Name: co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device at JoVE.com

We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.

창자 - 온 - 어 - 칩 장치 1. 마이크로 주 : 창자 - 온 - 칩은 플렉시블 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미소 유로 (1mm 폭 × 150 μm의 높이 X 1cm 길이)를 포함하는 투명 가스 투과성 실리콘 중합체 (폴리 디메틸 실록산, PDMS)로 이루어지는 미세 유체 소자이며 기공 (세공 직경 10 ㎛의 간격, 공극 25 μm의 세공을 위해) 막을 PDMS 5,9. 제공되는 단계에 따라 창자 - 온 - 어 - 칩 (왼쪽 그림 1A)를 제작. <ol><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 5,9의 미세 절차. <ol><li> PDMS의 예비 중합체와 경화제를 혼합하여 경화되지 탈기 PDMS 준비 (15 w / w 1), 30 분 동안 진공 건조기에 배치. </li><li> 30g 각각 SU-8 위의 기반 미세 패턴과 장 - 온 - 어 - 칩의 낮은 마이크로있는 각 실리콘 몰드 상에 미 경화, 탈기 PDMS의 3g을 따르십시오. 이어서 L에 대한 건조 오븐에서 60 ℃에서 경화동쪽 4 시간. </li><li> 수술 용 메스를 이용하여 주변 에지 절단에 의해 각 실리콘 주형으로부터 상하부 PDMS 층 탈형. 조직 검사 구멍을 뚫는 (구멍 직경 2.0 mm)를 사용하여 6 홀 (두 개의 입구, 두 개의 출구, 2 개의 진공 챔버)를 펀치. </li><li> w 1 : 평면과 중첩 원형 기둥 (직경 10 μm의 높이가 25 μm의) 포스트 어레이를 포함하는 실란 화 된 실리콘 웨이퍼 상에 경화되지 않은 탈기 PDMS의 10g을 주입하여 다공성 막을 제조, PDMS 지지층 (15 실란 화 / w; 1cm 두께). 설정에 3kg 중량 누름을 넣고 12 시간 이상 60 ℃에서 폴리머를 경화. </li><li> 신중 웨이퍼로부터 슬래브의 모서리를 들어 올려, 다공질 PDMS 막을 완전히 웨이퍼로부터 분리 될 때까지 박리하여 실리콘 웨이퍼의 PDMS지지 슬래브에 부착 다공성 PDMS 막의 설정 탈형. </li><li> 는 PL 및 공막 측 : 상위 계층의 채널 사이드 (1, w / w PDMS 15) 폭로ASMA은 각각 1 분, 3 초를위한 휴대용 코로나 treater에 의해 생성. </li><li> 기포없이 병렬로 각 조각을 배치하여 등각 접촉 다공질 PDMS 막의 상부 미세 층의 플라즈마 처리 한 표면에 놓는다. </li><li> 두 PDMS 층의 비가 역적 결합 80 ° CO / N에서 전체 설치를 품어. </li><li> 주의 지지층의 모서리를 들어 올려, 상기 지지층을 완전히 막과 상층으로부터 분리 될 때까지 박리하여 다공성 막과 상층의 어셈블리에서 PDMS 지지층 벗겨. </li><li> 중공 진공 챔버를 만들기 위해 미세한 팁 핀셋을 이용하여 진공 챔버 (메인 채널의 양쪽에 위치하는 두 챔버) 위에 위치하고이 멤브레인의 일부를 절취. </li><li> 내가 설명 된대로 상단 부분과 같은 방법으로 플라즈마에 낮은 조각에 새겨진 채널 측면에 부착 된 막으로면을 노출n은 1 분간 1.1.6 단계. </li><li> 입체경 하에서 기포없이 병렬로 각 조각을 배치함으로써 균일 한 접촉 다공성 멤브레인 미세 상부 층과 하부 층을 맞추고. </li><li> 미세 유체 채널 셀에 다음의 두 중공 진공 챔버를 포함하는 완전한 규모 창자 - 온 - 칩 마이크로 유체 소자를 제작하기 위해 80 ° CO / N에서 건조 오븐에서 온 설정을 치료. </li></ol></li><li> 90 ° 굴곡 스테인레스 스틸 무딘 엔드 바늘을 통해 장 - 온 - 어 - 칩의 상부 또는 하부 마이크로 채널에 연결된 각 포트의 입구와 출구에 튜브를 연결합니다. </li><li> 90 ° 절곡 스테인리스 평활 말단 바늘을 이용하여 상기 진공 챔버에 연결되는 구멍에 튜브를 연결한다. </li><li> 일회용 주사기를 소독 1 ml에 사용 70 % (v / v)의 에탄올을 흐르는하여 마이크로 및 튜브를 소독. </li><li> 60 ° C 건조 오븐 O / N에서 마이크로 및 튜브를 건조. </li></ol> 마이크로 엔진 2. 