살아있는 바이오 뱅크의 창조와 유지 보수는 우리가 어떻게 하는지. 소개. 전통적인 biobanks는 일반적으로 비 실행 가능한 조직 및 혈액 견본을 포함합니다. 암 환자 집단의 다양성을 적절히 반영하고 유전 및 조직학적 분석을 허용함에도 불구하고 치료 전략을 평가하는 전임상 분석에는 적합하지 않습니다.
또한 환자 파생 모델을 통합하는 바이오 뱅크는 이러한 한계를 극복합니다. 따라서 정밀 의학을 위한 기능 적 테스트를 가능하게 합니다. 샘플 수집.
대장암과 췌장암의 바이오뱅킹을 위해, 입증된 진단과 충분한 종양 크기로 케이스를 선출하는 것은 필수입니다. 수술이 시작되기 전에, 분리 된 주사기를 사용하여 20ml의 혈액과 혈청 모노벳으로 추가 7.5ml를 그립니다. 혈청 처리 및 PBL 격리.
1, 128 RCF에서 128 RCF에서 4도에서 15분 동안 원심 분리 후 혈청은 미리 표지된 극저온튜브에서 알리인용되고 액체 질소에 직접 침수된다. 헤파린화 혈액은 폴리 프로필렌 튜브로 옮겨지고 15ml PBS로 희석됩니다. 세로지학적 파이펫을 사용하여 15ml 판콜과 천천히 혼합물을 밑아래 놓습니다.
밀도 그라데이션 원심 분리 후, 단핵 세포를 포함하는 불투명층은 세로지학적 파이펫으로 채택되어 새로운 PP 튜브로 이송된다. PBS로 세척하고 원심분리에 의해 단일 핵 세포를 펠릿화 한 후, 상체를 폐기하고 냉동고 배지에서 펠릿을 다시 중단하고 미리 표시된 냉동고로 분배하십시오. 튜브를 분당 1도로 느린 동결에 적합한 냉각 용기로 옮기고 임시 80도에서 임시 보관하십시오.
조직 처리. 조직 표본이 외과 의사에 의해 절제되는 즉시, 적합한 용기에 넣어. 조직이 포르말린으로 덮여있는 모든 상황에서 피하십시오.
절제 마진의 병리학적 평가와 관련이 없는 종양 물질의 절제를 위한 병리학으로 가능한 한 빨리 운반한다. 종양 조각은 가능한 한 무균으로 처리되어야한다. 또한 건강한 조직의 표본을 얻고 얼음에 조직 저장 용액으로 미리 채워진 별도의 튜브에 둘 다 배치하십시오.
멸균 조건하에서 조직 처리를 시작하기 위해 즉시 실험실로 돌아갑니다. 티슈 피스는 탈수를 피하기 위해 조직 저장 솔루션으로 채워진 멸균 플라스틱 접시에 배치됩니다. 우선, 획득한 조직 표본의 크기에 따라 스냅 동결을 위해 하나 이상의 핀헤드 크기의 조각을 소비한다.
기본 조직을 미리 표기된 냉동튜브에 넣고 액체 질소에 즉시 담급됩니다. 나머지 조직을 3x3단위로 3분의 3의 큐브로 자른다. 괴사 조직이 완전히 해부되어야하지만 폐기해서는 안된다는 것을 고려하십시오.
큐브를 네 배로 배열하여 중요한 저장을 위한 알리쿼트 수를 결정합니다. 충분한 수의 냉동고에 라벨을 부착하고 각각 1.5ml의 냉동고 배지로 미리 채웁니다. 냉동고 배지의 DMSO는 세포 독성이기 때문에 중단 없이 다음 단계를 신속하고 수행하였다.
메스 블레이드를 사용하여 튜브 당 4 개의 티슈 조각을 떠서 보냅니다. 모든 조각이 튜브 바닥에 이상적으로 냉동고 매체에 완전히 침수되어 있는지 확인하고 동결 용기를 사용하여 튜브를 빠르게 동결하십시오. 건강한 표본과 같은 방식으로 진행하십시오.
장기 보관을 위해 모든 알리따옴표를 액체 질소 탱크에 보관하십시오. 세포 배양. 메스 블레이드를 가능한 한 작게 괴사 부위를 포함하는 종양 조직 처리의 유적을 갈아냅니다.
