이것은 마이크로 머신, 접착제 비닐 레이어 및 진피 구획 생성을위한 병렬 흐름 방법론을 사용하여 3D 스킨 온 칩을 모델링하기위한 새로운 리소그래피프리 프로토콜입니다. 마이크로머신드 비닐은 PDMS 및 기존 리소그래피 접근법의 몇 가지 한계를 극복하면서 장치의 레이아웃에서 제조 공정과 다기능성을 보다 단순하게 제공합니다. 이 다층 스킨 온 -a-칩은 낮은 비용으로 높은 처리량 스크리닝을 허용하고 여러 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있기 때문에 약물 및 화장품 테스트 접근 방식에 사용할 수 있습니다.
먼저 캔버스 형제 의 작업 공간 소프트웨어를 사용하여 미세 유체 칩을 설계하십시오. 30-30센티미터 작업 공간을 만들고 칩의 다른 레이어에 대한 설계 패턴으로 채운 다음 svg 파일에 저장합니다. 30~30cm 의 비닐 시트를 잘라냅니다.
저압 접착제 매트에 붙이고 필요에 따라 모든 기포를 제거하십시오. USB 드라이브를 사용하여 svg 파일을 가장자리 플로터에 업로드하고 절삭 매개변수를 레벨 0에서 절삭 압력, 레벨 3에서 블레이드 절단 및 절삭 속도에 대한 레벨 1로 설정합니다. 매개 변수가 설정되면 접착제 매트를 비닐로 플로터에 넣고 95 마이크로미터 두께의 비닐에서 채널 패턴을 절단하는 과정을 시작합니다.
적절한 조정 채널, 입구 및 콘센트에 대한 정렬기를 사용하여 전체 장치를 조립합니다. 하부 채널을 조립하기 위한 해당 마이크로머신 설계로 비닐 레이어를 쌓아 서, 하단 레이어의 커버 테이프를 유지하여 정렬기에 달라붙지 않도록 합니다. 잘라 내어 입구를 덮지 않고 하부 채널 위에 폴리카보네이트 다공성 멤브레인을 놓습니다.
상부 챔버 디자인으로 10 개의 비닐 레이어를 추가하고 양면 테이프 최종 레이어를 위에 고정시하십시오. 유리 슬라이드에 붙이기 위해 정렬기에서 칩을 제거합니다. 양면 테이프 비닐 레이어 위에 2mm 두께의 PDMS 시트를 놓습니다.
칩이 완전히 방수되었는지 확인하려면 밤새 칩 위에 무게를 둡니다. 다음 날, 5 분 동안 70 %에탄올로 세척하여 칩을 살균한 다음 증류수로 세척합니다. 펌프 1개를 연결하고 2개를 상부 챔버 입구 에 각각 연결및 상부 챔버 입구 2개에 각각 연결한다.
펌프 3을 하부 챔버 입구에 연결한 다음 상부 챔버 및 하부 챔버 콘센트를 폐수 욕조에 연결합니다. PTFE 튜브와 18게이지 스테인리스 스틸 커넥터를 사용하여 각 인렛에 주사기를 연결합니다. 분당 50 마이크로리터에서 하부 챔버 입구를 통해 3 개의 펌프 PBS를 펌프하고, 분당 100 마이크로 리터에서 상부 챔버 입구 2 개를 통해 펌프 2를 펌핑합니다.
그런 다음, 피브리노겐 프리 젤로 주사기를 적재하고 즉시 펌프 하나에 넣고 분당 200 마이크로리터로 실행합니다. 사전 젤이 상부 챔버 콘센트를 종료하면, 튜브를 제거하지 않고, 1 과 2 펌프를 중지, 10 분 동안 섭씨 37도에서 젤링을 허용칩을 둡니다. 겔화 후, 상부 챔버 입구를 캡으로 하나씩 차단하고, 상층실 입구를 통해 배양 배지를 펌핑하여 2개의 상부 챔버 입구를 통해 펌프 3개로 밤새 시간당 50 마이크로리터에서 펌프를 펌핑한다.
진피 구획의 생성 후 24시간, 인간 1차 섬유아세포 세포가 어셈블리에 퍼지는지 확인한 다음, 1분 동안 분당 40 마이크로리터에서 2개의 상부 채널 입구를 통해 밀리리터당 6개의 HKC에 5회 10을 도입한다. 세포 부착의 경우, 습도 포화 인큐베이터에 섭씨 37도에 칩을 하룻밤 누를 수 있습니다. 분당 50 마이크로리터에서 하부 챔버 입구를 통해서만 3개의 펌프로 신선한 배양 배지를 펌핑하십시오.
대표적인 분석에서, 어셈블리의 상부 챔버를 따라 하이드로겔의 높이가 표시됩니다. 550 마이크로미터의 평균 높이는 희생 PBS 및 프리 젤에 대해 분당 100 및 200 마이크로리터의 유량으로 젤의 작동을 위해 각각 최적이었습니다. 하부 채널을 통해 PBS를 플러시하지 못하면 겔의 이론적 높이와 측정된 1개 사이의 불일치로 이어졌으며, 병렬 유동 프로토콜의 개시로부터 24시간 후 40%의 차이로, 인간 1차 섬유아세포는 어셈블리의 상부 챔버에서 피브린 젤에 성공적으로 퍼지는 것으로 밝혀졌다. 그 다음에, 녹색 형광 단백질 표현 HKC는 하이드로겔의 위에 효과적으로 종자될 수 있었습니다.
HKCS가 퇴적물을 할 수 있도록 하룻밤 동안 시스템을 닫지 않고 튜브를 제거하면 균일하지 않은 셀 의 단일 레이어가 발생했습니다. 미세 유체 칩에서 미분화 된 피부 모델의 3D 공초점 분석은 명확하게 하단에 내장 된 섬유 아세포에서 상단에 있는 HKC를 분리 하는 하이드로겔의 표면을 보여주었다. 생성된 피부는 성숙하고 분화된 표피를 얻기 위해 공기/액체 인터페이스에 노출될 수 있으며, 여러 진피 및 표피 마커를 사용하여 더욱 특징지어질 수 있다.
이 기술은 더 빠르고 저렴한 장치 제조를 허용하고, 마이크로 유체를 사용하여 다층 피부의 생성을 허용하여 약물 및 화장품 테스트에 보다 현실적인 접근 방식을 제공합니다.