성장창자 - 온 - 어 - 칩 장치에 겹 장내 융모 <ol><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 5,9에 씨앗 장내 상피 세포 (예 : 카코 2BBE). <ol><li> 70 %와 60 ℃ 건조 오븐 O에서 건조시켜 1 ㎖의 멸균 일회용 주사기를 사용하는 (V / V) 에탄올 (단계 1.4 참조) 장치를 소독 / N은 ​​표면 활성화하기 전에 (단계 150 참조). </li><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 전체 설정을 노출 (즉,의 몸 장 - 온 - 어 - 칩 튜브에 연결) 동시에 40 분 동안 자외선 (253.7 ㎚) 및 오존. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)에 UV 빛 아래 15 분 동안 실온에서 장치를 냉각. </li><li> 일회용을 사용하여 두 상하 미세로 - I 콜라겐를 50㎍ / ㎖의 유형 및 혈청이없는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 희석하고 300 μg의 / ml의 세포 외 기질 혼합물의 혼합 용액 - 전자 재료 피막의 100 μl를 소개 멸균 1 ML의 주사기. </li><li> Incuba37 ° C에서 전체 셋업 테 1 시간 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습. </li><li> 드가 예열 ​​된 (37 ℃)에서 완전 배양 배지 (DMEM, 20 % V / V, 소 태아 혈청 (FBS), 100 유닛 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 50 ㎖, 3 ㎖의 분취 1 분 동안 BSC 50 ㎖의 여과 시스템 (기공 크기 0.45 μm의)을 이용하여 일회용 주사기). <ol><li> 여과 시스템을 통해 사전 예열 매체에 합격 한 분은 중간에있는 거품 또는 용해 가스를 제거하기위한 여과 매체에 부드럽게 누릅니다. </li></ol></li><li> 37 ° C에서 3 ㎖ 일회용 주사기에 탈기 완전한 매체의 나누어지는을 놓고 품어 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기를 가습. </li><li> 상부 및 하부 마이크로에,이 3 ㎖ 일회용 주사기가 탈기 함유 미리 예열 전체 문화 매체를 연결합니다. </li><li> 체적에서 주사기 펌프를 사용하여 상부에 마이크로 탈기 전체 세포 배양 배지 흐름37 ° C에서 (0.02 다인 / ㎠의 전단 응력에 상당) 30 μL / hr의 유량은 O / N, 5 % CO 2 인큐베이터 가습. </li></ol></li><li> 창자 - 온 - 어 - 칩 Microengineered 카코 2 융모의 형성. <ol><li> 50과 65 사이의 통로 번호 카코 2BBE 세포를 사용합니다. </li><li> 37 ° C에서 완전 배양 배지를 함유하는 T75 플라스크에 카코 -2 세포 성장이 완전히 융합 세포를 수득 4-5 일 동안 5 % CO 2 인큐베이터 가습. </li><li> 완전히 T75 플라스크에 성장 합류 카코 2 셀, 다음, 세포를 씻어 PBS를 대기음하는 PBS - 무료 2 + 칼슘과 마그네슘의 10 ML을 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 37 ° C에서 0.05 % 트립신 / EDTA 용액 1 ㎖를 추가하고 품어 5 분 동안 5 % CO 2 배양기를 가습. </li><li> 로 pipetting 의해 3~5 배 하 (FBS)와 예열 된 전체 세포 배양 배지 10 mL로 해리 된 세포를 재현 탁. </li><li> C로 세포 현탁액을 스핀5 분 500 XG에 entrifugation 후 상등액을 제거합니다. </li><li> 다시 1 ml의 장치에서 ~ 1.5 × 10 5 세포 / cm 2의 세포 밀도를 조정하는 완전 배지를 미리 예열을 Resuspend. 세포 밀도를 추정 혈구를 사용한다. </li><li> 상부에 연결된 마이크로 튜브의 출구에 25 G5 / 8 바늘에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 위치시킴으로써 상부 마이크로 (내강 측)에 재현 탁하고, 카코 -2 세포 100 μl를 주입. </li><li> 바인더 클립을 사용하여 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결된 모든 입구와 튜브의 출구를 조인다. </li><li> 1 시간 동안 37 ° C, 가습 5 % CO 2 배양기에서 전체 설치를 품어 다공성 막 표면에 부착 카코 2 세포를 해리 허용합니다. </li><li> 클램프를 제거하고 세포를 24-36 시간 동안 온전한 단일 층을 형성 할 때까지 주사기 펌프를 사용하여 30 μL / 시간 상부 마이크로에 배양액의 흐름을 재개. 