멸균 PP 튜브의 상단에 셀 스트레이너를 놓고 세포 스트레이너를 통과하기 위해 혈청 피펫으로 서스펜션을 흡인합니다. 단일 사용 주사기의 플런저를 사용하여 세포 스트레이너를 통해 남아 있는 조직을 눌러 단일 세포 현탁액을 생성합니다. PBS로 헹구고 재료가 남지 않은 때까지 다음 단계를 반복합니다.
세포 스트레이너를 제거하고 서스펜션을 180 RCF에서 7분간 원심분리합니다. 그 동안, 상이한 미디어 조성물로 콜라겐 프리 코팅 6웰 플레이트를 준비하여 종양이 나올 확률을 높입니다. 상체를 버리고 PBS에서 펠릿을 다시 중단하고 우물 당 500 마이크로 리터를 분배하십시오.
그 후, 표준 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 환자 유래 제노이식의 생성. 면역 손상된 마우스에서 환자 유래 제노이식의 생성을 위해, 동물은 특정 병원체 없는 환경에서 보관되어야 합니다.
스크럽, 앞치마, 얼굴 마스크, 헤어 커버 및 장갑으로 구성된 개인 보호 장비를 착용하십시오. 작업 공간을 정리한 후 액체 질소 용기에서 욕망 종양 표본을 가져 가라. 신선한 PP 튜브에 35ml PBS를 채운 다음 해동 공정을 조심스럽게 씻고 저온 튜브를 위아래로 기울이십시오.
내용이 슬러시가되면 PBS에 부어 종양 조각을 헹구습니다. 대부분의 PBS를 버리고 큐브를 뚜껑에 비웁습니다. 멸균 플라스틱 접시를 얼음 팩에 넣고 100 마이크로리터 마트리겔을 추가합니다.
집게를 사용하여 종양 조각을 마모젤에 배치하고 종양을 10 분 동안 배양하십시오. 그 동안, 두 마리의 마우스를 마취한다. 동물의 발을 꼬집어 마취의 깊이를 확인하십시오.
모든 움직임은 부족한 마취를 나타내며 대기 또는 추가 적인 치료가 필요합니다. 눈 연고를 적용, 목에 마우스를 꼬집어 피하 마이크로 칩을 주입. 다음 단계를 병렬로 수행합니다.
마우스의 측면을 소독하고 스트라이프 메젠바움 가위로 작은 피부 절개를 하고 무딘 준비로 피하 포켓을 형성한다. 해부학 적 집게를 사용하여 종양 조각을 삽입하십시오. 조각이 피부 포켓의 후면 끝에 놓여 있는지 확인하십시오.
나머지 마트리겔을 흡인하고 네 개의 주머니에 동등하게 분배합니다. 젤의 경화를 기다리고 바늘로 종양 조각을 손상시키지 않고 단일 버튼 봉합사로 피부를 닫습니다. 매듭 위에 가능한 한 짧게 스레드를 잘라 봉합사의 고개를 끄덕 방지하기 위해 스프레이 드레싱을 적용합니다.
마이크로칩을 스캔하고 동물의 나중에 식별을 위해 데이터베이스에 종양 정보를 추가합니다. 신선한 침구와 중첩 재료로 케이지를 준비하고, 적외선 램프 앞에 마우스를 배치하고 마취가 가라 앉을 때까지 동물을 모니터링하십시오. PDX의 농장.
PDX 종양이 필요한 크기에 도달하면 마우스는 CO2 질식 및 후속 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. 조심스럽게 종양에서 피부를 해부하고 PDX를 완전히 제거합니다. 대표적인 결과.
멸균 플라스틱 접시에 종양을 놓고 멸균 메스 블레이드를 사용하여 추가 처리를 하십시오. 슬라이스로 구멍을 잘라, 조직학 카세트에 배치하고 나중에 조직학적 평가를위한 파라핀 임베디드 표본을 생성하기 위해 포르말린에 잠급. 종양의 나머지 부분을 조직 저장 용액으로 옮기고 바이오 뱅크를 위해 새로운 생체 보존 및 스냅 냉동 표본을 만듭니다.
또한, PDX 종양의 유해를 장 세포 배양과 유사하게 사용하여 이차 종양 세포주를 확립한다. 추가 PDX를 생성하려면, 이전에 표시된 대로 새로운 수신자 마우스로 Matrigel을 가진 2개 이상의 종양 조각을 전송합니다. 결론. 제시된 프로토콜을 통해, 우리는 지금까지 9개의 췌장 및 100개 이상의 대장 환자 유래 암 세포주뿐만 아니라 19개의 췌장 및 150개 이상의 colorectal PDX 모형을 설치하는 데 성공했습니다.
