の腹部切開を行い、大動脈を局所化するために腹部の内容物を取り除く。 注：移植された心臓は、レシピエントの腹部大動脈の右側にあります（ 図1B ）。 </li><li>微細な鋭い鉗子を使用してグラフトを静かに引き出し、すぐに氷冷RPMI培地に入れる。 注：手術用ハサミを使用して大動脈から移植片を分離すると、移植片に損傷を与え、一部の組織が被移植者に付着したままになります。 </li><li>すべての移植片が収集された後、それらを組織処理用の無菌培養フードに移す。ペトリ皿に移植片を置き、滅菌した鈍いマイクロサージェリーハサミを使用して組織を小さな片（1 mm）に刻みます。 </li><li>鋭い歯のforcで5mLのコラゲナーゼA（滅菌1×PBS中の0.1mg / mLコラゲナーゼ）を含む50mLチューブに移す。 37℃の浴中で1時間インキュベートする。 </li><li>コラゲナーゼを中和するために5mLのRPMI培地を添加し、1mLシリンジのプランジャの助けを借りて100μmのストレーナにサンプルを移す。 </li><li> 4℃で400 xgで5分間サンプルをスピンダウンします。 </li><li>ペレットを1mLのACK溶解バッファーに再懸濁する。よく混合し、4℃で5分間インキュベートする。 </li><li>溶解緩衝液を中和するために1mLのRPMI培地を添加し、4℃で5分間400xgでサンプルを回転させます。 </li><li> 200μLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁し、5mLポリプロピレン丸底チューブに移す。 注：ポリプロピレンチューブの接着性は低く抑えられています。また、細胞を4℃などの低温で維持すると、接着性が低下する。 </li></ol> 3.蛍光活性化細胞を用いたグラフト浸潤マクロファージの単離ing <ol><li> Fc受容体ブロッキングmAb（ラット抗マウスCD16 / 32）を用いて骨髄細胞上の望ましくない特異的結合をブロックする。表面染色の15分前に1サンプルあたり1〜2μLを加える。 </li><li>抗マウスCD45 APC / eFluor780（0.6μg/μL）、抗マウスLy6C APC（2μg/μL）、抗マウスCD11b Percp / Cy5.5（RPMI培地中0.6μg/μL最終濃度）抗マウスLy6G Pe / Cy7（2μg/μL）を添加した。チューブをアルミホイルで覆い、蛍光抗体を光から保護し、チューブを4℃の冷蔵庫で45分間インキュベートする。 注：一重染色補正のために、ネガティブコントロールチューブ（染色なし）と各蛍光色素で単独で標識された細胞を含むチューブを準備する。ゲートのセットアップを助けるために、アイソタイプコントロールは、特にLy6C（IgG2a）およびLy6G（IgG2b）に使用することができる。 </li><li> RPMI培地で細胞を2回洗浄し、4℃で400 xgで5分間回転させます。トリパンブルーと血球計算機を使用して細胞を数える1×10 6細胞あたり1mLのRPMI培地で希釈する。選別する前に、サンプルを5 mL、70μmセルストレーナチューブキャップに移します。細胞生存マーカーとしてDAPI（1μg/ mL）を添加し、選別に進む。 </li><li>マクロファージは敏感で脆弱な細胞であるため、ソート条件を20 psiに設定し、100μmのノズルサイズを使用して4方向純度モードを使用してマクロファージを単離します。 </li><li> 5 mLのポリプロピレンチューブに1 mLのRPMI培地で採取チューブを準備する。 </li><li>ソーターソフトウェアを使用して新しい実験を開き、ブランクパネルで空白実験を選択して設定を定義します。 </li><li> 前方散乱（FSC）対（ 対 ）サイド散乱（SSC）を表示し、すべての白血球上のゲートを表示するドットプロットを設定します。この親ゲートから、SSC 対 DAPIとDAPIセルのゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。 <ol><li>この新たにゲートされた人口で、広告を作成するCD11b 対 CD45を示し、二重陽性（CD11b + CD45 + ）マクロファージおよび好中球のゲートを示す。 </li><li>ここから、Ly6C 対 Ly6Gを表示し、望ましい集団：Ly6C hi Ly6G - 、Ly6C lo Ly6G - 、およびLy6C int Ly6G +を示す最終ドットプロットを作成する（ 図2 ）。 </li></ol></li><li>選別後、純度と細胞生存率（&gt; 90％）を確認し、コレクションチューブを400 xgで5分間4℃で回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を計数し、それらを完全RPMI培地中で所望の濃度（ 例えば、 1×10 6マクロファージ/ mL）で再懸濁する。 </li><li>完全RPMI培地100μLの最終容量を有する96ウェル丸底プレート中のウェル当たり50×10 3個のマクロファージをプレートに添加する。 37℃、5％CO 2で 24時間以上放置する。 </li></ol> 4. Isolatio蛍光活性化細胞選別を用いたT細胞数の測定注意：C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jnは、Foxp3（フォークヘッドボックスP3）遺伝子を発現する細胞を単量体赤色蛍光タンパク質（mRFP）で同時標識するX連鎖標的化ノックインマウス株である。 <ol><li>ステップ2.1で前述したように、C57BL / 6およびC57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J（H-2b）マウスを麻酔し、犠牲にする。脾臓およびリンパ節（LN：鼠径部、腰部、腋窩、上腕および頚部）を単離し、それらを氷冷RPMI培地に迅速に入れる。 </li><li> LNを単離するためには、マウスを仰臥位に置き、中線の皮膚を下から上に切開し、慎重に腹膜を切開し、穏やかに皮膚を広げる。すべての鼠径部、腰部、腋窩、上腕、および頚部のLNが収集されると（ 図1C 、赤色に着色）、腹膜を切断し、腸の左上側の脾臓を単離する。 </li><li> 100μmのフィルターを使用して脾臓およびLNを分解する50mLのチューブの上に置いた。 1 mLシリンジのプランジャーを使用して、組織を静かに押します。フィルターがきれいになるまで、必要な回数RPMI培地でフィルターをすすいでください。 注：各マウスのLNと脾臓を同じチューブに一緒にプールすることができます。 </li><li> 4℃で400 xgで5分間スピンダウンします。 </li><li>ペレットを2mLのACK溶解バッファーに再懸濁する。よく混合し、4℃で5分間インキュベートする。 </li><li> 2mLのRPMI培地を加えて溶解バッファーを中和する。 4℃で400 xgで5分間スピンダウンします。 </li><li> 200μLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁し、5mLポリスチレン丸底チューブに移す。 </li><li>抗マウスCD4 APC（0.6μg/μL）および/または抗マウスCD8 PeCy7（2μg/μL）の染色。チューブをアルミホイルで覆い、蛍光抗体を光から保護し、チューブを4℃の冷蔵庫で45分間インキュベートする。 注：一重染色補正のために、ネガティブコントロールチューブ（染色なし）を準備し、蛍光色素の各々を単独で標識した細胞を有するチューブ。 </li><li> RPMI培地で細胞を2回洗浄し、4℃で400 xgで5分間回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を数える。 注：CFSE色素は、通常50μgのカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル粉末として提供される。最終的なストック溶液が5mMになるように18μLのDMSOをCFSEのバイアルに加え、数ヶ月間-20℃で保存する。 </li><li> CFSEラベリングのために、ストック溶液からの5μMのCFSEの最終作業濃度で、PBS中のmL当たり10 6細胞までの濃度でCD8染色細胞を再懸濁する。前述の6のように20℃の浴中で5分間インキュベートする。 注：（重大なステップ）低濃度（≦10 6 / mL）の細胞では、CFSEの毒性効果を緩衝するために、添加されたタンパク質の存在下で細胞を標識することが不可欠である。したがって、PBSは5％FBSを含むことができる。私が遊離アミノ酸はCFSEと競合することにより標識効率を低下させる可能性がある。 </li><li> 2mLのRPMI培地でCFSEを中和する。 4℃で400 xgで5分間スピンします。 1×10 6 CD8 T細胞あたり1mLのRPMI培地を加える。 </li><li>選別する前に、サンプルを70μmセルストレーナーに5 mLチューブキャップで移します。細胞生存マーカーとして50μLの1×DAPI（1μg/ mL）を添加し、ソーティングに進みます。 注：1xは、他の構成成分に対する試薬の1：1の比率を意味する。 </li><li> 20psiおよび100μmノズルサイズでソート条件を設定して、二重陽性CD8 + CFSE + T細胞を単離する（ 図3A ）。 </li><li> 5 mLのポリプロピレンチューブにRPMI培地1 mLを含む採取チューブを準備し、分取に進んでください。 </li><li>ソーターソフトウェアを使用して新しい実験を開き、ブランクパネルで空白実験を選択して設定を定義します。 </li><li> CD4 + T細胞の分離のために、破片および樹状細胞などの大きな顆粒細胞を除くリンパ球上のFSC対SSCおよびゲートを果たす。 <ol><li>この親ゲートから、SSC対DAPIとDAPIセルのゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。 </li><li>この新たにゲートされた集団で、すべてのCD4 +細胞を単離するためにSSC対CD4を示すドットプロットを作成する（ 図3B ）。あるいは、抗CD3 mAbを使用して、純粋なT細胞集団の単離を確実にすることができる。 注：すべてのCD4 + T細胞（5〜10％）のごく一部はFoxp3 + mRFP +でなければなりません。 </li></ol></li><li>選別後、純度と細胞生存率（&gt; 90％）を確認し、コレクションチューブを400 xgで5分間4℃で回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を数える。 2×10 6個の T細胞あたり1mLの完全RPMI培地を用いて再懸濁する。 </li><li>予め選別したマクロファージでT細胞を培養することにより抑制アッセイを設定する。プレート10 x 10 4 CD4 + Tおよび10×10 4個の CD8 + CFSE + T細胞を、完全RPMI培地100μLの最終容量で同じウェルに添加した。 37℃、5％CO 2で96時間インキュベートする。 注：マクロファージおよびT細胞は1：4の比で使用された。 </li><li>アジド含有バッファーを除去するために使用する前に、2mLのPBS中でT細胞活性化剤CD3 / CD28磁性ビーズを洗浄することによってT細胞分裂を刺激する。 1ウェルあたり5μLのマウスT細胞活性化因子CD3 / CD28ビーズを添加する。 注：磁気ビーズは、抗原提示細胞とサイズが類似しており、抗CD3および抗CD28 mAbに結合し、T細胞の活性化および増殖のための簡単な方法を提供する。 </li></ol>