위상 콘트라을 사용하여t 또는 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경은 세포 단층의 세포 - 세포 접합을 확인합니다. </li><li> 세포 단일 층을 형성 할 때, 30 μL / hr의 동일한 유량의 두 상부 (루멘)로 배지 낮은 모세관을 미세 관류. </li><li> 연동 운동과 같은 운동 5,9을 흉내 낸 기계적인 변형의 응용 프로그램입니다. <ol><li> 인장 장비를 갖춘 진공 펌프를 켭니다. </li><li> 스테인레스 스틸 튜브 커넥터를 통해 진공 컨트롤러에 진공 챔버를 연결한다. </li><li> 진공 제어 소프트웨어에 대한주기적인 사인 함수 모드 0.15 Hz의 주파수에서 10 %의 평균 세포주의 스트레칭 운동을 설정 한 다음 &quot;시작&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> ~ 100 시간 동안 기계적 변형 하에서 합류 카코 -2 단층을 모두 상단 및 하단의 마이크로 배양액의 일정한 흐름 (30 μL / 시간) (10 %, 0.15 Hz로)를 유지한다. 참고 : 카코 2 세포가 spontaneously 상피 마이크로 5,8-10의 루멘으로 확장 파상 3D 돌기 융모 형태 형성을 겪는다. </li></ol></li><li> , 창자 - 온 - 어 - 칩 (10)의 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 살아있는 인간의 소장의 기관 수준의 기능을 모방 한 바와 같이 단계를 수행하십시오. <ol><li> 2.1에서 2.2 단계를 반복하여 microengineered 카코 2 융모 성장. </li><li> 미리 예열 공동 배양액의 흐름 (완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물을 1 : 1 v / v)의 30 μL / 시간 상하 마이크로한다. </li><li> 해리 정상적인 인간의 모세 혈관의 미세 혈관 내피 세포 100 ㎕ 소개 (HMVECs, 최종 셀 밀도를 ~ 5.0 × 10 5 세포 / cm 2) 2.2.3에서 2.2.9로 단계에 설명 된 동일한 방법으로 낮은 마이크로에. </li><li> 경화 직사각형 PDMS 조각을 배치 (0.5 cm × 1 cm × 1 cm, 폭 X 길이 x 높이; 15 : 1, w/ 엘라스토머 W : 경화제) 창자 온 칩 디바이스 위에 후 거꾸로 전체 장치 설치 플립 () 즉, 상부 마이크로이 아래쪽에 대향하고, 상기 하부 마이크로은 위쪽에 직면한다. </li><li> 해리 HMVECs 하부 미세 다공질 막의 표면에 부착 할 수 있도록, 1 시간 동안 37 ° C, 가습 된 5 % CO 2 인큐베이터에서 인큐베이션 설정. </li><li> 이산화탄소 배양기에서 전체 설치를 꺼내, 다시 통해 설정을 뒤집습니다. </li><li> 기계적 스트레칭 운동에 30 μL / 시간 모두 상하 미세으로 ((1 V / V 한 완전한 카코 -2 세포 배양 배지 전체 HMVECs 배지의 혼합물) 예열 된 공동 배양 배지 흐름 적어도 3 일 동안 10 %, 0.15 Hz로)는 내피 세포의 단층 세포 연접을 형성한다. </li></ol></li></ol> 3. 굿 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스의 마이크로 바이 옴 공동 문화를 호스트 굿 <ol><li> O를 사전 문화를 수행F 박테리아 세포를 microengineered 장 융모에하는 공동 문화 공생 장내 마이크로 바이 옴을 다음과 같이. <ol><li> 멸균 유산균 MRS 국물 강화 중간의 클로스 트리 디움 (1, V / V 1)의 혼합물 10ml에 동결 건조 생균제 세균 분말 혼합물을 재현 탁. </li><li> 10 ㎖의 일회용 멸균 튜브에 분취 한 후, 균체 현탁액의 3 ㎖를 매체의 적당량을 첨가하여 (600 nm에서) 약 0.2 광학 밀도 단위로 최종 세포 밀도를 조정한다. </li><li> 장소 관은 혐기성 용기에 미생물 세포를 재현 탁 함유. 컨테이너에서 혐기성 가스 발생 향 주머니의 두 팩을 추가합니다. 37 ° C에서 흔들림없이 컨테이너 설치를 단단히 용기 뚜껑을 닫고 품어 5 % CO 2 인큐베이터 O / N를 가습. </li></ol></li><li> 장내 상피 세포 5, 10과 마이크로 바이 옴과 공동 문화의 접종. <ol><li> 탈기 antibioti를 포함하는 3 ㎖ 일회용 주사기를 준비합니다C 무 세포 배양 배지 (예, 20 % FBS를 가진 DMEM). 문화 매체의 탈 절차 2.1.6를 참조하십시오. </li><li> 이산화탄소 배양기에서 microengineered 융모를 포함하는 장 - 온 - 어 - 칩 디바이스의 전체 설정을 가지고, 다음 바이오 안전성 캐비닛로 이동합니다. </li><li> 상부 및 하부 마이크로 채널에 연결 튜빙에 연결된 주사기를 제거합니다. 다음 이전 마이크로 바이 옴의 파종에 12 시간 동안이 항생제없는 배지 흐름, 다시 CO 2 배양기에 가져, 장치에 3.2.1에서 제조 된 주사기를 연결합니다. </li><li> 5 분 동안 10,000 XG에서 미리 배양 바이오 틱 박테리아 혼합물 세포​​ (3.1 단계 참조) 스핀 다운. 진공을 이용하여 상등액 대기음 후 (~ 최종 세포 밀도가 1.0 × 107 CFU / ㎖) 항생제가없는 DMEM 배지에 재현 탁. </li><li> 25에 부착 된 1 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 &quot;무균&quot;장내 융모를 함유하는 마이크로 채널의 내강 측에 세포 현탁액을 주입G5 / 8 바늘. 의 장 융모의 혀끝의 표면에 미생물 세포의 부착을 허용 ~ 모든 튜브 끝으로 클램핑하여 흐름없이 1.5 시간. </li><li> 40 μL / 환상 리듬 변형과 시간 (10 %, 0.15 Hz로) 모두에서 상하로 미세 예열 항생제가없는 배지를 관류. </li><li> 녹색 형광 단백질의 공 배양 (GFP)을 표지 된 E.를 들어 콜라이 (E. coli에 GFP 비 - 병원성 DH5 알파 E. 콜라이 숙주) microengineered 융모와 10,11 세포 사전 배양 GFP E. 12 시간 동안 상태 (200 RPM)를 진탕하에 37 ℃에서 멸균 LB 배지에서 대장균 세포. E. GFP의 공존 배양을 수행 3.2.5에서 3.2.6에 절차를 반복 microengineered 융모와 대장균 세포. </li></ol></li><li> 이미지 셀 5,8-10 <ol><li> 미생물 및 상피 형태 5,8,10를 기록 DIC, 표면 형광 또는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다. <ol><li> DIC 이미징 들어, CO 2 배양기에서 장 - 온 - 어 - 칩 마이크로 시스템의 설정을 가지고 현미경의 무대 장치 설치를 배치 한 다음 세포 형태를 기록합니다. </li><li> 융모 상피 형광 이미징의 경우, 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. <ol><li> 4 % 15 분 (w / v)의 파라 포름 알데히드와 융모를 수정합니다. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. </li><li> 0.3 %과 융모를 Permeabilize 하시려면 (v / v) 트리톤 X-100의 PBS 10 분간 소 혈청 알부민 (BSA) (/ V W) 2 %를 함유하는 희석. 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. </li><li> 2 %와 블록 세포를 1 시간 동안 PBS에서 BSA 용액 (/ V w). 그런 다음 10 분 동안 100 μL / 시간 세포를 PBS 세척을 흐른다. </li><li> 4 300 nM의 &#39;빛의 보호 아래 핵 염색을 위해 PBS에 희석, 6-diamidino-2-페닐 인돌 디 하이드로 클로라이드 (DAPI) 솔루션을 추가합니다. </li><li> 형광 팔로이 딘의 25 단위 / ㎖ 추가빛 보호 아래 F - 굴지 염색을 위해 PBS에 용해 (Phalloidin의-CF647 접합체). </li><li> 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광 염색 된 세포의 이미지를 기록. 참고 : 25X 목적은 공 초점 현미경 동안 적절한 광학 줌으로 적용되었다. 도 3b에서, 약 525X의 배율을 사용 하였다. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Donald E. Ingber is a founder of Emulate Inc., holds equity in the company and chairs its Scientific Advisory Board. The other authors have no financial disclosures.