<ol>
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(6), e238 (2007).</li><li>Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Suppressor+Cells+in+Transplantation.">Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation.</a> Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).</li><li>Gallina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8++T+cells.">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).</li><li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gr-1+CD115++immature+myeloid+suppressor+cells+mediate+the+development+of+tumor-induced+T+regulatory+cells+and+T-cell+anergy+in+tumor-bearing+host.">Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host.</a> Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).</li><li>Luan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+accumulate+in+renal+transplant+patients+and+mediate+CD4(+)+Foxp3(+)+Treg+expansion.">Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion.</a> Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).</li><li>Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+immune+cell+proliferation+and+cytotoxic+potential+using+flow+cytometry.">Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、異なるネズミ実験モデルの他の組織にも適用可能な、実験的なネズミ移植モデルの移植片浸潤骨髄細胞サブセットを免疫学的に特性化するために使用した方法を記載している。純粋な細胞サブセットの良好な収率を単離するためには、20psiでの低圧細胞ソーティングが好ましい方法でした。異なる骨髄集団間の抑制能力の決定的な結果を確立するためには、各骨髄サブセ?...

このプロトコルは、心臓同種移植片から単離された組織浸潤マクロファージの機能を、T細胞応答を調節するそれらの能力に従って研究するためのインビトロ技術を記載する。文献に広く記載されているように、フローサイトメトリーと組み合わせた蛍光細胞追跡色素は、インビトロおよびインビボでの特定の細胞型の抑制機能を研究する強力なツールである。我々のプロトコルは、インビトロでリンパ球増殖をモニターするためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）法に従う。 CFSE標識細胞が分裂すると、その子孫はカルボキシフルオレセイン標識分子の半分の数を獲得する6 。フローサイトメトリーによる細胞蛍光の対応する減少を用いて、T細胞免疫応答を調節するための抑制性マクロファージの能力をモニターして、細胞分裂を評価することができる。 CFSEはフルオレセインベースの色素であるため、それはbr多色フローサイトメトリーに適用できるようにする。過剰なスペクトルの重複および抗体陽性細胞、特にCFSE7のような可視タンパク質色素を認識できないことを避けるために、表現型決定のための蛍光色素の適切な選択もまた重要である。 放射性標識チミジン（TdR） 8を使用するチミジン取り込みアッセイのような、細胞増殖を測定する別の技術よりも蛍光色素を用いることの多くの利点がある。このアッセイは、有糸分裂細胞分裂中に染色体DNAの新しい鎖に組み込まれるトリチウム化チミジン（ 3 H-TdR）を利用する。細胞分裂の程度を決定するために、細胞から回収されたDNA中の放射能を測定するために、シンチレーションベータカウンターが使用されるので、このアッセイに関連する安全性の懸念は放射性同位体の使用である。方法論的には、トリチウム化チミジン尻細胞の数が少なく、染色後に分析が遅れるなど、重要な臨床検査室の制約条件を満たすほど柔軟ではありません。これとは対照的に、CFSE染色は、細胞増殖を防止し、CD69、HLA-DRおよびCD25などの重要な活性化マーカーを妨害することが示されている。したがって、それぞれの方法論の利点と限界を理解することは、特に、異なる細胞タイプを追跡するために複数の色素が使用される多色検査では、正確で再現性のある結果を得るために重要です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="459">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">RPMI 1640 Media</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">11875119</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">10 % FBS</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">26140-079</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">1000X 2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">21985023</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">100X Pen/Strep</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15140122</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">100X L-glutamine</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030081</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">100X Non Esential amino acids</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25025039</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">1M HEPES buffer&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">25060CL</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">100mM Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:111px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:123px;">SH30239.01</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">Penicilin/Streptavidyn</td>
			<td style="width:111px;">ThermoScientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">Collagenese A</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:123px;">70381322</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">DPBS (w/o calcium&#38;magnesium)</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">21031CV</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">70 micron Cell strainer</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">22363548</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">A10492-01</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">DAPI</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">32670-5mg-F</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:147px;">CFSE-FITC</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">C34554</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:147px;">Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">11452D</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">96 well&#160; U-bottom plate</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">353077</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">Antibodies:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-Ly6C-APC</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">175932-80</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-Ly6G-Pe/Cy7</td>
			<td style="width:111px;">Biolegend</td>
			<td style="width:123px;">127617</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">anti-CD11b-Percp/Cy5.5</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">45011282</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-CD45-APC/Cy7</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">47045182</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-CD4-APC</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">17004181</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">anti-CD8-P/ Cy7</td>
			<td style="width:111px;">eBioscience</td>
			<td style="width:123px;">25008181</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">LSRII Flow Cytometer</td>
			<td style="width:111px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:147px;">FACSDiva Software</td>
			<td style="width:111px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">008374</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">C57BL/6</td>
			<td style="width:111px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">000664</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:147px;">Balb/c</td>
			<td style="width:111px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">000651</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of regulatory macrophages that inhibit graft-reactive immunity