호스트 마이크로 바이 옴의 상호 작용을 이해하는 것은 의학의 발전을 위해 중요하다; 균체 주로 시험 관내에서 포유 동물 세포를 자라다 때문에 플라스틱 접시 또는 정적 웰 플레이트에서 수행 기존의 세포 배양 모델 이상 1-2일 위해 장내 미생물 살아있는 인간의 장 세포의 안정적 공 배양을 지원하지 않는다. overgrowing 미생물 개체군 빠르게 연속적 심각 장 장벽 기능을 손상시키고 장내 ?...

인간의 장내 미생물 종의 놀랄만큼 다양한 배열 (&lt;1,000 종)과 엄청난 미생물 세포의 수 (인간 숙주 세포보다 10 배 이상) 유전자 (인간 게놈보다 100 배 이상) 1 항구. 이러한 인간 microbiomes은 영양소 및 대사 생체 이물질 면역 반응을 조절하고, 2 장 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 당연히 이러한 다양한 기능 제공, 공생 장내 마이크로 바이 옴은 광범위하게 건강과 질병 (3)을 변조한다. 따라서, 장내 마이크로 바이 옴 및 호스트 - 미생물 상호 작용의 역할을 이해하는 위장관 (GI) 건강 증진 및 장 질환 4에 대한 새로운 치료제를 탐험하기 위해 매우 중요하다. 그러나, 시험 관내 장 모델 (예, 정적 인 배양)에 존재하는 시간의 짧은 기간 (&lt;1 일) 균체 자라다 장내 장벽을 손상하기 때문에 호스트 마이크로 바이에 공 배양을 제한기능 5. 대리 동물 모델 (예를 들어, 무균 6 유전자 조작 생쥐 7)도 일반적으로 식민지와 인간의 장내 마이크로 바이 옴의 안정 유지가 어렵 기 때문에 호스트 장내 마이크로 바이 옴 크로스 토크를 연구하는 데 사용되지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 살아있는 인간 대장 5,8- 발생 호스트 장내 마이크로 바이 상호 작용을 에뮬레이트하기 위해 &quot;거트 온 칩&quot;microphysiological 시스템 (좌도 1a) 생체 모방 인간을 개발 하였다. 창자 - 온 - 어 - 칩 마이크로 디바이스는 유연성, 다공성, 세포 외 기질 (ECM) 인간의 장내 상피 카코이 세포에 의해 줄 지어 코팅 된 막, 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스 (그림 1A을 흉내 낸에 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미세 유체 채널을 포함 , 오른쪽) 9. 진공 중심의 순환 리듬 변형은 일반적으로 induc 변경을 모방 생리 기계적 변형을 유도(오른쪽 그림 1A) 연동 운동에 의해 에드. 흥미롭게도, 카코 -2 세포는 100 개 이상의 시간 동안 소화관 온 칩에서 성장 될 때, 자발적 단단히 접합, 정점 브러시 테두리 기저 지하실에 한정되는 증식 성 세포를 3 차원 (3D) 장내 융모를 형성 점액 생산 증가 약물 대사 활동 (예를 들어, 시토크롬 P450 3A4, CYP3A4), 향상된 글루코스 재 흡수 8. 이 &#39;무균&#39;미세 환경에서, 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus의 GG 또는 최대 2 주 5,10에 대한 호스트 상피 세포와 바이오 틱 박테리아 혼합물의 치료 형성하는 공동 문화 수 있었다. 본 연구에서는 장기간 장내 온칩 장치 호스트 장내 마이크로 바이 공동 배양을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 중요한 문제와 잠재적 인 문제를 논의하는 것은이 호스트 마이크로 바이 옴 공동 문화 (p)의 폭 넓은 응용 프로그램에 대해 고려해야 할rotocol.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>Warm it up at 37 &amp;deg;C in a water bath.</td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS broth</td><td>BD</td><td>288120</td><td>Run autoclave at 121 &amp;deg;C for 15 min.</td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (w/w), PDMS : cureing agent</td></tr><tr><td>Caco-2BBE human colorectal carcinoma line</td><td>Harvard Digestive Disease Center</td><td></td><td>Human colorectal adenocarcinoma&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heat-inactivated FBS</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20% (v/v) in DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin-glutamine</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1/100 dilution in DMEM</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Nuclei staining</td></tr><tr><td>Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>F-actin staining</td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 tension system</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency)</td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging, DIC</td></tr><tr><td>Scanning confocal microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging, Fluorescence</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>Surface activation of the gut-chip</td></tr><tr><td>Type I collagen&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>Extracellular matrix component for cell culture into the chip</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Extracellular matrix component for cell culture into the chip</td></tr><tr><td>1 ml disposable syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Cell and media injection stuff</td></tr><tr><td>25 G 5/8 needle</td><td>BD</td><td>329651</td><td>Cell and media injection stuff</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>BS-8000</td><td>Injection equipment into the chip</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>A formulation of 8 different commensal gut microbes</td></tr><tr><td>Reinforced Clostridial Medium</td><td>BD</td><td>218081</td><td>Anaerobic bacteria culture medium</td></tr><tr><td>GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator</td><td>BD</td><td>260001</td><td>Anaerobic gas generating sachet&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>157-4-100</td><td>Fixing the cells for staining</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Permeabilizing the cells</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Blocking agent for staining of the cells</td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td>Plasma generator for fabrication of the chip</td></tr><tr><td>Steriflip&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Degasing the complete culture medium</td></tr><tr><td>Disposable hemocytometer</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>For manual cell counting</td></tr></tbody></table>