移植臓器におけるマクロファージの蓄積は、同種移植拒絶1の特徴として長い間認識されてきた1 。免疫原性単球は、移植後早期に同種移植に浸潤し、移植された器官に対する移植片反応性反応を起こし、臓器拒絶反応を開始する2 。最近のデータは、抑制性マクロファージが長期移植の成功を促進し、移植寛容の誘導に必要であることを示唆している4 。これは、マクロファージ機能の単離および解析のための新しいロードマップを必要とする、マクロファージの個体発生、活性化、および機能の多次元概念を示唆している5 。マクロファージの可塑性のために、組織環境に応じてマクロファージを単離し、特徴づけ、異なるシナリオに従ってその機能を定義する方法論を提供することが必要である。ここでは、グラフト浸潤マクロファージの免疫学的特性決定のためのプロトコルであり、我々がCD8 + T増殖を阻害し、インビトロで CD4 + Foxp3 + Treg増殖を促進する能力を機能的に評価するために使用した方法である。

代表的な結果は、上記のプロトコルで説明されているゲーティング戦略を示しています。結果はまた、移植片浸潤マクロファージとの共培養後のT細胞増殖活性の分析を示す。マクロファージサブセットのin vitro抑制能力を図4で分析した。結果は、寛容化されたレシピエントから得られたLy6C lo Ly6G -マクロファージが抑制的であるこ?...

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Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

functional-characterization-regulatory-macrophages-that-inhibit-graft

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。 

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Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

免疫・感染学

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面<em&gt;トキソプラズマ</emIFN-γ依存性細胞自律イミュニティへの抵抗のための重要な&gt;遺伝子

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

単離、分化、および血液からヒト抗体を分泌するB細胞の定量化：体液性免疫の機能読み出しなどのELISpot

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...