co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device

여기서는 인간 소화관 온 칩 microphysiological 장치 microengineered 장내 융모와 멀티 종 장기적 공 배양 인간 소화관 마이크로 바이을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 우리는 생리 기계적 변형 및 유체 전단 흐름이 지속적으로 연동 운동을 모방 적용되는 미세 유체 장치에서 장 루멘 - 모세관 조직 인터페이스를 요점을 되풀이. 루멘 마이크로 채널에서, 인간의 장내 상피 카코이 세포는 &#39;무균&#39;융모 상피 세포를 형성하고 소장 융모를 재생하는 배양. 전 배양 된 미생물 세포 호스트 미생물 생태계를 확립 내강 측에 접종한다. 미생물 세포가 융모의 선 단면에 부착 한 후, 유체 유동 및 기계적 변형은 정상 상태의 신선한 배지 끊임없이 공급되는 미세 언 바운드 박테리아 (뿐만 아니라 박테리아 폐기물) 연속 제거를 생성 재개된다. 확장 공 배양 후 F주에 ROM 일 여러 microcolonies 임의로 융모 사이에 위치한 것으로 밝혀졌다, 미생물 및 상피 세포 모두 배양 최소 1 주일 동안 생존과 기능을 유지. 더불어 배양 프로토콜은 건강과 질환 조율 인간 마이크로 바이 역할의 시험 관내 연구를 용이하게 할 수있다 각종 인간 장기에서 발견 될 수있는 다른 호스트 마이크로 바이 생태계에 대한 다목적 플랫폼을 제공하도록 구성 될 수있다.

시험 관내에서 인간의 장내 호스트 마이크로 바이 생태계를 에뮬레이트하기 위해, 인 필요는 연동 운동과 같은 역학과 유체 흐름과 같은 생리 학적 조건에서 장내 세균과 인간의 장내 상피 세포의 안정적인 장기 협력 문화를 재구성하는 실험 프로토콜을 개발. 여기서, 우리는 생체 모방 창자 - 온 - 칩 마이크로 디바이스를 이용 (그림 1A)를</str...

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Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

co-culture-living-microbiome-with-microengineered-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K 조회수.  The University of Texas at Austin.  우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다. 

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The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

연구

생체공학

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

생물학

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

면역학 및 감염병학

질 마이크로바이옴(Vaginal Microbiome)을 연구하기 위한 Microfluidic Vagina Chip

Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy reproductive system may lead to life-threatening diseases, infertility, or adverse outcomes during pregnancy. One barrier in the field is that there has been a dearth of preclinical, experimental models that faithfully mimic the physiology and pathophysiology of the FRT. Current in vitro and animal models do not fully recapitulate the hormonal changes, microaerobic conditions, and interactions with the vaginal microbiome. The advent of Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic culture technology that can mimic tissue-tissue interfaces, vascular perfusion, interstitial fluid flows, and the physical microenvironment of a major subunit of human organs can potentially serve as a solution to this problem. Recently, a human Vagina Chip that supports co-culture of human vaginal microbial consortia with primary human vaginal epithelium that is also interfaced with vaginal stroma and experiences dynamic fluid flow has been developed. This chip replicates the physiological responses of the human vagina to healthy and dysbiotic microbiomes. A detailed protocol for creating human Vagina Chips has been described in this article.

저자 스포트라이트: 질 칩을 사용한 질 마이크로바이옴 상호 작용에 대한 연구의 혁명

This article describes a protocol for creating a microfluidic vagina-on-a-chip (Vagina Chip) culture device that enables the study of human host interactions with a living vaginal microbiome under microaerophilic conditions. This chip can be used as a tool to investigate vaginal diseases as well as to develop and test potential therapeutic countermeasures.

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy ...

면역학적 통찰을 위한 향상된 Intestine-on-Chip 플랫폼

Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses

An advanced intestine-on-chip model recreating epithelial 3D organotypic villus-like and crypt-like structures has been developed. The immunocompetent model includes Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), Caco-2 intestinal epithelial cells, tissue-resident macrophages, and dendritic cells, which self-organize within the tissue, mirroring characteristics of the human intestinal mucosa. A unique aspect of this platform is its capacity to integrate circulating human primary immune cells, enhancing physiological relevance. The model is designed to investigate the intestinal immune system&#39;s response to bacterial and fungal colonization and infection. Due to its enlarged cavity size, the model offers diverse functional readouts such as permeation assays, cytokine release, and immune cell infiltration, and is compatible with immunofluorescence measurement of 3D structures formed by the epithelial cell layer. It hereby provides comprehensive insights into cell differentiation and function. The intestine-on-chip platform has demonstrated its potential in elucidating complex interactions between surrogates of a living microbiota and human host tissue within a microphysiological perfused biochip platform.

저자 스포트라이트: 감염성 질환 연구를 위한 면역 역량 있는 장기 칩 모델 개발

Our detailed protocol outlines the creation and use of the advanced intestine-on-chip model, which simulates human intestinal mucosa with 3D structures and various cell types, enabling in-depth analysis of immune responses and cellular functions in response to microbial colonization.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

An advanced intestine-on-chip model recreating epithelial 3D organotypic villus-like and crypt-like structures has been developed. The immunocompetent ...

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

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멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

인간의 본질적인 Microbiota 공부 기술을 경작 하는 체 외에서 고급 적용

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

호스트-미생물군유병 상호 분석을 위한 장 내 장관 장기 배양 시스템

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

인간 Vagina-on-a-Chip에서 건강하고 dysbiotic 질 미세환경 모델링

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델